Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Detta arbete stöddes av INSERM, Université Côte d'Azur, och genom bidrag från den franska nationella forskningsbyrån (ANR) genom Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes" och Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), och Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi tackar också Imaging Core Facility of C3M som finansieras av Conseil Départemental des Alpes-Maritimes och Région PACA, och som också stöds av IBISA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Vi tackar Marion Dussot för teknisk hjälp vid vävnadsberedning. Vi tackar Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, för korrekturläsning av manuskriptet.

Detta protokoll testades och är validerat för alla mus och mänskliga vita fettvävnad depåer. Human- och mus-fettvävnader samlades in i enlighet med europeiska lagar och godkändes av franska och svenska Etiska kommittéer.
1. Fixering av mus och human vit fettvävnad
<ol><li>Sänk ned de skördade mus- eller humanvita fettvävnaderna i minst 10 mL PBS innehållande 4% paraformaldehyd (PFA) i ett 15 mL plaströr.</li>
	<li>Skaka plaströret i rumstemperatur på en rullande platta i 1 h....

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

De modifieringar som sker inom fettvävnaden under loppet av patologisk progression, såsom fetma, är grundläggande för förståelsen av mekanismerna bakom patologin. Banbrytande studier som avslöjade sådana mekanismer i fettvävnad har baserats på globala tillvägagångssätt såsom hela fettvävnaden proteomik21, flödescytometri22,23, och transkriptomik24,25. Dessutom har ...

Fetma kännetecknas av en ökning av fettvävnad massa och har blivit en stor världsomspännande folkhälsofråga, med tanke på att personer med fetma har ökad risk att utveckla hjärt-kärlsjukdom, typ-2 diabetes, leversjukdomar och vissa cancerformer.
En grundläggande fysiologisk funktion av fettvävnad är att modulera hela kroppen glukos och lipid homeostas1,2. Under utfodringsperioden lagrar adipocyterna (dvs. de viktigaste cellerna i fettvävnaden) överskottet av glukos och lipider som en måltid tillhandahåller i triglycerider. Under fasta, adipocyterna bryta ner triglycerider till icke-förestrad fettsyror och glycerol att upprätthålla energibehovet av kroppen. Under utvecklingen av fetma, fettvävnad expandera genom att öka storleken (hypertrophia) och /eller antalet (hyperplasi) av adipocyter1, för att öka deras lagringskapacitet. När utbyggnaden av fettvävnad når sin gräns, en konstant mycket varierande bland patienter, de återstående lipider ackumuleras i andra metaboliska organ inklusive muskler och lever3,4, vilket leder till deras funktionella misslyckande och initierar fetma-relaterade hjärt-metaboliska komplikationer1,5. Därför är det en viktig klinisk utmaning att identifiera de mekanismer som styr fettvävnadsexpansion.
De morfologiska modifieringarna som dokumenteras inom fettvävnader under fetma är kopplade till dess patologiska dysfunktion. Flera färgningsprocedurer har använts för att beskriva vävnadsorganisationen av fettvävnaden, inklusive aktin6, kärlmarkörer7, lipid-droplet markörer8, och specifika immun cell markörer9,10. Men på grund av den enorma diametern av adipocyter (50 till 200 μm)11, är det viktigt att analysera en stor del av hela vävnaden i tre dimensioner för att exakt analysera de dramatiska strukturella AT förändringar som observerats under fetma. Men eftersom ljuset inte penetrerar en ogenomskinlig vävnad, är bildbehandling i 3D inom en stor vävnadsprover med hjälp av fluorescensmikroskopi inte möjligt. Metoder för vävnad clearing för att göra dem transparenta har rapporterats i litteraturen (för en översyn,se 12) tillåter en att rensa vävnader och att utföra djupgående, hela vävnad fluorescens mikroskopi. Dessa metoder erbjuder oöverträffade möjligheter att bedöma 3D cellulära organisationen i friska och sjuka vävnad. Var och en av de beskrivna metoderna har fördelar och nackdelar, och behöver därför väljas noggrant beroende på den studerade vävnaden (för en genomgång, se13). Vissa tillvägagångssätt kräver faktiskt en lång inkubationstid och/eller användning av material eller föreningar som antingen är dyra, giftiga eller svåra att fåtag på 14,15,16,17,18,19. Dra nytta av en av de första föreningarna som används för ett sekel sedan av Werner Spalteholz att rensa vävnader20, vi inrätta en användarvänlig och billig protokoll som är mycket väl anpassad för röjning av alla mus och mänskliga fettvävnad depåer i alla laboratorium med typisk utrustning inklusive en kemisk huva, en temperatur-kontrollerade orbital shaker och ett konfokalt mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

Fetma är en stor världsomspännande folkhälsofråga som ökar risken för att utveckla hjärt-kärlsjukdomar, typ-2 diabetes, och leversjukdomar. Fetma kännetecknas av en ökning av fettvävnad (AT) massa på grund av adipocyte hyperplasi och/eller hypertrophia, vilket leder till djupgående remodeling av dess tredimensionella struktur. Faktum är att maximal kapacitet AT att expandera under fetma är avgörande för utvecklingen av fetma-associerade patologier. Detta AT expansion är en viktig homeostatisk mekanism för att möjliggöra anpassning till ett överskott av energiintag och för att undvika skadliga lipid spillover till andra metaboliska organ, såsom muskler och lever. Därför är förståelsen av den strukturella ombyggnad som leder till misslyckandet med AT-expansion en grundläggande fråga med hög klinisk tillämplighet. I den här artikeln beskriver vi en enkel och snabb clearing metod som rutinmässigt används i vårt laboratorium för att utforska morfologi av mus och mänskliga vita fettvävnad genom fluorescerande avbildning. Denna optimerade AT-clearingmetod utförs enkelt i alla vanliga laboratorium som är utrustade med en kemisk huva, en temperaturkontrollerad orbitalskaktor och ett fluorescerande mikroskop. Dessutom är de kemiska föreningar som används lätt tillgängliga. Viktigt, denna metod gör det möjligt för en att lösa 3D AT struktur genom färgning olika markörer för att specifikt visualisera adipocyter, neuronala och vaskulära nätverk, och den medfödda och adaptiva immunceller distribution.

Använda förfarandet som beskrivs här och sammanfattas i figur 1, kunde vi fläcka och optiskt klart mänskliga och mus vit fettvävnad som presenteras i figur 2A och figur 2B, respektive. Den rensade vävnaden överfördes till metallisk bildbehandlingskammaren för att utföra konfokal avbildning (Bild 3A). Röjningen förbättrade drastiskt djupet på de vävnadsbilder som vi kunde skaffa (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Här beskriver vi en enkel, billig och snabb clearing metod för att lösa 3D-strukturen för både mus och mänskliga vita fettvävnad med hjälp av en kombination av markörer för att visualisera vasculature, kärnor, immunceller, nervceller och lipid-droplet coat proteiner genom fluorescerande imaging.

Exploring Adipose Tissue Structure genom Metylsalicylate Clearing och 3D-avbildning

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Dessa protokoll möjliggör analys av tredimensionell struktur av Mycket stor människa på mus fettvävnad balett mikroskopi. Underlätta kopplingen av patologisk dysfunktion med fettvävnad strukturella förändringar. Denna clearingprocess är mycket enkel, mycket väl anpassad för att rensa människa på varma möss fettvävnad och använda mindre giftiga lösningsmedel såsom etanol eller metylsalicylat jämfört med andra tydliga protokoll.Börja med att fördjupa den skördade musen eller mänskliga vita fettvävnad i minst 10 milliliter av 4%power formaldehyd i PBS i en 15 milliliter plaströr företrädesvis under en kemisk huva. Skaka vävnaden på en rullande platta i rumstemperatur i en timme innan du överför röret till en rullande platta vid fyra grader Celsius över natten. Nästa morgon skölj den fasta vita fettvävnaden i 10 milliliter PBS i fem minuter vid rumstemperatur för att avlägsna alla spår av fixativ och överföra vävnaden till ett 15 milliliterrör som innehåller 10 milliliter på 0,3%glycin i PBS för en timmes inkubation vid rumstemperatur på en orbitalskak på 100 varv per minut.När de återstående fria aldehydgrupperna har släckts, sänk ner vävnaden i ett 15 milliliterrör som innehåller 10 milliliter på 0,2%Triton X-100 i PBS för en två timmars inkubation med skakningar vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen behandla vävnaden med 10 milliliter av 0,2%Triton X-100 och 20%DMSO med skakningar vid 37 grader Celsius över natten. Nästa morgon sänk ner vävnaden i ett 15 milliliter plaströr som innehåller 10 milliliter på 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1%deoxicholat och 20%DMSO i PBS för en minst 24 timmars inkubation vid 37 grader Celsius med skakningar.Vid slutet av inkubationen sköljer du vävnaden med 10 milliliter på 0,2%Triton X-100 i PBS på en orbitalskakapparat vid 100 varv per minut under en timme. Följt av nedsänkning i 15 milliliter på 0,2%Triton X-100, 10%DMSO och 3%BSA i PBS i 12 timmar vid 37 grader Celsius med skakningar. För färgning av den vita fettvävnaden.Överför vävnaden till 300 mikroliter av 0,2%Triton X-100, 10%DMSO och 3%BSA i PBS, kompletterad med de primära antikropparna av intresse i ett 1,5 milliliter mikrorör skydda den från ljus med aluminiumfolie och placera röret i en 50 milliliter Falcon röret. Placera röret i orbital shaker för en två dagars inkubation på 37 grader Celsius med skakningar. Vid slutet av inkubationen skölj vävnaden två gånger i 10 milliliter på 0,2%Triton X-100, 10%DMSO och 3%BSA i PBS i fem timmar vid 37 grader Celsius med skakningar och skydd mot ljus.Efter den andra sköljtvätta vävnaden i 10 milliliter färska 0,2%Triton X-100, 10%DMSO och 3%BSA och PBS i 16 till 48 timmar vid 37 grader Celsius med skakningar, sedan överföra vävnaden till en 1,5 milliliter rör som innehåller 300 mikroliter av 0,2%Triton X-100, 10%DMSO och 3%BSA i PBS, kompletteras med lämpliga sekundära antikroppar och skydda röret från ljus med hjälp av aluminiumfolie. Efter en två dagars inkubation vid 37 grader Celsius på en shaker, tvätta vävnaden två gånger i 10 milliliter på 0,2%Triton X-100, 10%DMSO och 3%BSA i PBS i fem timmar vid 37 grader Celsius med skakningar skyddas från ljus. Efter den andra tvätten, skölj vävnaden i ett rör som innehåller 10 milliliter färska 0,2%Triton X-100, 10%DMSO och 3%BSA i PBS i 16 till 48 timmar vid 37 grader Celsius med skakningar och ljusskydd.Följt av en två timmars tvätt i 10 milliliter PBS ensam vid 37 grader Celsius med skakningar och ljusskydd. För vit fettvävnadsclearing i slutet av PBS-tvätten sänk ner vävnaden och 10 milliliter av en stigande sändande etanolkoncentrationsserie för en två timmars inkubation per koncentration vid rumstemperatur med skakningar skyddade från ljus som anges. Nästa morgon doppa vävnaden i en 20 milliliter glasflaska med en plastlock som innehåller fem milliliter metylsalicylat i en rök huva.Den vita fettvävnaden syns fortfarande tydligt i detta skede. Skaka behållaren skydda den mot ljus i rumstemperatur i minst två timmar. Den vita fettvävnaden blir helt transplantation.För 3D confocal avbildning av den färgade och rensade vita fettvävnad montera en metallisk bildbehandling kammare utrustad med en glasbotten och i en rök huva överföra vävnaden till kammaren. Fyll kammaren med färskt metylsalicylat. Sluta monteringen av kammaren genom att lägga till en liten lucka för att stabilisera vävnaden och en stor täcksli för att stänga kammaren.Placera kammaren på en inverterad konfokalmikroskop skede för vävnadsavbildning vid låg förstoring för att generera några kubikcentimeter 3D-kartor över hela fettvävnadsprovet. Efter 3D-kartgenerering, använd en 20X långdistansluftsmålsättning som ger ett bra förhållande mellan upplösningen och djupet för att välja flera områden för vävnadsprovtagning vid en högre förstoring. För cell segmentering konvertera 3D-stackar på programvaran format för att frigöra minnesutrymme.Innan du öppnar cellmodulen i programvaran. Ändra celldetekteringsinställningen till plasmamembranfärgning och välj den fluorescerande kanal för markören som används för att avgränsa cellens periferi. Ställ sedan in tröskelvärdena, ge ett intervall av de förväntade cellstorlekarna och kör segmenteringen.De påverkar av clearing på människa och mus vit fettvävnad kan observeras med blotta ögat. Clearing förbättrar också drastiskt bilddjupet i den vävnad som är kunna förvärvas. Och underlättar hela vävnad 3D-avbildning och 3D-karta generation av 4X Förstoring.3D-kartläggning möjliggör vidare val av olika intresseområden att förvärvas vid en 20X förstoring till ett djup av två millimeter. Specifik färgning av lipiddroppar och adipocyter kan uppnås med hjälp av perilipin respektive anti-GLUT4-antikroppar. Blodkärl kan detekteras med hjälp av antingen CD31-antikropp eller intravenös injektion av Lectin DyLight 649 strax före offer.Makrofager och T-celler kan visualiseras med hjälp av anti CD301 phycoerythrin antikropp och anti TCR beta Pacific blå antikropp. Det perifera nervnätverket kan detekteras med hjälp av anti tyrosin Hydroxylas antikropp. Med hjälp av dessa märkningar kan man sedan bestämma medelstorlek och storleksfördelning för adipocyterna och blodkärlens nätverkstäthet inom fettvävnaden.Det är viktigt att följa ockupationstiden som visat eftersom dålig provberedning inte kommer att resultera i en bra bildkvalitet. Detta protokoll kan kombineras med avancerat bildsystem eller kan kopplas till efterbearbetning bildanalys freeware.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: biologisk vävnad Clearing och immunomärkning Metoder för Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Provberedning och avbildning av Exosomes av transmissionselektronmikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vävnad Clearing metod för tredimensionell avbildning av fettvävnad

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optisk röjning av växtvävnader för fluorescensavbildning

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halvautomatisk isolering av den stromala vaskulära fraktionen från murin vit fettvävnad med användning av en vävnadsdissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...