Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
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この作品は、INSERMによってサポートされました。 コート・ダジュール大学、そして将来のラベックス・シグナライフへの投資を通じたフランス国立研究庁(ANR)からの助成金(ANR-11-LABX-0028-01)、プログラムUCA JEDI(ANR-15-IDEX-01)、アカデミー2「システムズコンプレックス」とアカデミー4「コンプレックス・エ・ダイバート」を通じて フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカル(エキペFRM DEQ20180839587)とJ.G.(ANR18-CE14-0035-01-ギレロン)に若い調査官プログラムを注ぎます。また、コンセシル・デ・アルプ・マリティームとレジオンPACAが出資するC3Mのイメージングコア施設に感謝し、IBISA顕微鏡・イメージングプラットフォームコートダジュール(MICA)も支援しています。マリオン・デュソットの組織準備に関する技術的な助けに感謝します。私たちは、原稿の証拠読み取りのためにアビー・カットトリス、UCA国際科学可視性に感謝します。

このプロトコルはテストされ、すべてのマウスおよびヒト白色脂肪組織の貯蔵所について検証される。ヒトおよびマウス脂肪組織は、それに応じて欧州の法律に従って収集され、フランスとスウェーデンの倫理委員会によって承認されました。
1. マウスとヒト白色脂肪組織の固定
<ol><li>収穫したマウスまたはヒト白色脂肪組織を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む少?...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

肥満などの病理学的進行の過程で脂肪組織内で起こる修飾は、病理学の背後にあるメカニズムの理解の基本である。脂肪組織におけるこのようなメカニズムを明らかにした先駆的な研究は、全体の脂肪組織プロテオミクス21、フローサイトメトリー22、23、および転写23体2224、25などの世界的なアプローチに24,<...

肥満は脂肪組織量の増加を特徴とし、肥満の人々が心血管疾患、2型糖尿病、肝臓病およびいくつかの癌を発症するリスクを高めていることを考えると、世界的に主要な公衆衛生問題となっている。
脂肪組織の基本的な生理学的機能は、全身グルコースおよび脂質恒常性11,22を調節することである。この摂食期間中、脂肪細胞(すなわち脂肪組織の主細胞)は、食事によって提供される過剰のグルコースおよび脂質をトリグリセリドに保存する。断食の間、脂肪細胞はトリグリセリドを非エステル化脂肪酸とグリセロールに分解して体のエネルギー需要を維持します。肥満の発症の間、脂肪組織は脂肪細胞のサイズ(肥大症)および/または数(過形成)を増加させることによって拡大し、その貯蔵能力を高める。脂肪組織の拡張がその限界に達すると、患者の間で一定の高い可変性、残りの脂質は筋肉および肝臓3、44を3含む他の代謝器官に蓄積し、その機能障害および肥満関連の心代謝合併症を発症する1,1、5。したがって、脂肪組織の拡張を支配するメカニズムを特定することは、臨床的な課題です。
肥満の間に脂肪組織内で文書化された形態学的修飾は、その病理学的機能不全に関連している。いくつかの染色手順は、アクチン6、血管マーカー7、脂質滴マーカー8、および特異的免疫細胞マーカー9、1010を含む脂肪組織の組織組織を記述するために使用されてきた。9しかし、アディポサイトの直径が大きい(50~200μm)11の11場合、肥満時に観測された劇的な構造AT変化を正確に分析するためには、組織全体の大部分を3次元で分析することが不可欠です。しかし、光が不透明な組織に浸透しないため、蛍光顕微鏡を用いた大組織試料内での3Dでのイメージングは不可能である。透明にする組織のクリアの方法は、文献で報告されています (レビューのために、12を参照してください ) 1 つの組織をクリアし、組織全体の顕微鏡を実施することができます。これらの方法は、健康で病気の組織における3D細胞組織を評価する前例のない機会を提供します。記載された各方法には利点と欠点があり、したがって、研究された組織に応じて慎重に選択する必要があります(レビューのために、13を参照)。実際、いくつかのアプローチは、高価な、有毒であるか、,,,または14、15、16、17、18、19を得14,15,ることが困難である材料または化合物の使用を長い潜伏期間および/または使用する必要があります。16171819ヴェルナー・スポルテホルツが1世紀前に使用した最初の化合物の1つを利用して組織20をクリアし、化学フード、温度制御軌道シェーカー、共焦点顕微鏡を含む標準的な機器を備えた実験室ですべてのマウスおよびヒト脂肪組織貯蔵庫のクリアに非常によく適応したユーザーフレンドリーで安価なプロトコルを設定しました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

肥満は、心血管疾患、2型糖尿病、および肝臓疾患を発症するリスクを高める世界的な公衆衛生上の主要な問題です。肥満は脂肪細胞肥大や肥大による脂肪組織(AT)質量の増加を特徴とし、その三次元構造の深い改造につながる。確かに、肥満の間に拡大するATの最大容量は肥満関連病理の開発にとって極めて重要である。このAT拡張は、過剰なエネルギー摂取量への適応を可能にし、筋肉や肝臓などの他の代謝器官への有害な脂質の波及を避けるために重要な恒食機構です。従って、AT拡張の失敗につながる構造改造を理解することは、臨床的適用性の高い根本的な問題である。本稿では、蛍光イメージングによるマウスとヒト白脂肪組織の形態を探求するために当研究室で日常的に使用されている、シンプルで高速なクリアリング方法について説明します。この最適化されたATクリアリング方法は、化学フード、温度制御軌道シェーカー、蛍光顕微鏡を備えた標準的な実験室で簡単に行われます。また、使用する化学化合物は容易に入手可能である。重要なことに、この方法は、様々なマーカーを染色することによって3D AT構造を解決し、アディポ細胞、神経および血管ネットワーク、および先天的および適応的な免疫細胞分布を特異的に視覚化することを可能にする。

図1に示したここで説明した手順を用いて、それぞれ図2Aおよび図2Bに示すように、ヒトおよびマウス白色脂肪組織をそれぞれ染色し、光学的に透明化することができた。クリアされた組織を金属イメージングチャンバに移し、共焦点イメージングを行った(図3A)。クリアによって、取得できた組織画像の?...

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

ここでは、蛍光イメージングによる血管系、核、免疫細胞、ニューロン、脂質・液滴被覆タンパク質を可視化するマーカーを組み合わせて、マウスとヒトの両方の白色脂肪組織の3D構造を解決するための簡単で安価で迅速なクリアリング方法について述べています。

メチルサリチル酸除去と3Dイメージングによる脂肪組織構造の探索

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

これらのプロトコルはマウス脂肪組織のバレエ顕微鏡上の非常に大きい人間の三次元構造の分析を可能にする。脂肪組織の構造変化と病理学的機能不全の結合を促進する。この清算プロセスは非常に簡単で、組織を脂肪化し、他の明確なプロトコルと比較してエタノールやメチルサリチル酸などの毒性の低い溶媒を使用して、暖かいマウスで人間をクリアするのに非常によく適応しています。採取したマウスまたはヒト白色脂肪組織を、PBSの4%パワーホルムアルデヒドの少なくとも10ミリリットルに、化学フードの下で優先的に15ミリリットルのプラスチックチューブに浸すことから始めます。一晩摂氏4度でローリングプレートにチューブを移す前に、室温でローリングプレートの組織を1時間振ります。翌朝、固定白脂肪組織をPBSの10ミリリットルで室温で5分間洗いすぎ、固定剤のすべての痕跡を取り除き、PBSで10ミリリットルの0.3%グリシンを含む15ミリリットルチューブに組織を移し、1分あたり100回転の軌道シェーカーで室温で1時間インキュベーションする。残りの遊離アルデヒド基がクエンチされた場合、10ミリリットルの0.2%トリトンX-100を含む15ミリリットルのチューブに、37°Cで振る2時間のインキュベーションを行う。インキュベーションの終わりに、一晩摂氏37度で振る0.2%トリトンX-100と20%DMSOの10ミリリットルで組織を治療します。翌朝、10ミリリットルの0.1%Tween 20、0.1%トリトンX-100、0.1%デオキシコール酸、20%DMSOを含む15ミリリットルのプラスチックチューブに組織を浸し、37°Cで少なくとも24時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、PBSで10ミリリットルの0.2%トリトンX-100で、1分間に100回転/分でオービタルシェーカーで組織を1時間リンスします。その後、15ミリリットルの0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAをPBSで37°Cで12時間浸漬し、揺れで37度に浸漬した。白色脂肪組織の染色のため。組織を0.2%トリトンX-100、10%DMSO、PBSの3%BSAの300マイクロリットルに移し、1.5ミリリットルマイクロチューブの目的とする一次抗体を補い、アルミニウム箔で光から保護し、チューブを50ミリリットルのファルコンチューブに入れる。チューブを軌道シェーカーに入れ、2日間のインキュベーションを摂氏37度で揺らします。インキュベーションの終わりに、0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAの10ミリリットルの組織を、揺れと光からの保護で摂氏37度で5時間、PBSで2回リンスする。2回目のすすいで、新鮮な0.2%トリトンX-100の10ミリリットルで組織を洗浄した後、 10%DMSOと3%BSAとPBSを37°Cで16〜48時間振盪し、その後、0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよびPBSの3%BSAの300マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブに組織を移し、適切な二次抗体を補い、アルミニウム箔を使用してチューブを軽く保護します。シェーカーで摂氏37度で2日間のインキュベーションを行った後、0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAの10ミリリットルで2回、光から保護された37°Cで5時間PBSで洗浄します。2回目の洗浄後、新鮮な0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAを含むチューブに組織を洗浄し、37°Cで16〜48時間、揺れと光保護を行います。その後、揺れと光の保護で摂氏37度でPBSの10ミリリットルだけで2時間の洗浄が行われます。PBSの終了時に白い脂肪組織を洗浄するためには、示されているように光から保護された揺れで室温で2時間の上昇送送用エタノール濃度系列の組織と10ミリリットルを浸す。翌朝、発煙フードに5ミリリットルのメチルサリチル酸を含むプラスチックキャップを持つ20ミリリットルのガラス瓶に組織を浸します。白い脂肪組織は、この段階でまだはっきりと見えます。容器を室温で少なくとも2時間は光から守ってください。白い脂肪組織は完全に移植される。染色され、クリアされた白い脂肪組織の3D共焦点イメージングのために、ガラス底を備えた金属イメージングチャンバーをマウントし、ヒュームフードで組織をチャンバに移す。新鮮なメチルサリチル酸塩でチャンバーを充填します。チャンバを閉じるための組織と大きなカバースリップを安定させるために小さなカバースリップを追加することにより、チャンバーのマウントを確定します。チャンバーを低倍率で組織イメージング用の反転共焦点顕微鏡ステージに置き、脂肪組織サンプル全体の数立方センチメートルの3Dマップを生成します。3D マップの生成後、解像度と深さの間に良好な比率を提供する 20X 長距離エア目標を使用して、高い倍率で組織サンプリング用の領域を選択します。セルセグメンテーションの場合は、3Dスタックをソフトウェア形式に変換してメモリスペースを解放します。ソフトウェアのセルモジュールを開く前に。細胞検出設定をプラズマ膜染色に変更し、細胞周辺を分化するために使用するマーカーの蛍光チャネルを選択します。次に、しきい値を設定し、予期されるセル サイズの範囲を指定して、セグメンテーションを実行します。ヒトおよびマウス白色脂肪組織に対するクリアの影響は、肉眼で観察することができる。クリアはまた、獲得可能な組織の画像深度を大幅に向上させます。そして4Xの倍率の全体のティッシュの3Dイメージ投射および3D地図の生成を促進する。3Dマッピングにより、20倍の倍率で2ミリメートルの深さまで、興味のあるさまざまな領域を選択できます。脂質滴および脂肪細胞の特異的染色は、それぞれペリリピンおよび抗GLUT4抗体を用いて達成することができる。血管は、犠牲の直前にCD31抗体またはレクチンDyLight 649の静脈注射のいずれかを使用して検出することができる。マクロファージおよびT細胞は、抗CD301フィコエリスリン抗体および抗TCRベータブルー抗体を用いて可視化することができる。末梢神経ネットワークは、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて検出することができる。これらの標識を用いて、脂肪細胞の平均サイズおよびサイズ分布と脂肪組織内の血管ネットワーク密度を決定することができる。サンプルの準備が不十分な場合は画質が良くなるため、実証されているように職業時間に従う必要があります。このプロトコルは、高度なイメージングシステムと組み合わせることができ、または後処理画像解析フリーウェアに結合することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

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Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

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Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

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Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

組織解離剤を用いたマウス白色脂肪組織からの間質血管画分の半自動単離(英語)

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...