Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av INSERM, Université Côte d'Azur, og ved tilskudd fra det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) gjennom Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes" og Academy 4 "Complexité et diversité duvant vi", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), og Young Investigator Program til J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi takker også Imaging Core Facility of C3M finansiert av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, og som også støttes av IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Vi takker Marion Dussot for teknisk hjelp i vevsforberedelse. Vi takker Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, for bevislesing av manuskriptet.

Denne protokollen ble testet og er validert for alle mus og menneskelige hvite fettvev depoter. Menneske- og mus fettvev ble samlet inn i henhold til europeiske lover og godkjent av franske og svenske etiske komiteer.
1. Fiksering av mus og humant hvitt fettvev
<ol><li>Dypp den høstede musen eller humant hvitt fettvev i minst 10 ml PBS som inneholder 4% paraformaldehyd (PFA) i et 15 ml plastrør.</li>
	<li>Rist plastrøret ved romtemperatur på en rulleplate i 1 time.</li>
	<li>La plastrør...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

Endringene som forekommer i fettvevet i løpet av patologisk progresjon, for eksempel fedme, er grunnleggende for forståelsen av mekanismene bak patologien. Banebrytende studier som avslørte slike mekanismer i fettvev har vært basert på globale tilnærminger som hele fettvev proteomics21, flyt cytometri22,,23,og transkripsjonsmikromikk24,25. I tillegg er det gjort forsøk på ?...

Fedme er preget av en økning i fettvevsmasse og har blitt et stort verdensomspennende folkehelseproblem, gitt at personer med fedme har økt risiko for å utvikle kardiovaskulær sykdom, type-2 diabetes, leversykdommer og noen kreftformer.
En grunnleggende fysiologisk funksjon av fettvev er å modulere helkroppsglukose og lipid homeostase1,2. I fôringsperioden lagrer adipocytter (det vil si hovedcellene i fettvevet) overskuddet av glukose og lipider levert av et måltid i triglyserider. Under fasting bryter adipocytter ned triglyserider i ikke-forestret fettsyrer og glyserol for å opprettholde energibehovet i kroppen. Under utviklingen av fedme, fettvev utvide ved å øke størrelsen (hypertrophia) og / eller antall (hyperplasi) av adipocytter1, for å øke lagringskapasiteten. Når utvidelsen av fettvev når sin grense, en konstant svært variabel blant pasienter, de resterende lipider akkumuleres i andre metabolske organer, inkludert muskler og lever3,4, fører til deres funksjonelle svikt og initiere fedme-relaterte kardio-metabolske komplikasjoner1,5. Derfor er identifisering av mekanismene som styrer fettvevsutvidelse en viktig klinisk utfordring.
De morfologiske endringene dokumentert i fettvev under fedme er knyttet til sin patologiske dysfunksjon. Flere fargingsprosedyrer har blitt brukt til å beskrive vevsorganisering av fettvevet, inkludert actin6, vaskulære markører7,lipiddråpemarkører8og spesifikke immuncellemarkører9,10. Men på grunn av den enorme diameteren av adipocytter (50 til 200 μm)11, er det viktig å analysere en stor del av hele vevet i tre dimensjoner for å nøyaktig analysere de dramatiske strukturelle AT-endringene observert under fedme. Men fordi lyset ikke trenger inn i et ugjennomsiktig vev, er det ikke mulig å avbildning i 3D i en stor vevsprøve ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Metoder for vevrydding for å gjøre dem gjennomsiktige har blitt rapportert i litteraturen (for en gjennomgang,se 12) slik at man kan fjerne vev og utføre dyptgående, hele vev fluorescens mikroskopi. Disse metodene gir enestående muligheter til å vurdere 3D cellulær organisasjon i sunt og sykt vev. Hver av de beskrevne metodene har fordeler og ulemper, og må derfor nøye velges avhengig av det studerte vevet (for en gjennomgang, se13). Faktisk krever noen tilnærminger en lang inkubasjonsperiode og / eller bruk av materialer eller forbindelser som enten er dyre, giftige eller vanskelige å få14,15,16,17,18,19. Ved å dra nytte av en av de første forbindelsene som ble brukt for hundre år siden av Werner Spalteholz for å fjernevev 20,satte vi opp en brukervennlig og billig protokoll som er veldig godt tilpasset for rydding av alle mus- og menneskelige fettvevsdepoter i ethvert laboratorium med typisk utstyr, inkludert en kjemisk hette, en temperaturkontrollert orbital shaker og et konfokalt mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

Fedme er et stort verdensomspennende folkehelseproblem som øker risikoen for å utvikle hjerte-og karsykdommer, type-2 diabetes og leversykdommer. Fedme er preget av en økning i fettvev (AT) masse på grunn av adipocytt hyperplasi og / eller hypertrophia, noe som fører til dyp ombygging av sin tredimensjonale struktur. Faktisk er den maksimale kapasiteten til AT å utvide under fedme avgjørende for utviklingen av fedmerelaterte patologier. Denne AT-utvidelsen er en viktig homeostatisk mekanisme for å muliggjøre tilpasning til et overskudd av energiinntak og for å unngå skadelig lipidsøl til andre metabolske organer, som muskel og lever. Derfor er det et grunnleggende spørsmål med høy klinisk anvendelighet å forstå den strukturelle ombyggingen som fører til svikt i AT-utvidelse. I denne artikkelen beskriver vi en enkel og rask clearing metode som rutinemessig brukes i vårt laboratorium for å utforske morfologien til mus og menneskelig hvitt fettvev ved fluorescerende bildebehandling. Denne optimaliserte AT-ryddemetoden utføres enkelt i ethvert standardlaboratorium utstyrt med en kjemisk hette, en temperaturkontrollert orbital shaker og et fluorescerende mikroskop. Videre er de kjemiske forbindelsene som brukes lett tilgjengelige. Viktigere, denne metoden gjør det mulig å løse 3D AT-strukturen ved å farge ulike markører for å spesifikt visualisere adipocytter, de nevronale og vaskulære nettverkene, og den medfødte og adaptive immunceller distribusjon.

Ved hjelp av prosedyren som er beskrevet her og oppsummert i figur 1,var vi i stand til å flekke og optisk klart menneske- og mushvitt fettvev som presentert i henholdsvis figur 2A og figur 2B. Det klarerte vevet ble overført til det metalliske bildekammeret for å utføre konfokal avbildning (figur 3A). Ryddingen forbedret dybden av vevsbildene som vi var i stand til å skaffe (f...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Her beskriver vi en enkel, billig og rask clearing metode for å løse 3D-strukturen av både mus og humant hvitt fettvev ved hjelp av en kombinasjon av markører for å visualisere vaskulatur, kjerner, immunceller, nevroner og lipid-dråpefrakkproteiner ved fluorescerende bildebehandling.

Utforske fettvevsstruktur av Methylsalicylate Clearing og 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Disse protokollen tillater analyse av tredimensjonal struktur av Svært stort menneske på musen fettvev ballett mikroskopi. Tilrettelegge koblingen av patologisk dysfunksjon med fettvev strukturelle endringer. Denne ryddeprosessen er veldig enkel, veldig godt tilpasset å rydde menneskelig på varme mus fettvev og bruke mindre giftig løsningsmiddel som etanol eller metylsallisat sammenlignet med andre klare protokoller.Begynn med å senke den høstede musen eller humant hvitt fettvev i minst 10 milliliter med 4% effekt formaldehyd i PBS i et 15 milliliter plastrør fortrinnsvis under en kjemisk hette. Rist vevet på en rullende plate ved romtemperatur i en time før du overfører røret til en rullende plate ved fire grader Celsius over natten. Neste morgen skyller du det faste hvite fettvevet i 10 milliliter PBS i fem minutter ved romtemperatur for å fjerne alle spor av fikseringsmiddel og overføre vevet til et 15 milliliter rør som inneholder 10 milliliter 0,3% glysin i PBS i en time inkubasjon ved romtemperatur på en orbital shaker ved 100 omdreininger per minutt.Når de resterende frie aldehydgruppene har blitt slukket, dypp vevet i et 15 milliliter rør som inneholder 10 milliliter på 0,2% Triton X-100 i PBS for en to timers inkubasjon med risting ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen behandle vevet med 10 milliliter på 0,2% Triton X-100 og 20% DMSO med risting på 37 grader Celsius over natten. Neste morgen fordyper vevet i et 15 milliliter plastrør som inneholder 10 milliliter 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 0,1% deoksycholate og 20% DMSO i PBS i minst 24 timers inkubasjon ved 37 grader Celsius med risting.På slutten av inkubasjonen, skyll vevet med 10 milliliter på 0,2% Triton X-100 i PBS på en orbital shaker ved 100 omdreininger per minutt i en time. Etterfulgt av nedsenking i 15 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i 12 timer ved 37 grader Celsius med risting. For farging av det hvite fettvevet.Overfør vevet til 300 mikroliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS, supplert med de primære antistoffene av interesse i et 1,5 milliliter mikrorør beskytter det mot lys med aluminiumsfolie og plasserer røret i et 50 milliliter Falcon-rør. Plasser røret i orbital shaker for en to dagers inkubasjon på 37 grader Celsius med risting. På slutten av inkubasjonen skylle vevet to ganger i 10 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med risting og beskyttelse mot lys.Etter den andre skyll vask vevet i 10 milliliter friske 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA og PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med risting, Deretter overføre vevet til en 1,5 milliliter rør som inneholder 300 mikroliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS, supplert med passende sekundære antistoffer og beskytte røret mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie. Etter en to dagers inkubasjon ved 37 grader Celsius på en shaker, vask vevet to ganger i 10 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med risting beskyttet mot lys. Etter den andre vasken, skyll vevet inn i et rør som inneholder 10 milliliter friske 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med risting og lysbeskyttelse.Etterfulgt av en to timers vask i 10 milliliter PBS alene ved 37 grader Celsius med risting og lysbeskyttelse. For hvit fettvevsrydding på slutten av PBS vask ned vevet og 10 milliliter av en stigende sende etanol konsentrasjonsserie for en to timers inkubasjon per konsentrasjon ved romtemperatur med risting beskyttet mot lys som angitt. Neste morgen dypp vevet i en 20 milliliter glassflaske med en plasthette som inneholder fem milliliter metylsalylat i en røykhette.Det hvite fettvevet er fortsatt tydelig synlig på dette stadiet. Rist beholderen beskytte den mot lys ved romtemperatur i minst to timer. Det hvite fettvevet blir helt transplantasjon.For 3D confocal avbildning av farget og ryddet hvitt fettvev montere et metallisk bildekammer utstyrt med en glassbunn og i en røyk hette overføre vevet til kammeret. Fyll kammeret med fersk metylsallisylat. Fullføre montering av kammeret ved å legge til et lite deksel slip for å stabilisere vevet og et stort deksel slip for å lukke kammeret.Plasser kammeret på et omvendt konfokalt mikroskopstadium for vevsavbildning ved lav forstørrelse for å generere noen kubikkcentimeter 3D-kart over hele fettvevsprøven. Etter 3D-kartgenerering bruker du et 20X langdistanseluftmål som gir et godt forhold mellom oppløsning og dybde for å velge flere områder for vevsprøvetaking ved en høyere forstørrelse. For cellesegmentering konvertere 3D-stabler til programvareformatet for å frigjøre minneplass.Før du åpner cellemodulen til programvaren. Endre celledeteksjonsinnstillingen til plasmamembranfarging og velg den fluorescerende kanalen til markøren som brukes til å avgrense celle periferien. Deretter definerer du terskler, gir et område av de forventede cellestørrelsene og kjører segmenteringen.Påvirkningen av å rydde på menneske og mus hvitt fettvev kan observeres med det blotte øye. Clearing forbedrer også bildedybden av vevet som er i stand til å bli kjøpt. Og forenkler hele vev 3D-bildebehandling og 3D kart generasjon ut av 4X forstørrelse.3D-kartlegging gjør det mulig å få videre valg av ulike interesseområder ved en 20X forstørrelse til en dybde på to millimeter. Spesifikk farging av lipiddråper og adipocytter kan oppnås ved hjelp av henholdsvis perilipin- og anti-GLUT4-antistoffer. Blodårene kan oppdages ved hjelp av enten CD31 antistoff eller intravenøs injeksjon av Lectin DyLight 649 kort tid før offer.Makrofager og T-celler kan visualiseres ved hjelp av anti CD301 fykoerytrin antistoff og anti TCR beta Pacific blå antistoff. Det perifere nervenettverket kan oppdages ved hjelp av anti tyrosinhydroksylaseantistoff. Ved hjelp av disse merkingene kan gjennomsnittlig størrelse og størrelsesfordeling av adipocytter og blodkarnettverkstettheten i fettvevet bestemmes.Det er avgjørende å følge yrkestiden som demonstrert fordi dårlig prøveforberedelse ikke vil resultere i god bildekvalitet. Denne protokollen kan kombineres med avansert bildebehandlingssystem eller kan kombineres til etterbehandling bildeanalyse freeware.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: biologisk vev Clearing og Immunolabeling Metoder for Volum Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optisk rydding av plantevev for fluorescensavbildning

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Semi-automatisert isolering av den stromale vaskulære fraksjonen fra murine hvitt fettvev ved bruk av en vevsdissosiator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...