Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Эта работа была поддержана INSERM, Лазурным университетом, и гранты От Французского национального исследовательского агентства (ANR) через Инвестиции в будущее Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), программа UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) через Академию 2 "Комплексы Системеса" и Академия 4 "Комплекс и диверсификация дю Вивант", Фонд за Recherche M'dical (Кипе FRM DE-20180839587), и Программа молодых следователей j.G. (ANR18-CE14-0035-01-01-ГИЛЛЕРОН). Мы также благодарим Основной фонд визуализации C3M, финансируемый Департаментом По делам Альп-морей и РКА, который также поддерживается Микроскопией IBISA и Платформой изображений Лазурный берег (MICA). Мы благодарим Марион Дусзо за техническую помощь в подготовке тканей. Мы благодарим Эбби Каттрис, Международную научную видимость UCA, за доказательство прочтения рукописи.

Этот протокол был протестирован и проверен для всех мышей и человека белые жировые ткани складов. Жировые ткани человека и мыши были собраны соответствующим образом европейским законам и одобрены французскими и шведскими комитетами по этике.
1. Фиксация мыши и человека б?...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

Изменения, которые происходят в жировой ткани в течение патологического прогрессирования, таких как ожирение, имеет основополагающее значение для понимания механизмов, стоящих за патологией. Новаторские исследования, которые показали такие механизмы в жировой ткани были основаны на ...

Ожирение характеризуется увеличением жировой массы тканей и стало одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, учитывая, что люди с ожирением имеют повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа-2, заболеваний печени и некоторых видов рака.
Фундаментальная физиологическая функция жировой ткани заключается в модулировать глюкозу всего тела и липидный гомеостаз1,,2. В период кормления адипоциты (т.е. основные клетки жировой ткани) хранят избыток глюкозы и липидов, предоставляемых при приеме пищи в триглицериды. Во время поста адипоциты распадают триглицериды на неестерифицированные жирные кислоты и глицерол для поддержания спроса на энергию в организме. Во время развития ожирения жировая ткань расширяется за счет увеличения размера (гипертрофии) и/или количества (гиперплазии) адипоцитов1,чтобы увеличить их емкость. Когда расширение жировой ткани достигает своего предела, постоянная высокая переменная среди пациентов, остальные липиды накапливается в других метаболическихорганов,включаямышцы и печень 3,4, что приводит к их функциональной недостаточности и инициирования связанных с ожирениемкардио-метаболических осложнений 1,5. Таким образом, определение механизмов, которые регулируют расширение жировой ткани является ключевой клинической проблемой.
Морфологические изменения, задокументированные в жировых тканях при ожирении, связаны с его патологической дисфункцией. Несколько процедур окрашивания были использованы для описания организации тканей жировой ткани, в том числеактин 6, сосудистыемаркеры 7, липидно-капельныемаркеры 8, и конкретные маркерыиммунных клеток 9,10. Однако, из-за огромного диаметра адипоцитов (от 50 до 200мкм) 11, важно проанализировать большую часть всей ткани в трех измерениях, с тем чтобы точно проанализировать драматические структурные изменения AT наблюдается во время ожирения. Однако, поскольку свет не проникает в непрозрачные ткани, визуализация в 3D в больших образцах тканей с использованием флуоресцентной микроскопии невозможна. Методы очистки тканей, чтобы сделать их прозрачными были зарегистрированы в литературе (для обзора,см. 12), что позволяет очистить ткани и выполнять углубленную, всю ткань флуоресценции микроскопии. Эти методы предлагают беспрецедентные возможности для оценки 3D клеточной организации в здоровых и больных тканях. Каждый из описанных методов имеет преимущества и недостатки, и поэтому должны быть тщательно отобраны в зависимости от изученной ткани (для обзора,см. 13). Действительно, некоторые подходы требуют длительного инкубационный период и / или использование материалов или соединений, которые являются либо дорогими, токсичнымиили трудно получить 14,,15,,16,,17,18,19. Воспользовавшись одним из первых соединений, используемых сто лет назад Вернер Spalteholzдля очистки тканей 20, мы создали удобный и недорогой протокол, который очень хорошо приспособлен для очистки всех мыши и человека жировой ткани складов в любой лаборатории с типичным оборудованием, включая химический капюшон, температура контролируемых орбитальный шейкер и конфокальный микроскоп.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

Ожирение является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, что повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета типа 2 и заболеваний печени. Ожирение характеризуется увеличением жировой ткани (AT) массы из-за гиперплазии адипоцитов и/ или гипертрофии, что приводит к глубокой реконструкции его трехмерной структуры. Действительно, максимальная способность AT расширяться во время ожирения имеет решающее значение для развития связанных с ожирением патологий. Это расширение AT является важным гомеостативным механизмом, позволяющим адаптироваться к избытку потребления энергии и избежать пагубного распространения липидов на другие метаболические органы, такие как мышцы и печень. Таким образом, понимание структурной реконструкции, которая приводит к провалу расширения AT является фундаментальным вопросом с высокой клинической применимостью. В этой статье мы описываем простой и быстрый метод очистки, который обычно используется в нашей лаборатории для изучения морфологии мыши и человеческой белой жировой ткани с помощью флуоресцентных изображений. Этот оптимизированный метод очистки AT легко выполняется в любой стандартной лаборатории, оснащенной химическим капюшоном, контролируемым температурой орбитальным шейкером и флуоресцентным микроскопом. Кроме того, используемые химические соединения легко доступны. Важно отметить, что этот метод позволяет решить 3D AT структуры путем окрашивания различных маркеров специально визуализировать адипоцитов, нейронных и сосудистых сетей, а также врожденные и адаптивные распределения иммунных клеток.

Используя описанную здесь процедуру и обобщенную на рисунке 1,мы смогли окрашивать и оптически очистить белую жировую ткань человека и мыши, представленную на рисунке 2A и рисунке 2Bсоответственно. Очищенная ткань была перенесена в металл...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Здесь мы описываем простой, недорогой и быстрый метод очистки для решения 3D-структуры как мыши, так и человеческой белой жировой ткани, используя комбинацию маркеров для визуализации сосудов, ядер, иммунных клеток, нейронов и белков липидно-капельного слоя с помощью флуоресцентных изображений.

Изучение структуры жировой ткани путем очистки метилсалицилата и 3D-изображения

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Этот протокол позволяет провести анализ трехмерной структуры очень большого человека на мышечную жировую ткань балетной микроскопии. Облегчение связи патологической дисфункции с жировой тканью структурных изменений. Этот процесс очистки очень прост, очень хорошо приспособлены для очистки человека на теплых мышей жировой ткани и использовать менее токсичных растворителей, таких как этанол или метил салицилат по сравнению с другими четкими протоколами.Начните с погружения собранных мыши или человека белой жировой ткани, по крайней мере 10 миллилитров 4%power формальдегида в PBS в 15 миллилитров пластиковой трубки преимущественно под химическим капотом. Встряхните ткань на подвижной пластине при комнатной температуре в течение одного часа, прежде чем передать трубку в подвижной пластины при четырех градусах по Цельсию на ночь. На следующее утро промыть фиксированной белой жировой ткани в 10 миллилитров PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы удалить все следы фиксации и передачи ткани в 15 миллилитров трубки, содержащей 10 миллилитров 0,3% глицина в PBS в течение одного часа инкубации при комнатной температуре на орбитальном шейкере на 100 оборотов в минуту.Когда оставшиеся свободные группы альдегида были утоляются, погрузите ткань в 15 миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров 0,2%Triton X-100 в PBS в течение двух часов инкубации с встряхиванием при 37 градусах по Цельсию. В конце инкубации лечить ткани с 10 миллилитров 0,2%Triton X-100 и 20%DMSO с встряхивания при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующее утро погрузить ткани в 15 миллилитров пластиковой трубки, содержащей 10 миллилитров 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1%deoxycholate и 20%DMSO в PBS, по крайней мере 24 часа инкубации при 37 градусов по Цельсию со тряской.В конце инкубации, промыть ткани с 10 миллилитров 0,2%Triton X-100 в PBS на орбитальном шейкере при 100 оборотов в минуту в течение одного часа. Затем погружение в 15 миллилитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение 12 часов при 37 градусах цельсия при тряске. Для окрашивания белой жировой ткани.Передача ткани в 300 микролитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS, дополненная первичными антителами, представляющими интерес в микротрубке 1,5 миллилитров, защищает ее от света алюминиевой фольгой и поместить трубку в 50-миллилитровую трубку Falcon. Поместите трубку в орбитальный шейкер в течение двух дней инкубации при 37 градусах по Цельсию со тряской. В конце инкубации промыть ткани два раза в 10 миллилитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение пяти часов при 37 градусах по Цельсию с встряхивания и защиты от света.После второго полоскания промыть ткань в 10 миллилитров свежих 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA и PBS в течение 16 до 48 часов при 37 градусах Цельсия при встряхивании, затем перенесите ткань в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую 300 микролитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS, дополненную соответствующими вторичными антителами и защищают трубку от света с помощью алюминиевой фольги. После двухдневной инкубации при 37 градусах по Цельсию на шейкере, мыть ткани два раза в 10 миллилитров 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение пяти часов при 37 градусах по Цельсию с встряхивания защищены от света. После второй стирки, промыть ткани в трубку, содержащую 10 миллилитров свежих 0,2%Triton X-100, 10%DMSO и 3%BSA в PBS в течение 16 до 48 часов при 37 градусов по Цельсию со встряхивания и легкой защиты.Затем два часа мыть в 10 миллилитров PBS только при 37 градусов по Цельсию с встряхивания и легкой защиты. Для очистки белых жировых тканей в конце промывки PBS погрузите ткань и 10 миллилитров восходящей серии концентрации этанола в течение двух часов инкубации на концентрацию при комнатной температуре с встряхиванием, защищенным от света, как указано. На следующее утро погрузите ткань в стеклянную бутылку 20 миллилитров с пластиковой крышкой, содержащей пять миллилитров метилсалицилата в дымовой капюшоне.Белая жировая ткань все еще хорошо видна на данном этапе. Встряхните контейнер защитить его от света при комнатной температуре, по крайней мере два часа. Белая жировая ткань становится полностью пересаженной.Для 3D конфокальных изображений окрашенных и очищенной белой жировой ткани монтируют металлическую камеру визуализации, оснащенную стеклянным дном и в дымовом капюшоне передают ткань в камеру. Заполните камеру свежим метилсалицилатом. Завершите монтаж камеры, добавив небольшой крышкой скольжения для стабилизации ткани и большой крышкой скольжения, чтобы закрыть камеру.Поместите камеру на перевернутую стадию конфокального микроскопа для визуализации тканей при низком увеличении, чтобы создать несколько кубических сантиметров 3D-карт всего образца жировой ткани. После генерации 3D-карты используйте воздушную цель на большие расстояния 20X, которая обеспечивает хорошее соотношение между разрешением и глубиной для выбора нескольких областей для отбора проб тканей при более высоком увеличении. Для сегментации ячеек конвертировать 3D стеки в формат программного обеспечения, чтобы освободить пространство памяти.Перед открытием сотового модуля программного обеспечения. Измените настройку обнаружения клеток на плазменное окрашивание мембраны и выберите флуоресцентный канал маркера, используемый для разграничения периферии клеток. Затем на настройка пороговых значений, обеспечить диапазон ожидаемых размеров ячейки и запустить сегментации.Влияние очистки на человека и мыши белой жировой ткани можно наблюдать невооруженным глазом. Очистка также резко улучшает глубину изображения ткани, которая может быть приобретена. И облегчает целые ткани 3D-изображения и 3D-карты поколения из 4X Увеличение.3D-картирование также позволяет получить выбор различных областей, представляющих интерес, при увеличении 20X на глубину до двух миллиметров. Специфическое окрашивание липидных капель и адипоцитов может быть достигнуто с помощью перилипина и анти-GLUT4 антител соответственно. Кровеносные сосуды могут быть обнаружены с помощью антитела CD31 или внутривенной инъекции Lectin DyLight 649 незадолго до жертвоприношения.Макрофаги и Т-клетки могут быть визуализированы с помощью анти CD301 фикоэритрона антитела и анти TCR бета Тихоокеанского синего антитела. Периферическая нервная сеть может быть обнаружена с помощью антитирозин гидроксилазы антитела. С помощью этих маркировки можно определить средний размер и размер распределения адипоцитов и плотность сети кровеносных сосудов в жировой ткани.Очень важно следить за временем занятий, как это было продемонстрировано, потому что плохая подготовка образца не приведет к хорошему качеству изображения. Этот протокол можно комбинировать с передовой системой визуализации или может быть соединен с бесплатным анализом изображений после обработки изображений.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: Биологическая ткань Очистка и иммунноокрашивания Методы визуализации Volume

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Подготовка образцов и изображений Exosomes, просвечивающей электронной микроскопии

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Оптическая очистка тканей растений для флуоресцентной визуализации

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции из белой жировой ткани мыши с помощью тканевого диссоциатора

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...