Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Este trabalho contou com o apoio da INSERM, Université Côte d'Azur, e por subsídios da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) através dos Investimentos para o Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), o programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes " e Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), e o Programa Jovem Investigador para J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos também a Instalação núcleo de imagem do C3M financiada pelo Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e pelo Région PACA, e que também conta com o apoio da Plataforma de Microscopia e Imagem IBISA Côte d'Azur (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por ajuda técnica na preparação de tecidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, visibilidade científica internacional da UCA, pela leitura do manuscrito.

Este protocolo foi testado e é validado para todos os depósitos de tecido adiposo branco e de rato e humano. Os tecidos adiposos humanos e de camundongos foram coletados de acordo com as leis europeias e aprovados pelos comitês de Ética francês e sueco.
1. Fixação de tecido adiposo branco e camundongo
<ol><li>Mergulhe o rato colhido ou os tecidos adiposos brancos humanos em pelo menos 10 mL de PBS contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em um tubo plástico de 15 mL.</li>
	<li>Agite o t...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

As modificações que ocorrem dentro do tecido adiposo ao longo da progressão patológica, como a da obesidade, são fundamentais para a compreensão dos mecanismos por trás da patologia. Estudos pioneiros que revelaram tais mecanismos no tecido adiposo têm sido baseados em abordagens globais como proteômica de tecido adiposo inteiro21,citometria de fluxo22,,23e transcriômica24,25</...

A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa tecidual adiposa e tornou-se um grande problema de saúde pública mundial, uma vez que as pessoas com obesidade têm risco aumentado de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, doenças hepáticas e alguns cânceres.
Uma função fisiológica fundamental do tecido adiposo é modular a glicose do corpo inteiro e a homeostase lipídica1,2. Durante o período de alimentação, os adipócitos (ou seja, as principais células do tecido adiposo) armazenam o excesso de glicose e lipídios fornecidos por uma refeição em triglicérides. Durante o jejum, os adipócitos dividem os triglicérides em ácidos graxos não esterificados e glicerol para sustentar a demanda energética do corpo. Durante o desenvolvimento da obesidade, o tecido adiposo expande-se aumentando o tamanho (hipertrophia) e/ou o número (hiperplasia) dos adipócitos1, para aumentar sua capacidade de armazenamento. Quando a expansão do tecido adiposo atinge seu limite, uma constante altamente variável entre os pacientes, os lipídios restantes se acumulam em outros órgãos metabólicos, incluindo músculos e fígado3,,4, levando à sua falha funcional e iniciando complicações cardio-metabólicas relacionadas à obesidade1,,5. Portanto, identificar os mecanismos que regem a expansão do tecido adiposo é um desafio clínico fundamental.
As modificações morfológicas documentadas dentro dos tecidos adiposos durante a obesidade estão ligadas à sua disfunção patológica. Vários procedimentos de coloração têm sido utilizados para descrever a organização tecidual do tecido adiposo, incluindo actin6, marcadores vasculares7,marcadores lipídes-gotículas8, e marcadores de células imunes específicas9,,10. No entanto, devido ao enorme diâmetro dos adipócitos (50 a 200 μm)11, é essencial analisar grande parte de todo o tecido em três dimensões, a fim de analisar com precisão as dramáticas mudanças estruturais de AT observadas durante a obesidade. No entanto, como a luz não penetra em um tecido opaco, não é possível imagens em 3D dentro de uma grande amostra de tecido usando microscopia de fluorescência. Métodos de limpeza tecidual para torná-los transparentes têm sido relatados na literatura (para uma revisão, ver12) permitindo que se limpe tecidos e realize microscopia de fluorescência tecidual. Esses métodos oferecem oportunidades sem precedentes para avaliar a organização celular 3D em tecido saudável e doente. Cada um dos métodos descritos tem vantagens e desvantagens e, portanto, precisa ser cuidadosamente selecionado dependendo do tecido estudado (para uma revisão, veja13). De fato, algumas abordagens requerem um longo período de incubação e/ou o uso de materiais ou compostos que sejam caros, tóxicos ou difíceis de obter14,15,16,17,,18,19. Aproveitando um dos primeiros compostos usados há um século por Werner Spalteholz para limpar tecidos20,criamos um protocolo fácil de usar e barato que é muito bem adaptado para a limpeza de todos os depósitos de tecido adiposo humano e camundongos em qualquer laboratório com equipamento típico, incluindo um capuz químico, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio confocal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

A obesidade é um grande problema de saúde pública mundial que aumenta o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e doenças hepáticas. A obesidade é caracterizada pelo aumento da massa do tecido adiposo (AT) devido à hiperplasia adipócito e/ou hipertrofia, levando à profunda remodelação de sua estrutura tridimensional. De fato, a capacidade máxima de expansão da AT durante a obesidade é fundamental para o desenvolvimento de patologias associadas à obesidade. Esta expansão AT é um importante mecanismo homeostático para permitir a adaptação a um excesso de ingestão de energia e evitar o derramamento de lipídio deletério para outros órgãos metabólicos, como músculo e fígado. Portanto, compreender a remodelagem estrutural que leva ao fracasso da expansão at é uma questão fundamental com alta aplicabilidade clínica. Neste artigo, descrevemos um método simples e rápido de limpeza que é usado rotineiramente em nosso laboratório para explorar a morfologia do tecido adiposo branco e camundongo por imagem fluorescente. Este método otimizado de limpeza AT é facilmente realizado em qualquer laboratório padrão equipado com uma capa química, um agitador orbital controlado pela temperatura e um microscópio fluorescente. Além disso, os compostos químicos utilizados estão prontamente disponíveis. É importante ressaltar que este método permite resolver a estrutura 3D AT, colorindo vários marcadores para visualizar especificamente os adipócitos, as redes neuronais e vasculares e a distribuição de células imunes inatas e adaptáveis.

Utilizando o procedimento descrito aqui e resumido na Figura 1,conseguimos manchar e limpar oidualizado o tecido adiposo branco humano e camundongo, conforme apresentado na Figura 2A e Figura 2B, respectivamente. O tecido limpo foi transferido para a câmara de imagem metálica para realização de imagens confocal(Figura 3A). A clareira melhorou drasticamente a profundidade das imagens teciduais que pu...

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Aqui, descrevemos um método simples, barato e rápido de limpeza para resolver a estrutura 3D do tecido adiposo branco e camundongo usando uma combinação de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células imunes, neurônios e proteínas de casaco de gotícula lipídica por imagem fluorescente.

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Este protocolo permite a análise da estrutura tridimensional de humanos muito grandes na microscopia de balé de tecido adiposo do rato. Facilitando a ligação da disfunção patológica com alterações estruturais teciduais adiposos. Este processo de compensação é muito simples, muito bem adaptado para limpar humanos em camundongos quentes e usar menos solvente tóxico, como etanol ou salicilato de metila em comparação com outros protocolos claros.Comece imergindo o rato colhido ou tecido adiposo branco humano em pelo menos 10 mililitros de formaldeído de 4% de potência em PBS em um tubo plástico de 15 mililitros preferencialmente sob uma capa química. Agite o tecido em uma placa de rolamento à temperatura ambiente por uma hora antes de transferir o tubo para uma placa de rolamento a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, enxágue o tecido adiposo branco fixo em 10 mililitros de PBS por cinco minutos à temperatura ambiente para remover todos os traços de fixação e transferir o tecido para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 0,3% de glycina na PBS para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente em um agitador orbital a 100 rotações por minuto.Quando os restantes grupos de aldeídos livres tiverem sido extintos, mergulhe o tecido em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 0,2% Triton X-100 em PBS para uma incubação de duas horas com agitação a 37 graus Celsius. No final da incubação, trate o tecido com 10 mililitros de 0,2% Triton X-100 e 20% DMSO com agitação a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, mergulhe o tecido em um tubo plástico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% desoxicolato e 20% DMSO em PBS para uma incubação de pelo menos 24 horas a 37 graus Celsius com agitação.No final da incubação, enxágue o tecido com 10 mililitros de 0,2% Triton X-100 em PBS em um agitador orbital a 100 revoluções por minuto durante uma hora. Seguido pela imersão em 15 mililitros de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA na PBS por 12 horas a 37 graus Celsius com agitação. Para coloração do tecido adiposo branco.Transfira o tecido para 300 microliters de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA em PBS, complementado com os anticorpos primários de interesse em um micro tubo de 1,5 mililitro, proteja-o da luz com papel alumínio e coloque o tubo em um tubo Falcon de 50 mililitros. Coloque o tubo no agitador orbital para uma incubação de dois dias a 37 graus Celsius com agitação. No final da incubação enxágue o tecido duas vezes em 10 mililitros de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO e 3%BSA na PBS por cinco horas a 37 graus Celsius com agitação e proteção contra luz.Após a segunda lavagem lave o tecido em 10 mililitros de 0,2%Triton X-100 fresco, 10% DMSO e 3%BSA e PBS por 16 a 48 horas a 37 graus Celsius com agitação, em seguida, transfira o tecido para um tubo de 1,5 mililitro contendo 300 microliters de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA em PBS, complementado com os anticorpos secundários apropriados e proteger o tubo da luz usando papel alumínio. Depois de dois dias de incubação a 37 graus Celsius em um shaker, lave o tecido duas vezes em 10 mililitros de 0,2%Triton X-100, 10% DMSO e 3%BSA em PBS por cinco horas a 37 graus Celsius com agitação protegida da luz. Após a segunda lavagem, enxágue o tecido em um tubo contendo 10 mililitros de 0,2%Triton X-100 fresco, 10%DMSO e 3%BSA em PBS por 16 a 48 horas a 37 graus Celsius com agitação e proteção contra luz.Seguido por uma lavagem de duas horas em 10 mililitros de PBS sozinho a 37 graus Celsius com agitação e proteção contra luz. Para a limpeza do tecido adiposo branco no final da lavagem PBS, mergulhe o tecido e 10 mililitros de uma série ascendente de concentração de etanol de envio para uma incubação de duas horas por concentração à temperatura ambiente com agitação protegida da luz como indicado. Na manhã seguinte, mergulhe o tecido em uma garrafa de vidro de 20 mililitros com uma tampa plástica contendo cinco mililitros de salicilolato de metila em um capô de fumaça.O tecido adiposo branco ainda é claramente visível nesta fase. Agite o recipiente para protegê-lo da luz à temperatura ambiente por pelo menos duas horas. O tecido adiposo branco torna-se completamente transplantado.Para imagens confocal 3D do tecido adiposo branco manchado e limpo montar uma câmara de imagem metálica equipada com um fundo de vidro e em um capô de fumaça transferir o tecido para a câmara. Encha a câmara com salicilato de metila fresco. Finalize o suporte da câmara adicionando um pequeno deslizamento de cobertura para estabilizar o tecido e um grande deslizamento de cobertura para fechar a câmara.Coloque a câmara sobre um estágio de microscópio confocal invertido para imagens teciduais em baixa ampliação para gerar alguns mapas 3D cúbicos de centímetros de toda a amostra de tecido adiposo. Após a geração de mapas 3D, use um objetivo de ar de longa distância de 20X que fornece uma boa relação entre a resolução e a profundidade para selecionar várias áreas para amostragem de tecidos em uma ampliação mais elevada. Para segmentação celular, converta pilhas 3D no formato de software para liberar espaço de memória.Antes de abrir o módulo celular do software. Altere a configuração de detecção de células para coloração da membrana plasmática e selecione o canal fluorescente do marcador usado para delinear a periferia celular. Em seguida, configure os limites, forneça uma gama dos tamanhos de células esperados e execute a segmentação.Os efeitos da limpeza no tecido adiposo branco humano e rato podem ser observados a olho nu. A limpeza também melhora drasticamente a profundidade da imagem do tecido que é capaz de ser adquirido. E facilita toda a imagem 3D do tecido e a geração de mapas 3D a partir da ampliação 4X.O mapeamento 3D permite ainda que a seleção de diferentes áreas de interesse seja adquirida a uma ampliação de 20X a uma profundidade de dois milímetros. A coloração específica de gotículas lipídicas e adipócitos pode ser alcançada usando anticorpos perilipin e anti-GLUT4, respectivamente. Os vasos sanguíneos podem ser detectados usando anticorpo CD31 ou injeção intravenosa de Lectin DyLight 649 pouco antes do sacrifício.Macrófagos e células T podem ser visualizados usando anticorpos ficoerrinas anti CD301 e anticorpo azul anti TCR beta Pacífico. A rede nervosa periférica pode ser detectada usando anticorpo anti-tyrosine Hydroxylase. Utilizando essas rotulagens, a distribuição média de tamanho e tamanho dos adipócitos e a densidade da rede dos vasos sanguíneos dentro do tecido adiposo podem então ser determinadas.É crucial seguir o tempo de ocupação como demonstrado, pois a má preparação da amostra não resultará em uma boa qualidade de imagem. Este protocolo pode ser combinado com sistema avançado de imagem ou pode ser acoplado ao freeware de análise de imagem pós-processamento.

Research

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Biology

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