Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da INSERM, Università della Costa Azzurra, e con sovvenzioni dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso gli investimenti per il futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), il programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) tramite Academy 2 "Systèmes Complexes" e Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical ('quipe FRM DEQ201839587), e il Programma Giovani Investigatori a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-(ANSA) - EREARON. Ringraziamo anche l'Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, e che è supportato anche dalla piattaforma IBISA Microscopy and Imaging C'tzur (MICA). Ringraziamo Marion Dussot per l'aiuto tecnico nella preparazione dei tessuti. Ringraziamo Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, per la lettura a prova del manoscritto.

Questo protocollo è stato testato ed è convalidato per tutti i depositi di tessuto adiposo bianco e topo umano. I tessuti adiposo umano e topo sono stati raccolti di conseguenza alle leggi europee e approvati dai comitati etici francesi e svedesi.
1. Fissazione del tessuto adiposo bianco e topo umano
<ol><li>Immergere il topo raccolto o i tessuti adiposa bianchi umani in almeno 10 mL di PBS contenenti 4% di paraformaldeide (PFA) in un tubo di plastica da 15 mL.</li>
	<li>Agitare il tubo di...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

Le modifiche che si verificano all'interno del tessuto adiposo nel corso della progressione patologica, come quella dell'obesità, sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi alla base della patologia. Studi pionieristici che hanno rivelato tali meccanismi nel tessuto adiposo sono stati basati su approcci globali come la proteomica del tessuto adiposointero 21, la citometria di flusso22,23e la trascrittomica24</s...

L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa dei tessuti adiposa ed è diventata un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo, dato che le persone con obesità hanno aumentato il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2, malattie epatiche e alcuni tumori.
Una funzione fisiologica fondamentale del tessuto adiposo è quella di modulare il glucosio di tutto il corpo e l'omeostasilipido 1,2. Durante il periodo di alimentazione, gli adipociti (cioè le cellule principali del tessuto adiposo) immagazzinano l'eccesso di glucosio e lipidi forniti da un pasto in trigliceridi. Durante il digiuno, gli adipociti scomporsino i trigliceridi in acidi grassi non esterificati e glicerolo per sostenere la domanda di energia del corpo. Durante lo sviluppo dell'obesità, il tessuto adiposo si espande aumentando le dimensioni (ipertrofia) e/o il numero (iperplasia) degli adipociti1, per aumentare la loro capacità di stoccaggio. Quando l'espansione del tessuto adiposo raggiunge il suo limite, una costante altamente variabile tra i pazienti, i lipidi rimanenti si accumulano in altri organi metabolici tra cui muscoli efegato 3,4, portando al loro fallimento funzionale e avviando complicazioni cardio-metaboliche legate all'obesità1,5. Pertanto, identificare i meccanismi che regolano l'espansione del tessuto adiposo è una sfida clinica chiave.
Le modifiche morfologiche documentate all'interno dei tessuti adiposo durante l'obesità sono legate alla sua disfunzione patologica. Diverse procedure di colorazione sono state utilizzate per descrivere l'organizzazione dei tessuti del tessuto adiposo, tra cui actin6, marcatori vascolari7, marcatori lipidico-droplet8e specifici marcatori di cellule immunitarie9,10. Tuttavia, a causa dell'enorme diametro degli adipociti (da 50 a 200 m)11, è essenziale analizzare gran parte dell'intero tessuto in tre dimensioni al fine di analizzare con precisione i drammatici cambiamenti strutturali di AT osservati durante l'obesità. Tuttavia, poiché la luce non penetra in un tessuto opaco, l'imaging in 3D all'interno di un grande campione di tessuto utilizzando la microscopia a fluorescenza non è possibile. I metodi di compensazione dei tessuti per renderli trasparenti sono stati riportati nella letteratura (per una revisione,vedi 12) che consente di eliminare i tessuti e di eseguire una microscopia a fluorescenza dell'intero tessuto in profondità. Questi metodi offrono opportunità senza precedenti per valutare l'organizzazione cellulare 3D in tessuti sani e mationali. Ciascuno dei metodi descritti presenta vantaggi e svantaggi e pertanto deve essere selezionato attentamente a seconda del tessuto studiato (per una revisione, vedere13). Infatti, alcuni approcci richiedono un lungo periodo di incubazione e/o l'uso di materiali o composti che sono costosi, tossici o difficili daottenere 14,15,16,17,18,19. Approfittando di uno dei primi composti utilizzati un secolo fa da Werner Spalteholz per ripulire i tessuti20, abbiamo istituito un protocollo user-friendly ed economico che è molto ben adattato per la pulizia di tutti i depositi di topi e tessuti adiposo umani in qualsiasi laboratorio con attrezzature tipiche tra cui una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio confocale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

L'obesità è un importante problema di salute pubblica a livello mondiale che aumenta il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2 e malattie del fegato. L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa del tessuto adiposo (AT) a causa dell'iperplasia adipocita e/o dell'ipertrofia, che porta a una profonda ristrutturazione della sua struttura tridimensionale. Infatti, la massima capacità di AT di espandersi durante l'obesità è fondamentale per lo sviluppo di patologie associate all'obesità. Questa espansione AT è un importante meccanismo omeostatico per consentire l'adattamento a un eccesso di assunzione di energia e per evitare la fuoriuscita di lipidi deleteri ad altri organi metabolici, come il muscolo e il fegato. Pertanto, comprendere il rimodellamento strutturale che porta al fallimento dell'espansione AT è una questione fondamentale con un'elevata applicabilità clinica. In questo articolo, descriviamo un metodo di compensazione semplice e veloce che viene regolarmente utilizzato nel nostro laboratorio per esplorare la morfologia del topo e del tessuto adiposo bianco umano mediante imaging fluorescente. Questo metodo di compensazione AT ottimizzato è facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio standard dotato di una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio fluorescente. Inoltre, i composti chimici utilizzati sono prontamente disponibili. È importante sottolineare che questo metodo consente di risolvere la struttura 3D AT colorando vari marcatori per visualizzare specificamente gli adidociti, le reti neuronali e vascolari e la distribuzione innata e adattiva delle cellule immunitarie.

Utilizzando la procedura descritta di seguito e riepilogata nella Figura 1, siamo stati in grado di macchiare e cancellare otticamente il tessuto adiposo bianco e umano, come illustrato nella Figura 2A e nella Figura 2B, rispettivamente. Il tessuto eliminato è stato trasferito alla camera di imaging metallico per eseguire l'imaging confocale (Figura 3A). La compensazione ha migliorato drasticamente la ...

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Qui, descriviamo un metodo semplice, economico e veloce per risolvere la struttura 3D del tessuto adiposo bianco e topo umano utilizzando una combinazione di marcatori per visualizzare vascolatura, nuclei, cellule immunitarie, neuroni e proteine del mantello di goccia lipidi mediante imaging fluorescente.

Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Questi protocolli consentono l'analisi della struttura tridimensionale di esseri umani molto grandi sulla microscopia a balletto tissutale adiposo del topo. Facilitare il collegamento della disfunzione patologica con i cambiamenti strutturali del tessuto adiposo. Questo processo di compensazione è molto semplice, molto ben adattato per liberare l'uomo sul tessuto adiposo dei topi caldi e utilizzare solventi meno tossici come l'etanolo o il salicilato di metile rispetto ad altri protocolli chiari.Inizia immergendo il topo raccolto o il tessuto adiposo bianco umano in almeno 10 millilitri di formaldeide di potenza del 4% in PBS in un tubo di plastica da 15 millilitri preferenzialmente sotto una cappa chimica. Agitare il tessuto su una piastra di rotolamento a temperatura ambiente per un'ora prima di trasferire il tubo su una piastra di rotolamento a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente sciacquare il tessuto adiposo bianco fisso in 10 millilitri di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente per rimuovere tutte le tracce di fissativo e trasferire il tessuto in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di 0,3% di glicina in PBS per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente su uno shaker orbitale a 100 giri al minuto.Una volta che i restanti gruppi di aldeidi liberi sono stati spenti, immergere il tessuto in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100 in PBS per un'incubazione di due ore con scuotimento a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione trattare il tessuto con 10 millilitri dello 0,2% Triton X-100 e del 20%DMSO con scuotimento a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 millilitri contenente 10 millilitri dello 0,1% Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% deossicholato e 20%DMSO in PBS per un'incubazione di almeno 24 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento.Alla fine dell'incubazione, sciacquare il tessuto con 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100 in PBS su uno shaker orbitale a 100 giri al minuto per un'ora. Seguito da immersione in 15 millilitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per 12 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento. Per la colorazione del tessuto adiposo bianco.Trasferire il tessuto in 300 microlitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS, integrati con gli anticorpi primari di interesse in un microtubo da 1,5 millilitri proteggerlo dalla luce con un foglio di alluminio e posizionare il tubo in un tubo Falcon da 50 millilitri. Posizionare il tubo nello shaker orbitale per un'incubazione di due giorni a 37 gradi Celsius con tremori. Al termine dell'incubazione sciacquare il tessuto due volte in 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per cinque ore a 37 gradi Celsius con scuotimento e protezione dalla luce.Dopo il secondo risciacquo lavare il tessuto in 10 millilitri di fresco 0,2%Tritone X-100, 10%DMSO e 3%BSA e PBS per 16-48 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento, quindi trasferire il tessuto in un tubo da 1,5 millilitri contenente 300 microlitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS, integrato con gli anticorpi secondari appropriati e proteggere il tubo dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Dopo un'incubazione di due giorni a 37 gradi Celsius su uno shaker, lavare il tessuto due volte in 10 millilitri dello 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per cinque ore a 37 gradi Celsius con scuotimento protetto dalla luce. Dopo il secondo lavaggio, sciacquare il tessuto in un tubo contenente 10 millilitri di fresco 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA in PBS per 16-48 ore a 37 gradi Celsius con scuotimento e protezione della luce.Seguito da un lavaggio di due ore in 10 millilitri di PBS da solo a 37 gradi Celsius con scuotimento e protezione della luce. Per la pulizia del tessuto adiposo bianco alla fine del lavaggio PBS immergere il tessuto e 10 millilitri di una serie crescente di concentrazione di etanolo di invio per un'incubazione di due ore per concentrazione a temperatura ambiente con scuotimento protetto dalla luce come indicato. La mattina dopo immergere il tessuto in una bottiglia di vetro da 20 millilitri con un cappuccio di plastica contenente cinque millilitri di salicilato di metile in un cappuccio di fumi.Il tessuto adiposo bianco è ancora chiaramente visibile in questa fase. Agitare il contenitore proteggerlo dalla luce a temperatura ambiente per almeno due ore. Il tessuto adiposo bianco diventa completamente trapiantato.Per l'imaging confocale 3D del tessuto adiposo bianco colorato e sgombrato montare una camera di imaging metallica dotata di fondo in vetro e in una cappa aspirante trasferire il tessuto alla camera. Riempire la camera con salicilato di metile fresco. Finalizzare il montaggio della camera aggiungendo una piccola scivolata di copertura per stabilizzare il tessuto e un grande slittamento di copertura per chiudere la camera.Posizionare la camera su uno stadio di microscopio confocale invertito per l'imaging tissutale a basso ingrandimento per generare alcune mappe 3D di centimetri cubi dell'intero campione di tessuto adiposo. Dopo la generazione di mappe 3D, utilizzare un obiettivo di aria a lunga distanza 20 volte che fornisce un buon rapporto tra la risoluzione e la profondità per selezionare diverse aree per il campionamento dei tessuti con un ingrandimento più elevato. Per la segmentazione delle celle convertire gli stack 3D nel formato software per liberare spazio di memoria.Prima di aprire il modulo cella del software. Modificare l'impostazione di rilevamento delle celle in colorazione della membrana plasmatica e selezionare il canale fluorescente del marcatore utilizzato per delineare la periferia cellulare. Quindi impostare le soglie, fornire un intervallo delle dimensioni delle celle previste ed eseguire la segmentazione.Gli effetti della compensazione sul tessuto adiposo bianco umano e del topo possono essere osservati ad occhio nudo. La compensazione migliora anche drasticamente la profondità dell'immagine del tessuto che può essere acquisita. E facilita l'imaging 3D dell'intero tessuto e la generazione di mappe 3D da ingrandimento 4X.La mappatura 3D consente inoltre di acquisire la selezione di diverse aree di interesse con un ingrandimento 20X a una profondità di due millimetri. La colorazione specifica di goccioline lipidiche e adipociti può essere ottenuta utilizzando rispettivamente anticorpi perilipina e anti-GLUT4. I vasi sanguigni possono essere rilevati utilizzando anticorpi CD31 o iniezione endovenosa di Lectin DyLight 649 poco prima del sacrificio.Macrofagi e cellule T possono essere visualizzati utilizzando anticorpi anti CD301 phycoerythrin e anticorpi blu anti TCR beta Pacific. La rete nervosa periferica può essere rilevata usando anticorpi anti tirosina idrossilasi. Utilizzando queste etichette è quindi possibile determinare le dimensioni medie e la distribuzione delle dimensioni degli adipociti e la densità della rete dei vasi sanguigni all'interno del tessuto adiposo.È fondamentale seguire il tempo di occupazione come dimostrato perché una scarsa preparazione del campione non si tradurrà in una buona qualità dell'immagine. Questo protocollo può essere combinato con un sistema di imaging avanzato o può essere accoppiato al freeware di analisi delle immagini post-elaborazione.

Research

JoVE Journal

Biology

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In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

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Ricerca

Biologia

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Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

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