Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

이 작품은 INSERM에 의해 지원되었다, 유니버시테 코트 다쥐르( Côte d'Azur)와 프랑스 국립연구청(ANR)의 보조금으로 퓨처 라벡스 시나라이프(ANR-11-LABX-0028-01), 아카데미 2 "시스테메스 컴플렉스" 및 아카데미 4 "비벤테"를 통해 프로그램 UCA JEDI(ANR-15-IDEX-01) 라 레체르체 메디칼(에키페 FRM DEQ20180839587)과 J.G.(ANR18-CE14-0035-01-길러론)에 대한 젊은 조사 프로그램 도 쏟아졌다. 또한 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 감사드리며, IBISA 현미경 및 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원합니다. 우리는 조직 준비에 기술적 인 도움을 매리언 두소트 감사합니다. 우리는 애비 컷트리스, UCA 국제 과학 가시성, 원고의 증거 읽기에 감사드립니다.

이 프로토콜은 테스트되었으며 모든 마우스 및 인간 흰색 지방 조직 창고에 대해 검증되었습니다. 인간과 마우스 조직 조직은 유럽 법률에 따라 수집및 프랑스와 스웨덴 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 마우스와 인간의 흰색 지방 조직의 고정
<ol><li>수확한 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직을 15mL 플라스틱 튜브에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 PBS의 최소 10mL에 담급...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

비만과 같은 병리학적 진행 과정에서 지방 조직 내에서 발생하는 수정은 병리학 뒤에 있는 메커니즘의 이해에 기본입니다. 지방 조직에서 이러한 메커니즘을 밝힌 선구적인 연구는 전체 지방 조직프로테오믹스(21),유동 세포측정법(22,,23)및전사학(24,,25)과같은 글로벌 접근법에 기반을 두고 있다....

비만은 지방 조직 질량에 있는 증가를 특징으로 하고 비만을 가진 사람들이 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병, 간 질병 및 몇몇 암을 개발의 리스크를 증가했다는 것을 감안할 때, 중요한 세계적인 공중 위생 문제점이 되었습니다.
지방 조직의 근본적인 생리적 기능은 전신 포도당과 지질 항상성1,,2를조절하는 것입니다. 먹이 주기 동안, 지방 조직의 주요 세포(즉, 지방 조직의 주요 세포)는 식사에서 제공하는 포도당과 지질의 과잉을 트리글리세라이드로 저장합니다. 금식 하는 동안, 지방 세포는 신체의 에너지 수요를 유지 하기 위해 비 에스테르 지방산 과 글리세롤으로 트리 글리세라이드를 분해. 비만의 발달 도중, 지방 조직은 그들의 저장 용량을 증가시키기 위하여 adipocytes의크기 (비대성) 및/또는 수 (hyperhyperasia)를 증가시킴으로써 확장합니다. 지방 조직의 팽창이 한계에 도달하면, 환자 들 사이에서 일정한 높게 변수, 나머지 지질은 근육과 간3을포함하여 다른 신진 대사 기관에 축적3,4,그들의 기능 적 실패와 비만 관련 심장 대사 합병증을개시1,,5. 따라서, 지방 조직 확장을 지배하는 메커니즘을 식별하는 것은 중요한 임상 과제입니다.
비만 도중 지방 조직 안에 문서화된 형태학적 수정은 그것의 병리학적인 역기능에 연결됩니다. 여러 염색 절차는 액틴6,혈관 마커7,지질-물방울 마커8,및 특정 면역 세포 마커9,,10을포함하는 지방 조직의 조직 조직을 설명하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 대지세포(50~200 μm)의 막대한 직경11때문에, 비만 시 관찰된 극적인 구조적 AT 변화를 정확하게 분석하기 위해서는 전체 조직의 상당 부분을 3차원으로 분석하는 것이 필수적이다. 그러나, 빛이 불투명한 조직을 관통하지 않기 때문에, 형광 현미경검사를 이용한 대형 조직 샘플 내에서 3D로 이미징하는 것은 불가능합니다. 그(것)들을 투명하게 하기 위하여 조직 청산의 방법은 문헌에서 보고되었습니다 (검토를 위해,12참조) 조직을 지우고 심층적인, 전체 조직 형광 현미경 검사를 능력을 발휘할 수 있도록 합니다. 이 방법은 건강하고 병들게 한 조직에서 3D 세포 조직을 평가하는 전례없는 기회를 제공합니다. 각 기재 방법에는 장점과 단점이 있으므로 연구된 조직에 따라 신중하게 선택해야 합니다(검토를 위해13참조). 실제로, 일부 접근법은,14,,15,,16,17,18,,19를얻기 어렵거나, 독성이 있거나, 고가의 물질 또는화합물의사용 및/또는 사용이 필요하다. 베르너 Spalteholz에 의해 세기 전에 사용 된 첫 번째 화합물 중 하나를 활용20,우리는 매우 잘 화학 후드, 온도 제어 궤도 셰이커와 공초점 현미경을 포함한 전형적인 장비와 실험실에서 모든 마우스와 인간의 지방 조직 창고의 청산에 적응 사용자 친화적이고 저렴한 프로토콜을 설정합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

비만은 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병 및 간 질병을 개발하는 리스크를 증가시키는 중요한 세계적인 공중 위생 문제점입니다. 비만은 지방 조직 (AT) 대두 증식 및 비대성으로 인해 질량의 증가를 특징으로하며, 3 차원 구조의 심오한 리모델링으로 이어진다. 실제로, 비만 도중 확장하는 AT의 최대 용량은 비만 관련 병학의 발달에 중추적인 입니다. 이 AT 확장은 에너지 섭취량의 과잉에 적응을 가능하게하고 다른 신진 대사 기관에 해로운 지질 유출을 피하기 위해 중요한 정향적 메커니즘입니다, 근육과 간 등. 따라서 AT 확장의 실패로 이어지는 구조적 리모델링을 이해하는 것은 높은 임상 적용성을 가진 근본적인 질문입니다. 이 기사에서는 형광 이미징에 의한 마우스 및 인간 백색 지방 조직의 형태를 탐구하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 간단하고 빠른 클리어링 방법을 설명합니다. 이 최적화된 AT 클리어링 방법은 화학 후드, 온도 제어 궤도 셰이커 및 형광 현미경을 갖춘 모든 표준 실험실에서 쉽게 수행됩니다. 또한 사용되는 화학 화합물을 쉽게 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 방법은 다양한 마커를 염색하여 3D AT 구조를 구체적으로 시각화하여, 신경 및 혈관 네트워크, 그리고 선천적이고 적응적인 면역 세포 분포를 확인할 수 있게 한다.

여기에 기재된 절차를 이용하여 도 1에요약된, 우리는 도 2A 및 도 2B에각각 제시된 바와 같이 인간및 마우스 백색 지방 조직을 각각 얼룩지게 하고 광학적으로 맑은 조직할 수 있었다. 클리어된 조직은 공초점 이미징(도 3A)을 수행하기 위해 금속 이미징 챔버로옮겨졌다. 클리어링은 우리가 획득할 수 있었던 ...

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

여기서, 우리는 형광 화상 진찰에 의하여 혈관, 핵, 면역 세포, 뉴런 및 지질 물방울 외투 단백질을 시각화하기 위하여 마커의 조합을 사용하여 마우스와 인간 백색 지방 조직의 3D 구조를 해결하는 간단하고 저렴하고 빠른 청산 방법을 기술합니다.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

이러한 프로토콜은 마우스 지방 조직 발레 현미경검사에 매우 큰 인간의 3 차원 구조의 분석을 할 수 있습니다. 지방 조직 구조 변화와 병리학 적 기능 장애의 연결을 촉진. 이 클리어링 과정은 매우 간단하며, 따뜻한 쥐에 인간을 지우는 데 매우 잘 적응되어 조직 조직을 지방 조직으로 제거하고 다른 명확한 프로토콜에 비해 에탄올 또는 메틸 살리실레이트와 같은 독성이 적은 용매를 사용합니다.먼저 수확한 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직을 PBS에서 4% 이상의 포름알데히드(포름알데히드)에 15밀리리터 플라스틱 튜브를 화학 후드 아래에 두는 것으로 시작합니다. 하룻밤 사이에 4도에서 튜브를 압연 플레이트로 옮기기 전에 1 시간 동안 실온에서 롤링 플레이트에 티슈를 흔들어보십시오. 다음날 아침, 고정된 백색 지방 조직을 실온에서 5분 동안 PBS10 밀리리터로 헹구고, 1000분의 궤도 셰이커에서 실온에서 10밀리리터의 글리신을 포함하는 15밀리리터 튜브로 조직을 이송한다.나머지 무료 알데히드 그룹이 담금질되었을 때, PBS에서 0.2%의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 조직을 담급하여 섭씨 37도에서 흔들어 두 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션의 끝에서 0.2 %의 트리톤 X-100 및 20 %DMSO의 10 밀리리터로 조직을 치료하며 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 흔들리고 있습니다. 다음날 아침, PBS에서 0.1%Tween 20, 0.1%트리톤 X-100, 0.1%deoxycholate 및 20%DMSO를 함유한 15밀리리터 플라스틱 튜브에 조직을 몰입하여 37°C에서 최소 24시간 동안 잠복합니다.인큐베이션이 끝나면 PBS에서 0.2%의 10밀리리터로 조직을 헹구고 분당 100회전에서 1시간 동안 궤도 셰이커를 시비탈 셰이커로 헹구는다. 그 다음으로 0.2%의 트리톤 X-100, 10%DMSO, PBS 3%BSA의 15밀리리터에 12시간 동안 37°C의 흔들림이 뒤따랐습니다. 흰색 지방 조직의 염색을 위해.조직을 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS의 3%BSA로 전송하여 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 대한 주요 항체로 보완되어 알루미늄 호일로 빛을 보호하고 튜브를 50 밀리리터 팔콘 튜브에 넣습니다. 튜브를 궤도 셰이커에 넣고 2일 동안 흔들리는 섭씨 37도에서 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS3%BSA의 10밀리리터에서 2회 조직을 헹구고 37도에서 5시간 동안 PBS에서 37도의 흔들림과 빛으로부터 보호합니다.두 번째 헹도 세척 후 10 밀리리터에서 10 밀리리터의 신선한 0.2% 트리톤 X-100, 10%DMSO 및 3%BSA 및 PBS는 섭씨 37도에서 16~48시간 동안 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS의 3%BSA를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브로 이송하여 적절한 이차 항체및 알루미늄을 사용하여 알루미늄을 보호합니다. 셰이커에서 섭씨 37도에서 이틀 간 배양한 후, 0.2%의 트리톤 X-100, 10%DMSO, 3%BSA의 10밀리리터에서 2회 세척하여 37°C에서 5시간 동안 PBS에서 37도에서 진동을 방지합니다. 두 번째 세척 후, 신선한 0.2 %트리톤 X-100, 10 %DMSO 및 PBS에서 3 %BSA의 10 밀리리터를 포함하는 튜브로 조직을 헹구고 37 섭씨에서 37 섭씨에서 흔들리고 빛 보호합니다.그 다음에는 PBS 10밀리리터에서만 37도에서 흔들림과 가벼운 보호 기능을 하며 2시간 동안 세척합니다. PBS 세척의 끝에 백색 지방 조직 클리어링을 위해, 지시된 바와 같이 빛으로부터 보호되는 흔들림과 함께 실온에서 농도당 2시간 배양에 대한 오름차순 송신 에탄올 농도 시리즈의 조직 및 10 밀리리터를 침수한다. 다음 날 아침, 연기 후드에 메틸 살리실레이트 5밀리리터가 들어있는 플라스틱 캡이 달린 20밀리리터 유리 병에 티슈를 담그면 됩니다.백색 지방 조직은 이 단계에서 아직도 명확하게 보입니다. 용기를 흔들어 적어도 2 시간 동안 실온에서 빛으로부터 보호하십시오. 백색 지방 조직은 완전히 이식됩니다.스테인드 및 클리어 된 흰색 지방 조직의 3D 공초점 화상 진찰을 위해 유리 바닥과 연기 후드가 장착 된 금속 이미징 챔버를 챔버로 전달합니다. 신선한 메틸 살리실레이트로 챔버를 채웁니다. 작은 커버 슬립을 추가하여 챔버의 장착을 마무리하여 조직을 안정화시키고 큰 커버 슬립을 챔버를 닫습니다.전체 지방 조직 샘플의 몇 입방 센티미터 3D지도를 생성하기 위해 낮은 배율에서 조직 이미징을위한 반전 공초점 현미경 단계에 챔버를 배치합니다. 3D 맵 생성 후 해상도와 깊이 사이의 좋은 비율을 제공하는 20배 장거리 공기 목표를 사용하여 더 높은 배율에서 조직 샘플링을 위한 여러 영역을 선택합니다. 셀 세분화의 경우 3D 스택을 소프트웨어 형식으로 변환하여 메모리 공간을 확보합니다.소프트웨어의 셀 모듈을 열기 전에. 세포 검출 설정을 플라즈마 멤브레인 염색으로 변경하고 세포 주변을 설명하는 데 사용되는 마커의 형광 채널을 선택합니다. 그런 다음 임계값을 설정하고 예상 셀 크기의 범위를 제공하고 분할을 실행합니다.인간과 마우스 백색 지방 조직에 청산의 영향은 육안으로 관찰될 수 있습니다. 클리어링은 또한 획득할 수 있는 조직의 이미지 깊이를 크게 향상시킵니다. 또한 4배 배율로 조직 3D 이미징 및 3D 맵 생성을 용이하게 합니다.3D 매핑을 통해 20배배율에서 2밀리미터 깊이로 다양한 관심 영역을 선택할 수 있습니다. 지질 방울과 지방세포의 특정 염색은 각각 페리핀 및 항글루4 항체를 사용하여 달성될 수 있다. 혈관은 희생 직전에 CD31 항체 또는 렉틴 DyLight 649의 정맥 주사를 사용하여 검출될 수 있습니다.대식세포및T세포는 항체 CD301 피코에리스린 항체 및 항 TCR 베타 퍼시픽 블루 항체를 사용하여 시각화될 수 있다. 말초 신경 네트워크는 항 티로신 하이드록실라제 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 라벨링을 이용하여 지방 조직 내의 선포세포 및 혈관 네트워크 밀도의 평균 크기 및 크기 분포를 결정할 수 있다.열악한 샘플 준비로 인해 좋은 이미지 품질이 발생하지 않기 때문에 작업 시간을 입증한 대로 따르는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 고급 이미징 시스템과 결합하거나 후처리 이미지 분석 프리웨어에 결합될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

연구

생물학

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

형광 이미징을 위한 식물 조직의 광학 클리어링

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Culturing Preadipocytes Isolated from Murine Perivascular Adipose Tissue

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

The Significance of Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of SVF-Derived Preadipocytes from Mouse Perivascular Adipose Tissue (Video) | JoVE

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)