Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

इस काम को INSERM, Université कोटे डी अज़ूर द्वारा समर्थित किया गया था, और भविष्य Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01) के लिए निवेश के माध्यम से फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR) से अनुदान द्वारा, कार्यक्रम UCA जेडी (ANR-15-IDEX-01) अकादमी के माध्यम से 2 "सिस्टेम्स कॉम्प्लेक्स" और अकादमी 4 "कॉम्प्लेक्स एट विविधता du vivant", Fondation डालना ला Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), और युवा अन्वेषक कार्यक्रम जेजी (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) । हम Conseil Départemental des Alpes-Maritimes और Région PACA द्वारा वित्त पोषित C3M की इमेजिंग कोर सुविधा का भी शुक्रिया अदा करते हैं, और जो आईबीएसए माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्लेटफॉर्म कोटे डी अज़ूर (MICA) द्वारा भी समर्थित है। हम ऊतक तैयार करने में तकनीकी मदद के लिए मैरियन डसॉट का शुक्रिया अदा करते हैं। हम पांडुलिपि के सबूत पढ़ने के लिए एबी Cuttriss, UCA अंतरराष्ट्रीय वैज्ञानिक दृश्यता, धन्यवाद.

इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था और सभी माउस और मानव सफेद एडीपोज ऊतक डिपो के लिए मान्य है। मानव और माउस आदिपोस ऊतकों को यूरोपीय कानूनों के अनुसार एकत्र किया गया था और फ्रांसीसी और स्वीडिश नैतिक समित?...

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	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. 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C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

रोग प्रगति के दौरान आदिपोज ऊतक के भीतर होने वाले संशोधन, जैसे मोटापे की, विकृति के पीछे तंत्र की समझ के लिए मौलिक है। एडिपोस टिश्यू में इस तरह के तंत्र को उजागर करने वाले अग्रणी अध्ययन वैश्विक दृष्टिकोण...

मोटापा आदिपोस ऊतक द्रव्यमान में वृद्धि की विशेषता है और दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा बन गया है, यह देखते हुए कि मोटापे के साथ लोगों को हृदय रोग, टाइप-2 मधुमेह, जिगर की बीमारियों और कुछ कैंसर के विकास का खतरा बढ़ गया है ।
एडीपोज ऊतक का एक मौलिक शारीरिक कार्य पूरे शरीर के ग्लूकोज और लिपिड होयोस्टेसिस1,2को मिलाना है। भोजन अवधि के दौरान, एडिपोसाइट्स (यानी, एडीपोज ऊतक की मुख्य कोशिकाएं) भोजन द्वारा प्रदान किए गए ग्लूकोज और लिपिड की अधिकता को ट्राइग्लिसराइड्स में स्टोर करते हैं। उपवास के दौरान, एडिपोसाइट्स शरीर की ऊर्जा मांग को बनाए रखने के लिए ट्राइग्लिसराइड्स को गैर-एस्टरिफाइड फैटी एसिड और ग्लाइसरोल में तोड़ देते हैं। मोटापे के विकास के दौरान, एडीपोज ऊतक अपनी भंडारण क्षमता को बढ़ाने के लिए, एडीपोसाइट्स1के आकार (हाइपरट्रोफिया) और/या संख्या (हाइपरप्लासिया) को बढ़ाकर विस्तार करते हैं । जब आदिपोस ऊतक का विस्तार अपनी सीमा तक पहुंच जाता है, तो रोगियों के बीच एक निरंतर अत्यधिक चर, शेष लिपिड मांसपेशियों और यकृत3,,4सहित अन्य मेटाबोलिक अंगों में जमा हो जाते हैं, जिससे उनकी कार्यात्मक विफलता होती है और मोटापे से संबंधित कार्डियो-मेटाबोलिक जटिलताओं की शुरुआत होती है1,,5। इसलिए, तंत्र है कि वसा ऊतक विस्तार को नियंत्रित की पहचान एक प्रमुख नैदानिक चुनौती है ।
मोटापे के दौरान आदिपोस ऊतकों के भीतर प्रलेखित रूपात्मक संशोधन इसके रोग रोग से जुड़े होते हैं। एडिपोज टिश्यू के टिश्यू ऑर्गेनाइजेशन का वर्णन करने के लिए कई धुंधला प्रक्रियाओं का उपयोग किया गया है, जिनमें ऐक्टिन6,वैस्कुलर मार्कर7,लिपिड-ड्रॉपलेट मार्कर8और विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका मार्कर9,,10शामिल हैं। हालांकि, एडीपोसाइट्स (50 से 200 माइक्रोन)11के विशाल व्यास के कारण, मोटापे के दौरान देखे गए नाटकीय संरचनात्मक एटी परिवर्तनों का सही विश्लेषण करने के लिए पूरे ऊतक के एक बड़े हिस्से को तीन आयामों में विश्लेषण करना आवश्यक है। हालांकि, क्योंकि प्रकाश एक अपारदर्शी ऊतक में प्रवेश नहीं करता है, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक बड़े ऊतक नमूनों के भीतर 3 डी में इमेजिंग संभव नहीं है। उन्हें पारदर्शी बनाने के लिए ऊतक समाशोधन के तरीकों को साहित्य में सूचित किया गया है (एक समीक्षा के लिए,12देखें) एक ऊतकों को साफ करने और गहराई से प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, पूरे ऊतक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी। ये विधियां स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों में 3 डी सेलुलर संगठन का आकलन करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं। वर्णित विधियों में से प्रत्येक के फायदे और कमियां हैं, और इसलिए अध्ययन किए गए ऊतकों के आधार पर सावधानीपूर्वक चयनित होने की आवश्यकता है (समीक्षा के लिए,13देखें)। वास्तव में, कुछ दृष्टिकोणों के लिए लंबी इनक्यूबेशन अवधि और / या उन सामग्रियों या यौगिकों के उपयोग की आवश्यकता होती है जो या तो महंगी, विषाक्त या14,15 , 16,17,,,18,,,19प्राप्त करने में कठिन होती हैं ।18 20 ऊतकों को साफ करने के लिए वर्नर स्पलटेहोल्ज़ द्वारा एक शताब्दी पहले उपयोग किए गए पहले यौगिकों में से एक का लाभ उठाते हुए, हमने एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और सस्ती प्रोटोकॉल स्थापित किया है जो रासायनिक हुड, तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर और एक कॉन्डोकल माइक्रोस्कोप सहित विशिष्ट उपकरणों के साथ किसी भी प्रयोगशाला में सभी माउस और मानव एडिपोस ऊतक डिपो के समाशोधन के लिए बहुत अच्छीतरहसे अनुकूलित है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

मोटापा दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा है जो हृदय रोगों, टाइप-2 मधुमेह और यकृत रोगों को विकसित करने के लिए जोखिम को बढ़ाता है। मोटापा एडीपोसाइट हाइपरप्लासिया और/या हाइपरट्रोफिया के कारण एडीपोज ऊतक (एटी) द्रव्यमान में वृद्धि की विशेषता है, जिससे इसकी त्रि-आयामी संरचना का गहरा पुन: तैयार किया जाता है । दरअसल, मोटापे के दौरान विस्तार करने के लिए एटी की अधिकतम क्षमता मोटापे से जुड़ी विकृतियों के विकास के लिए निर्णायक है। यह एटी विस्तार ऊर्जा के सेवन की अधिकता के अनुकूलन को सक्षम करने और मांसपेशियों और जिगर जैसे अन्य मेटाबोलिक अंगों के लिए हानिकारक लिपिड स्पिलओवर से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण होमोस्टिटिक तंत्र है। इसलिए, एटी विस्तार की विफलता की ओर ले जाने वाले संरचनात्मक रीमॉडलिंग को समझना उच्च नैदानिक प्रयोज्यता के साथ एक बुनियादी सवाल है। इस लेख में, हम एक सरल और तेजी से समाशोधन विधि का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा माउस और मानव सफेद एडीपोज ऊतक की आकृति विज्ञान का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह अनुकूलित एटी क्लियरिंग विधि आसानी से रासायनिक हुड, तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से लैस किसी भी मानक प्रयोगशाला में आसानी से किया जाता है। इसके अलावा, इस्तेमाल किए गए रासायनिक यौगिक आसानी से उपलब्ध हैं। महत्वपूर्ण बात, यह विधि विशेष रूप से एडिपोसाइट्स, न्यूरोनल और संवहनी नेटवर्क, और जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के वितरण की कल्पना करने के लिए विभिन्न मार्कर को धुंधला करके 3 डी एट संरचना को हल करने की अनुमति देती है।

यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके और चित्र 1 में संक्षेप में, हम क्रमशः चित्र 2ए और चित्रा 2B में प्रस्तुत मानव और माउस सफेद एडीपोज ऊतक को दाग और ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट करने में सक्?...

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

यहां, हम फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा वैकुलेचर, नाभिक, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और लिपिड-ड्रॉपलेट कोट प्रोटीन की कल्पना करने के लिए मार्कर के संयोजन का उपयोग करके माउस और मानव सफेद आदिपोज ऊतक दोनों की 3डी संरचना को हल करने के लिए एक सरल, सस्ती और तेजी से समाशोधन विधि का वर्णन करते हैं।

मिथाइल्सालिसिलेट क्लियरिंग और 3डी इमेजिंग द्वारा एडिपोस टिश्यू स्ट्रक्चर की खोज

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

ये प्रोटोकॉल माउस पर बहुत बड़े मानव की त्रि-आयामी संरचना के विश्लेषण की अनुमति देता है ऊतक बैले माइक्रोस्कोपी। आदिपोस ऊतक संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ रोग रोग रोग के संबंध को सुविधाजनक बनाता है। यह समाशोधन प्रक्रिया बहुत सरल है, बहुत अच्छी तरह से गर्म चूहों पर मानव समाशोधन के लिए अनुकूलित ऊतक और इस तरह के इथेनॉल या मिथाइल सालीलेट के रूप में कम विषाक्त विलायक का उपयोग अंय स्पष्ट प्रोटोकॉल की तुलना में ।एक रासायनिक हुड के तहत अधिमानतः 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में पीबीएस में 4% बिजली फॉर्मलडिहाइड के कम से कम 10 मिलीलीटर में काटा माउस या मानव सफेद आदिपोस ऊतक विसर्जित करके शुरू करें। रात चार डिग्री सेल्सियस पर एक रोलिंग प्लेट के लिए ट्यूब स्थानांतरित करने से पहले एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक रोलिंग प्लेट पर ऊतक हिला । अगली सुबह कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए PBS के 10 मिलीलीटर में तय सफेद आदिपोस ऊतक कुल्ला और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए ऊतक हस्तांतरण एक घंटे के लिए PBS में 0.3% ग्लाइसिन के 10 मिलीलीटर युक्त एक घंटे के लिए एक घंटे के लिए एक घंटे के लिए एक कक्ष शेखर पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन प्रति मिनट ।जब शेष मुक्त एल्डिहाइड समूहों को बुझा दिया गया है, तो ऊतक को 15 मिलीलीटर ट्यूब में विसर्जित करें जिसमें पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के 10 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाने के साथ दो घंटे इनक्यूबेशन के लिए शामिल हैं। इनक्यूबेशन के अंत में ०.२% ट्राइटन एक्स-१०० और 20% DMSO के 10 मिलीलीटर के साथ ऊतक का इलाज ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए रात भर । अगली सुबह एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक विसर्जित ०.१% ट्वीन 20, ०.१% ट्राइटन एक्स-१००, ०.१% deoxycholate और 20% DMSO PBS में एक कम से 24 घंटे के लिए मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन ।इनक्यूबेशन के अंत में, एक घंटे के लिए प्रति मिनट १०० क्रांतियों पर एक कक्षीय शेखर पर PBS में ०.२% Triton X-१०० के 10 मिलीलीटर के साथ ऊतक कुल्ला । इसके बाद 02% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए में 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलीलीटर में विसर्जन किया गया। सफेद एडीपोज ऊतक के धुंधला होने के लिए।ऊतक को 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए के 300 माइक्रोलीटर में स्थानांतरित करें, 1.5 मिलीलीटर माइक्रो ट्यूब में ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पूरक है इसे एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से बचाएं और ट्यूब को 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में रखें। एक दो दिन के लिए कक्षीय शेखर में ट्यूब रखें इनक्यूबेशन मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर । इनक्यूबेशन के अंत में ०.२% ट्राइटन एक्स-१००, 10% DMSO और 3% PBS में 3% बीएसए के 10 मिलीलीटर में दो बार ऊतक कुल्ला मिलाते हुए और प्रकाश से सुरक्षा के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर पांच घंटे के लिए ।दूसरे कुल्ला के बाद ताजा ०.२% Triton X-१००, 10% DMSO और 3% बीएसए और PBS के 16 से ४८ घंटे के लिए मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर के 10 मिलीलीटर में ऊतक धोने, फिर ऊतक को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए के 300 माइक्रोलीटर शामिल हैं, जो उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पूरक हैं और एल्यूमीनियम फॉयल का उपयोग करके ट्यूब को प्रकाश से बचाते हैं। एक शेखर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक दो दिन इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक ०.२% ट्राइटन एक्स-१००, 10% DMSO और 3% PBS में 3% बीएसए के 10 मिलीलीटर में दो बार धोने के लिए पांच घंटे के लिए प्रकाश से संरक्षित मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर । दूसरे धोने के बाद, ऊतक को एक ट्यूब में कुल्ला करें जिसमें 10 मिलीलीटर ताजा 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए पीबीएस में 16 से 48 घंटे के लिए मिलाते हुए और प्रकाश सुरक्षा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर।इसके बाद अकेले पीबीएस के 10 मिलीलीटर में मिलाते हुए और प्रकाश सुरक्षा के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे की धुलाई की । पीबीएस धोने के अंत में सफेद एडीपोज ऊतक समाशोधन के लिए ऊतक और एक आरोही भेजने इथेनॉल एकाग्रता श्रृंखला के 10 मिलीलीटर के लिए कमरे के तापमान पर एकाग्रता के इनक्यूबेशन एक दो घंटे के लिए विसर्जित के रूप में संकेत के रूप में प्रकाश से संरक्षित मिलाते हुए । अगली सुबह एक 20 मिलीलीटर कांच की बोतल में एक प्लास्टिक की टोपी के साथ ऊतक विसर्जित एक धुएं हुड में मिथाइल सैलिसिलेट के पांच मिलीलीटर युक्त ।इस स्तर पर सफेद आदिपोस ऊतक अभी भी स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है। कंटेनर को हिलाएं इसे कम से कम दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्रकाश से बचाएं। सफेद एडीपोज टिश्यू पूरी तरह से ट्रांसप्लांट हो जाता है।दाग और साफ किए गए सफेद एडीपोज ऊतक के 3 डी कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एक धातु इमेजिंग कक्ष माउंट जो ग्लास बॉटम से लैस है और एक धुएं हुड में ऊतक को कक्ष में स्थानांतरित करता है। चैंबर को फ्रेश मिथाइल सैलिसिलेट से भरें। ऊतक को स्थिर करने के लिए एक छोटी कवर पर्ची और कक्ष को बंद करने के लिए एक बड़ी कवर पर्ची जोड़कर कक्ष की माउंटिंग को अंतिम रूप दें।पूरे एडीपोज ऊतक नमूने के कुछ घन सेंटीमीटर 3 डी नक्शे उत्पन्न करने के लिए कम आवर्धन पर ऊतक इमेजिंग के लिए एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण पर कक्ष रखें। 3डी मैप जनरेशन के बाद, 20X लंबी दूरी के वायु उद्देश्य का उपयोग करें जो उच्च आवर्धन पर ऊतक नमूने के लिए कई क्षेत्रों का चयन करने के लिए संकल्प और गहराई के बीच एक अच्छा अनुपात प्रदान करता है। सेल सेगमेंटेशन के लिए मेमोरी स्पेस को फ्री करने के लिए सॉफ्टवेयर फॉर्मेट पर 3डी स्टैक कन्वर्ट करें ।सॉफ्टवेयर के सेल मॉड्यूल खोलने से पहले। सेल डिटेक्शन सेटिंग को प्लाज्मा झिल्ली धुंधला करने के लिए बदलें और सेल परिधि को चित्रित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर के फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें। फिर थ्रेसहोल्ड सेट करें, अपेक्षित सेल आकारों की एक श्रृंखला प्रदान करें और विभाजन को चलाएं।मानव और माउस सफेद एडीपोज ऊतक पर समाशोधन के प्रभाव नग्न आंखों के साथ देखा जा सकता है। समाशोधन भी तेजी से ऊतक है कि प्राप्त करने में सक्षम है की छवि गहराई में सुधार । और 4X आवर्धन से पूरे ऊतक 3 डी इमेजिंग और 3 डी मानचित्र पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है।3 डी मैपिंग आगे ब्याज के विभिन्न क्षेत्रों के चयन के लिए एक 20X आवर्धन पर दो मिलीमीटर की गहराई तक अधिग्रहीत करने में सक्षम बनाता है । लिपिड बूंदों और एडिपोसाइट्स के विशिष्ट धुंधला क्रमशः पेरिलिपिन और एंटी-ग्लूट4 एंटीबॉडी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। रक्त वाहिकाओं या तो CD31 एंटीबॉडी या लेक्टिन डाइलाइट ६४९ के नसों में इंजेक्शन का उपयोग कर शीघ्र ही बलिदान से पहले पता लगाया जा सकता है ।एंटी सीडी 301 फाइकोरीथ्रिन एंटीबॉडी और एंटी टीसीआर बीटा पैसिफिक ब्लू एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर मैक्रोफेज और टी-सेल्स की कल्पना की जा सकती है। एंटी टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर परिधीय तंत्रिका नेटवर्क का पता लगाया जा सकता है। इन लेबलिंग का उपयोग करना आदिपोसाइट्स के मतलब आकार और आकार वितरण और आदिपोज़ ऊतक के भीतर रक्त वाहिका नेटवर्क घनत्व तो निर्धारित किया जा सकता है ।व्यवसाय के समय का पालन करना महत्वपूर्ण है क्योंकि खराब नमूना तैयारी के परिणामस्वरूप अच्छी छवि गुणवत्ता नहीं होगी। इस प्रोटोकॉल को उन्नत इमेजिंग सिस्टम के साथ जोड़ा जा सकता है या पोस्ट-प्रोसेसिंग इमेज एनालिसिस फ्रीवेयर के साथ जोड़ा जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

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अधिनियम-सफ़ाई: जैविक ऊतक समाशोधन और मात्रा इमेजिंग के लिए immunolabeling के तरीके

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

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Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

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Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए संयंत्र ऊतकों का ऑप्टिकल समाशोधन

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

ऊतक डिस्सोसिएटर का उपयोग करके मुराइन व्हाइट एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश का अर्ध-स्वचालित अलगाव

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