Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Bu çalışma INSERM tarafından desteklenmiştir, Université Côte d'Azur ve Gelecek Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), program UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) Akademi 2 "Systèmes Complexes" ve Akademi 4 "Complexité dalgıç etsité ant revivant du", için Yatırımlar aracılığıyla Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) hibeleri ile, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) ve J.G.'ye Genç Araştırmacı Programı (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes ve Région PACA tarafından finanse edilen ve IBISA Mikroskobu ve Görüntüleme Platformu Côte d'Azur (MICA) tarafından desteklenen C3M'nin Görüntüleme Çekirdek Tesisine de teşekkür ederiz. Marion Dussot'a doku hazırlığında teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Abby Cuttriss, UCA Uluslararası Bilimsel Görünürlük, makalenin kanıt okuma için teşekkür ederiz.

Bu protokol test edildi ve tüm fare ve insan beyaz yağ dokusu depoları için doğrulanmıştır. İnsan ve fare yağ dokuları Avrupa yasalarına göre toplanmış ve Fransız ve İsveç Etik komiteleri tarafından onaylanmıştır.
1. Fare ve insan beyaz yağ dokusufiksasyonu
<ol><li>Hasat edilen fareyi veya insan beyaz yağ dokularını 15 mL plastik tüpe %4 paraformaldehit (PFA) içeren en az 10 mL PBS'ye batırın.</li>
	<li>1 saat boyunca bir haddeleme plaka üzerinde oda sıcaklı?...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

Obezite gibi patolojik ilerleme boyunca yağ dokusu içinde meydana gelen değişiklikler, patolojinin arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasında temel dir. Yağ dokusunda bu tür mekanizmaları ortaya öncü çalışmalar gibi tüm yağ dokusu proteomics21gibi küresel yaklaşımlara dayalı olmuştur , akış sitometri22,23, ve transkripsiyon24,25. Buna ek olarak, histolojik ...

Obezite yağ dokusu kütlesinde bir artış ile karakterizedir ve önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunu haline gelmiştir, obezite olan kişilerin kardiyovasküler hastalık gelişme riskini artırdığı göz önüne alındığında, tip-2 diyabet, karaciğer hastalıkları ve bazı kanserler.
Yağ dokusunun temel fizyolojik fonksiyonu tüm vücut glikoz ve lipid homeostazı modüle etmektir1,2. Beslenme döneminde, adipositler (yani, yağ dokusunun ana hücreleri) trigliserid içine bir yemek tarafından sağlanan glikoz ve lipidlerin aşırı depolar. Oruç sırasında, adipositler vücudun enerji talebini sürdürmek için esterleştirilmiş olmayan yağ asitleri ve gliserol içine trigliserid yıkmak. Obezite gelişimi sırasında, yağ dokusu büyüklüğü artırarak genişletmek (hipertrophi) ve / veya sayı (hiperplazi) adipositler1, depolama kapasitesini artırmak için. Yağ dokusunun genişlemesi sınırına ulaştığında, hastalar arasında sürekli bir son derece değişken, kalan lipidler kas ve karaciğer 3 dahil olmak üzere diğer metabolik organlara birikir3,4, fonksiyonel yetmezliğine yol açan ve obezite ile ilgili kardiyo-metabolik komplikasyonlar başlatılması1,5. Bu nedenle, yağ dokusu genişlemesi yöneten mekanizmaların belirlenmesi önemli bir klinik sorundur.
Obezite sırasında yağ dokularında belgelenen morfolojik modifikasyonlar patolojik disfonksiyonu ile bağlantılıdır. Çeşitli boyama prosedürleri adipoz doku organizasyonu tanımlamak için kullanılmıştır, aktin dahil6, vasküler belirteçleri7, lipid damlacık belirteçleri8, ve spesifik bağışıklık hücre belirteçleri9,10. Ancak, adipositlerin büyük çapı nedeniyle (50-200 μm)11, obezite sırasında gözlenen dramatik yapısal AT değişiklikleri doğru analiz etmek için üç boyutlu tüm doku büyük bir bölümünü analiz etmek esastır. Ancak, ışık opak bir doku nüfuz etmez çünkü, floresan mikroskopi kullanarak büyük bir doku örnekleri içinde 3D görüntüleme mümkün değildir. Doku temizleme yöntemleri onları şeffaf hale getirmek için literatürde bildirilmiştir (bir inceleme için, bakınız12) dokuları temizlemek ve derinlemesine gerçekleştirmek için izin, tüm doku floresan mikroskopi. Bu yöntemler sağlıklı ve hastalıklı dokuda 3D hücresel organizasyonu değerlendirmek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Açıklanan yöntemlerin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır ve bu nedenle incelenen dokuya bağlı olarak dikkatle seçilmesi gerekir (gözden geçirme içinbkz. 13). Nitekim, bazı yaklaşımlar uzun bir kuluçka dönemi ve / veya pahalı, toksik ya da 14,15,16,,17,18,19elde etmek zor malzeme veya bileşiklerin kullanımını gerektirir.19 Bir yüzyıl önce Werner Spalteholz tarafından dokuları temizlemek için kullanılan ilk bileşiklerden birinden yararlanarak20, biz çok iyi bir kimyasal başlık, bir sıcaklık kontrollü orbital shaker ve konfokal mikroskop da dahil olmak üzere tipik ekipman ile herhangi bir laboratuvarda tüm fare ve insan yağ dokusu depolarının temizlenmesi için uyarlanmış bir kullanıcı dostu ve ucuz protokol kurmak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

Obezite kardiyovasküler hastalıklar, tip-2 diyabet ve karaciğer hastalıkları geliştirmek için risk artar önemli bir dünya çapında halk sağlığı sorunudur. Obezite, adiposit hiperplazi ve/veya hipertrophiye bağlı yağ dokusu (AT) kütlesindeki artış ile karakterizedir ve üç boyutlu yapısının derin bir şekilde yenilenmesine yol açar. Gerçekten de, obezite sırasında genişletmek için AT maksimal kapasitesi obezite ile ilişkili patolojilerin gelişimi için çok önemlidir. Bu AT genişleme ve enerji alımının aşırı adaptasyon sağlamak için önemli bir homeostatik mekanizma diğer metabolik organlara zararlı lipid dökülmesini önlemek için, kas ve karaciğer gibi. Bu nedenle, AT genişlemesinin başarısızlığına yol açan yapısal yeniden şekillendirmenin anlaşılması, yüksek klinik uygulanabilirliği olan temel bir sorudur. Bu makalede, floresan görüntüleme ile fare ve insan beyaz yağ dokusunun morfolojisini keşfetmek için rutin olarak laboratuarımızda kullanılan basit ve hızlı bir temizleme yöntemini açıklıyoruz. Bu optimize AT temizleme yöntemi kolayca bir kimyasal başlık, sıcaklık kontrollü orbital shaker ve floresan mikroskop ile donatılmış herhangi bir standart laboratuvarda gerçekleştirilir. Ayrıca, kullanılan kimyasal bileşikler kolayca kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu yöntem özellikle adipositler, nöronal ve vasküler ağlar ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücreleri dağılımı görselleştirmek için çeşitli belirteçleri boyama tarafından 3D AT yapısını çözmek için izin verir.

Burada açıklanan ve Şekil 1'deözetlenen prosedürü kullanarak, şekil 2A ve Şekil 2B'desunulan insan ve fare beyaz yağ dokusunu sırasıyla lekelebildik ve optik olarak temizleyebildik. Temizlenen doku konfokal görüntüleme yapmak için metalik görüntüleme odasına transfer edildi(Şekil 3A). Açıklık, elde edebildiğimiz doku görüntülerinin derinliğini büyük ölçüde iyileştirmiş...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Burada, hem fare hem de insan beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu yapısını çözüme kavuşturmak için basit, ucuz ve hızlı bir temizleme yöntemi tanımlıyoruz.

Metiyatisilin Temizleme ve 3D Görüntüleme ile Yağ Dokusu Yapısının Araştırılması

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Bu protokol fare yağ dokusu bale mikroskopisi üzerinde çok büyük insan üç boyutlu yapısının analizini sağlar. Patolojik disfonksiyonun yağ dokusu yapısal değişiklikleri ile bağlantısını kolaylaştırmak. Bu temizleme işlemi çok basit, çok iyi sıcak fareler yağ dokusu üzerinde insan temizleme ve diğer açık protokollere göre etanol veya metil salisilat gibi daha az toksik çözücü kullanmak adapte.Hasat edilen fareyi veya insan beyaz yağ dokusunu pbs'de %4 güç formaldehitinin en az 10 mililitrelik bir kimyasal kaputun altında tercihen 15 mililitrelik plastik tüpe batırarak başlayın. Bir gece boyunca dört derece santigrat bir haddeleme plaka tüpü transfer etmeden önce bir saat oda sıcaklığında bir haddeleme plaka üzerinde doku sallayın. Ertesi sabah sabit beyaz yağ dokusunu oda sıcaklığında 10 mililitre pBS'de beş dakika boyunca durulayın ve sabitleme nin tüm izlerini ortadan kaldırın ve dokuyu PBS'de 10 mililitrelik glisin içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dakikada 100 devirde bir orbital shaker'da oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için.Kalan serbest aldehit grupları söndürüldüğünde, 37 santigrat derecede sallayarak iki saat kuluçka için PBS 0,2% Triton X-100 10 mililitre içeren 15 mililitrelik bir tüp doku batırın. Kuluçka sonunda bir gecede 37 derece santigrat sallayarak 0.2% Triton X-100 ve% 20 DMSO 10 mililitre ile doku tedavi. Ertesi sabah 15 mililitrelik plastik tüp içeren bir doku batırın 10 mililitre 0.1% Tween 20, 0.1% Triton X-100, 0.1% deoksicholate ve 20% DMSO PBS en az 24 saat kuluçka için 37 derece santigrat ile sallayarak.Kuluçka sonunda, bir saat boyunca dakikada 100 devrimler bir orbital shaker bir orbital shaker pbs 0,2% Triton X-100 10 mililitre ile doku durulayın. 15 mililitre de daldırma takip 0.2%Triton X-100, 10% DMSO ve 3% BSA PBS 12 saat boyunca 37 derece santigrat titreme ile. Beyaz yağ dokusunun boyanmak için.Doku transferi içine 300 mikrolitre içine 0.2%Triton X-100, 10% DMSO ve PBS% 3 BSA, bir 1.5 mililitremikro tüp ilgi birincil antikorları ile takviye alüminyum folyo ile ışık tan korumak ve 50 mililitrelik şahin tüp içine tüp yerleştirin. Sallayarak 37 santigrat derece iki günlük kuluçka için orbital shaker içine tüp yerleştirin. Kuluçka sonunda doku yutuculuk ile 10 mililitre de iki kez durulayın 0.2%Triton X-100, 10%DMSO ve PBS 3% BSA beş saat boyunca 37 derece santigrat sallayarak ve ışıktan koruma ile.İkinci durulama sonra taze 10 mililitre doku yıkayın sonra 0.2%Triton X-100, 10% DMSO ve 3% BSA ve PBS 16 ila 48 saat için 37 derece santigrat titreme ile, daha sonra 0.2% Triton X-100 300 mikrolitre içeren 1.5 mililitre tüp doku transferi, 10%DMSO ve PBS% 3 BSA, uygun ikincil antikorlar ile takviye ve alüminyum folyo kullanarak ışık tan tüp korumak. Bir shaker üzerinde 37 derece santigrat bir iki gün kuluçka sonra, ışıktan korunan sallayarak sallayarak 37 santigrat beş saat boyunca PBS% 0.2 Triton X-100, % 10 DMSO ve 3% BSA 10 mililitre doku iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, sallayarak ve ışık koruması ile 37 santigrat derecede 16 ila 48 saat pbs taze% 0.2 Triton X-100, 10% DMSO ve 3% BSA 10 mililitre içeren bir tüp içine doku durulayın.Sallayarak ve ışık koruması ile 37 santigrat derece tek başına PBS 10 mililitre iki saat yıkama izledi. PBS sonunda beyaz yağ dokusu temizleme için doku ve artan bir etanol konsantrasyonu serisi 10 mililitre oda sıcaklığında konsantrasyon başına iki saat kuluçka için ışıktan korunan titreme ile daldırma. Ertesi sabah bir duman kaputunda metil salisilat beş mililitre içeren plastik bir kap ile 20 mililitrelik cam şişe doku batırın.Beyaz yağ dokusu hala açıkça bu aşamada görülebilir. Kabı oda sıcaklığında en az iki saat Boyunca ışıktan koruyun. Beyaz yağ dokusu tamamen nakil olur.Vitray lı ve temizlenmiş beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu konfokal görüntülemesi için, cam bir alt ve duman kaputunda bulunan metalik bir görüntüleme odası nın montajı dokuyu odaya aktarın. Odayı taze metil salisilatla doldurun. Dokuyu stabilize etmek için küçük bir kapak fişi ve odayı kapatmak için büyük bir kapak fişi ekleyerek haznenin montajını kesinleştirin.Tüm yağ dokusu örneğinin birkaç santimetreküp 3D haritaları oluşturmak için düşük büyütme doku görüntüleme için ters bir konfokal mikroskop aşamasıüzerine oda yerleştirin. 3B harita oluşumundan sonra, daha yüksek bir büyütmede doku örneklemesi için çeşitli alanları seçmek için çözünürlük ve derinlik arasında iyi bir oran sağlayan 20X uzun mesafe hava hedefi kullanın. Hücre bölümleme için bellek alanı boşaltmak için yazılım biçimiüzerine 3B yığınları dönüştürün.Yazılımın hücre modüllerini açmadan önce. Hücre algılama ayarını plazma membran boyama ile değiştirin ve hücre çevresini belirlemek için kullanılan işaretçinin floresan kanalını seçin. Ardından eşikleri ayarlayın, beklenen hücre boyutları aralığını sağlayın ve segmentasyonu çalıştırın.İnsan ve fare beyaz yağ dokusu nun temizlenmesinin etkileri çıplak gözle görülebilir. Takas aynı zamanda elde edilebilir doku görüntü derinliğini önemli ölçüde artırır. Ve tüm doku 3D görüntüleme ve 4X Büyütme dışında 3D harita üretimi kolaylaştırır.3D haritalama, 20 X büyütme de iki milimetre derinliğe kadar farklı ilgi alanlarının seçilmesini sağlar. Lipid damlacıkları ve adipositlerin spesifik boyanması sırasıyla perilipin ve anti-GLUT4 antikorları kullanılarak elde edilebilir. Kan damarları kurban dan kısa bir süre önce CD31 antikor veya Lectin DyLight 649 intravenöz enjeksiyonu kullanılarak tespit edilebilir.Makrofajlar ve T-hücreleri anti CD301 phycoerythrin antikor ve anti TCR beta Pasifik mavi antikor kullanılarak görselleştirilebilir. Periferik sinir ağı anti Tirozin Hidroksilaz antikor kullanılarak tespit edilebilir. Bu etiketler kullanılarak adipositlerin ortalama boyut ve boyut dağılımı ve yağ dokusu içindeki kan damarı ağ yoğunluğu daha sonra belirlenebilir.Kötü numune hazırlama iyi bir görüntü kalitesi neden olmaz, çünkü gösterildiği gibi meslek zamanı takip etmek çok önemlidir. Bu protokol gelişmiş görüntüleme sistemi ile kombine edilebilir veya post-processing görüntü analizi freeware ile birleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: Biyolojik Doku Takas ve Hacim Görüntüleme için ile immün Yöntemleri

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Floresan Görüntüleme için Bitki Dokularının Optik Temizlenmesi

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...