Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة [R01GM121847]؛ مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان (MSKCC) منحة الدعم / المنحة الأساسية (P30 CA008748); ومبادرة MSKCC لعلم الجينوم الوظيفي.

1. جيل مراسل مرنا
<ol><li>تعديل قالب نسخ الحمض النووي الذي يشفر "untagged" مراسل mRNA السائبة عن طريق إدراج تسلسل ترميز العلامة N-terminus لإنشاء قالب نسخ الحمض النووي لمراسل "الموسومة" مرنا (الشكل 2A). ملاحظة: يوصى بتفاعل 3xFLAG/anti-FLAG لهذا المقايسة نظرا لحساسية الفائقة وطول العلامة 3xFLAG القص?...

بالمقارنة مع التجارب النموذجية في المختبر TIRF جزيء واحد، والتصوير جزيء واحد مع المقايسة الموصوفة هنا معقدة بالإضافة إلى ذلك بسبب استخدام استخراج الخلية وتركيز عال من الأجسام المضادة المسمى فلوريا. بالمقارنة مع الممارسة الأكثر شيوعا لجولة واحدة من PEGylation السطح، جولة ثانية من PEGylation (ال...

الترجمة في أنظمة eukaryotic يحدث في الغالب من خلال 7-ميثيلguanosine (م7G) مسارات تعتمد على الغطاء1. تشير الدراسات إلى أن الخطوة الأولى للترجمة eukaryotic هو الحد من معدل وهدف مشترك للائحة2،3،4. وقد درست آليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى على نطاق واسع باستخدامالوراثية 5، البيوكيميائية6،7،8،الهيكلية 9، والجينومية10 النهج السائبة. وعلى الرغم من أن هذه الأساليب قد حددت آليات متنوعة تنظم البدء المعتمد على الحد الأقصى، فإن حلها يقصرها على مجموعة متوسط الإشارات من أحداث البدء غير المتجانسة وغير المتزامنة. في الآونة الأخيرة ، تم تصور الفردية في أحداث الترجمة في الجسم الحي من خلال الأساليب التي تقيس الأجسام المضادة الفلورية ملزمة لepitopes على polypeptidesالوليدة 11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن هذه النهج الجديدة محدودة أيضا في قدرتها على حل أحداث البدء الفردية لأن الأجسام المضادة الفلورية المتعددة يجب أن تربط الببتيد الوليد للسماح بحل أحداث الترجمة الفردية من خلفية مفلورة عالية داخل الخلايا. في العديد من التفاعلات البيولوجية، قدمت الأحداث الحركية الفردية التي تم حلها رؤى حاسمة لفهم العمليات البيولوجية المعقدة متعددة الخطوات والمتكررة التي لا يمكن مزامنتها على المستوى الجزيئي. هناك حاجة إلى أساليب جديدة يمكنها تتبع ديناميكيات أحداث الترجمة الفردية من أجل فهم أفضل للبدء والتنظيم المعتمدين على الحد الأقصى.
قمنا مؤخرا بتطوير اختبار في المختبر يقيس الحركية بدء تعتمد على الغطاء مع قرار جزيء واحد15. وبالنظر إلى العدد الكبير من عوامل البروتين المعروفة وغير المعروفة المشاركة في مسار البدء هذا3،16، تم تطوير المقايسة أحادية الجزيء لتكون متوافقة مع أنظمة الترجمة الخالية من الخلايا المختبرية الحالية للاستفادة من الحفاظ على العوامل الخلوية ونشاط الترجمة القوي17و18و19و20و21و22و23و24و25. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نظم الترجمة الخالية من الخلايا يتيح إجراء مقارنات أكثر توافقا بين الملاحظات أحادية الجزيء والنتائج السائبة السابقة. يوفر هذا النهج تكاملا مباشرا بين الرؤى الحركية الجديدة أحادية الجزيء في الإطار الآلي الحالي للبدء المعتمد على الغطاء. لإنشاء المقايسة أحادية الجزيء، يتم تعديل نظام الترجمة التقليدية الخالية من الخلايا بثلاث طرق: يتم إدخال تسلسل ترميز الظهارة في بداية إطار القراءة المفتوح (ORF) لمراسل مرنا. 3' نهاية مراسل مرنا هو البيوتينيلات لتسهيل مرنا نهاية الربط إلى سطح الكشف عن جزيء واحد; ويتم استكمال الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لمخرج الترجمة. تتطلب هذه التعديلات فقط تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية والكواشف المتاحة عادة. وعلاوة على ذلك، تحافظ هذه التعديلات وظروف التصوير أحادية الجزيء على الحركية التحريرية لتفاعلات الترجمة السائبة الخالية من الخلايا15.
في هذا المقايسة (الشكل 1), 5′-نهاية توج و 3′-end مراسل biotinylated مرنا هو شلت إلى سطح الكشف streptavidin المغلفة في غرفة تدفق. ثم تمتلئ غرفة التدفق بخليط ترجمة خال من الخلايا تكمله أجسام مضادة تحمل علامة fluorescently. بعد ترجمة مرنا قد حدث لحوالي 30-40 codons المصب من تسلسل epitope26،27، وepitope يخرج من نفق الخروج ريبوسوم ويصبح من السهل الوصول إليها للتفاعل مع الأجسام المضادة المسمى fluorescently. هذا التفاعل سريع والكشف عنه عن طريق تقنيات التصوير الفلوري أحادي الجزيء يتيح تتبع حركية الترجمة بدقة جزيء واحد أثناء الترجمة النشطة الخالية من الخلايا. وينبغي أن يفيد هذا المقايسة على نطاق واسع في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، ولا سيما بالنسبة للأنظمة التي تعمل بكميات كبيرة في الفحص المختبري.
شرط أساسي لإنشاء هذا المقايسة جزيء واحد هو العمل السائبة الخلية خالية من ترجمة المقايسة، والتي يمكن تحقيقها باستخدام استخراج الترجمة التي هي إما متاحة تجاريا أو أعدت باتباع الأساليب الموصوفة سابقا28. يمكن الحصول على استخراج الترجمة Eukaryotic من خلايا متنوعة، بما في ذلك الفطرية والثدييات والنبات28. للتصوير، يتطلب هذا الفحص مجهر TIRF مجهز بكثافة الليزر غير القادرة وزاوية الحادث، ومرحلة عينة مزودة بمحرك، ونظام سوائل آلي، وجهاز التحكم في درجة الحرارة العينة. هذه المتطلبات هي عامة للتجارب الحديثة في المختبر TIRF جزيء واحد ويمكن تحقيقها بشكل مختلف. تستخدم التجربة المعروضة هنا نظام TIRF من النوع الموضوعي يتكون من المجهر والبرامج والملحقات المتاحة تجاريا والمدرجة جميعها في جدول المواد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

تخليق البروتين المعتمد على الغطاء هو مسار الترجمة السائد في الخلايا النواة. وفي حين سمحت مختلف النهج الكيميائية الحيوية والجينية بإجراء دراسات مستفيضة للترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، لا يزال هناك نقص في التوصيف الحركي عالي الدقة لمسار الترجمة هذا. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لقياس الحركية الترجمة المعتمدة على الغطاء مع قرار جزيء واحد. ويستند المقايسة على الأجسام المضادة المسمى fluorescently ملزمة لepiptide epitope الموسومة الوليدة. من خلال تصوير ربط وتفكك الأجسام المضادة من وإلى مجمعات الببتيد-ريبوسوم-ميرنا الوليدة، يمكن تتبع تطور الترجمة على الحمض النووي الريبي الفردي. هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء هذا المقايسة، بما في ذلك الاستعدادات الشريحة ميرنا وPEGylated، والتصوير في الوقت الحقيقي للترجمة، وتحليل مسارات جزيء واحد. يتيح هذا الفحص تتبع أحداث الترجمة الفردية المعتمدة على الحد الأقصى ويحل الحركية الرئيسية للترجمة، مثل معدلات البدء والإطالة. يمكن تطبيق المقايسة على نطاق واسع على أنظمة الترجمة المتميزة وينبغي أن تستفيد بشكل عام في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وآليات التحكم في الترجمة.

بعد البروتوكول الموصوف يتيح التصوير من التفاعلات الأجسام المضادة الفردية مع الوليدة N-الطرفية الموسومة polypeptides مع قرار جزيء واحد خلال ترجمة نشطة خالية من الخلايا من 3 'نهاية المربوطة مراسل مرنا (الشكل 1). يتم الإبلاغ عن تجربة مظاهرة الحد الأدنى مع استخدام ثلاثة mRNAs الاصطناعي?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

يتيح تتبع أحداث الترجمة الفردية إجراء دراسات حركية عالية الدقة لآليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى. هنا نظهر في المختبر اختبار جزيء واحد على أساس التفاعلات التصوير بين الأجسام المضادة وصفت الفلورسنت والببتيدات الناشئة الموسومة epitope. تمكن هذه الطريقة من توصيف جزيء واحد للبدء وحركية استطالة الببتيد أثناء الترجمة النشطة في المختبر المعتمدة على الغطاء.

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

جزيء واحدة سوبر قرار تصوير فوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate في غشاء البلازما مع رواية المسابر نيون

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...