Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant / Core Grant (P30 CA008748); og MSKCC Functional Genomics Initiative.

1. Generation af reporter mRNA
<ol><li>Rediger en DNA-transskription skabelon, der koder en bulk-assay "ukodet" reporter mRNA ved at indsætte en N-terminus epitop tag-kodning sekvens til at generere en DNA transskription skabelon til en "tagged" reporter mRNA (Figur 2A). BEMÆRK: 3xFLAG/anti-FLAG interaktion anbefales til denne analyse på grund af sin overlegne følsomhed og den korte 3xFLAG tag længde. Analysen er dog kompatibel med andre epitop-/antistofpar.</li>
	<li>Syntetiser uk...

I sammenligning med typiske in vitro TIRF enkeltmolekyle eksperimenter, enkelt-molekyle billeddannelse med analysen beskrevet her er desuden kompliceret på grund af brugen af celleekstrakt og en høj koncentration af fluorescerende mærket antistof. Sammenlignet med den mere almindelige praksis med en runde af overflade PEGylation reducerer en anden runde pegylation (trin 2) i høj grad uspecifik antistofbinding til detektionsoverflade15. Den høje koncentration af diffuserende fluoresce...

Oversættelse i eukaryote systemer sker overvejende gennem 7-methylguanosin (m7G) hætteafhængige veje1. Undersøgelser viser , at indledningen af eukaryote oversættelse er hastighedsbegrænsende og et fælles mål for regel2,3,4. Mekanismer til cap-afhængig oversættelse er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af genetiske5, biokemiske6,7,8, strukturelle9og genomiske10 bulk tilgange. Selv om disse metoder har identificeret forskellige mekanismer, der regulerer cap-afhængige indledning, deres opløsning begrænser dem til ensemble gennemsnit af signaler fra heterogene og asynkrone indledning begivenheder. På det seneste er individuelle in vivo-oversættelseshændelser blevet visualiseret ved hjælp af metoder , der måler fluorescerende antistofbinding til epitoper på spirende polypeptider11,12,13,14. Men disse nye tilgange er også begrænset i deres evne til at løse individuelle indledning begivenheder, fordi flere fluorescerende antistoffer skal binde en spirende peptid at tillade enkelt oversættelse begivenheder, der skal løses fra en høj intracellulær fluorescens baggrund. I mange biologiske interaktioner har løst individuelle kinetiske hændelser givet kritisk indsigt i forståelse af komplekse multistep og gentagne biologiske processer, der ikke er mulige at synkronisere på molekylært niveau. Der er behov for nye metoder, der kan spore dynamikken i de enkelte oversættelseshændelser, for at få en bedre forståelse af cap-afhængig indledning og regulering.
Vi har for nylig udviklet en in vitro-analyse, der måler cap-afhængige indledning kinetik med enkelt-molekyle opløsning15. I betragtning af det store antal kendte og ukendte proteinfaktorer, der er involveret i denne indledningsvej3,16, blev enkeltmolekyleanalysen udviklet til at være kompatibel med eksisterende in vitro-cellefri oversættelsessystemer for at drage fordel af deres bevarelse af cellulære faktorer og robust oversættelsesaktivitet17,18,19,20,21,22,23,24,25. Desuden giver brugen af cellefrie oversættelsessystemer mulighed for mere kompatible sammenligninger mellem observationer med et enkelt molekyle og tidligere bulkresultater. Denne tilgang giver en ligetil integration af nye enkelt-molekyle kinetisk indsigt i de eksisterende mekanistiske rammer for cap-afhængige indledning. For at etablere enkeltmolekyleanalysen ændres det traditionelle cellefrie oversættelsessystem på tre måder: en epitopkodningssekvens indsættes i begyndelsen af en reporter mRNA's åbne læseramme (ORF); den 3 'ende af reporter mRNA er biotinyleret til at lette mRNA ende-tøjring til enkelt-molekyle detektion overflade; og fluorescerende mærkede antistoffer suppleres med oversættelsesekstraktet. Disse modifikationer kræver kun grundlæggende molekylærbiologiske teknikker og almindeligt tilgængelige reagenser. Desuden bevarer disse modifikationer og enkeltmolekylebilleddannelsesbetingelserne oversættelseskinetik af massecellefrie oversættelsesreaktioner15.
I denne analyse (Figur 1), 5′-end udjævnet og 3′-end biotinyleret reporter mRNA er immobiliseret til en streptavidin-belagt detektion overflade i et flow kammer. Flowkammeret fyldes derefter med en cellefri oversættelsesblanding suppleret med fluorescerende mærkede antistoffer. Efter at mRNA-oversættelsen har fundet sted for ca. 30-40 codoner neden for epitopsekvensen26,27, kommer epitopen ud af ribosomets udgangstunnel og bliver tilgængelig for at interagere med fluorescerende mærket antistof. Denne interaktion er hurtig, og dens detektion ved hjælp af fluorescensbilledteknikker med et enkelt molekyle gør det muligt at spore oversættelseskinetik med enkeltmolekyleopløsning under aktiv cellefri oversættelse. Denne analyse bør i det store og hele være til gavn for in vitro-undersøgelser af cap-dependent translation kinetik og dens regulering, især for systemer med en fungerende bulk in vitro-analyse.
En forudsætning for at etablere denne enkeltmolekyleanalyse er en fungerende massecellefri oversættelsesanalyse, som kan opnås ved hjælp af oversættelsesekstrakt, der enten er kommercielt tilgængeligt eller tilberedt efter tidligere beskrevne metoder28. Eukaryote oversættelsesekstrakt kan fås fra forskellige celler, herunder svampe, pattedyr og plante28. Til billeddannelse kræver denne analyse et TIRF-mikroskop udstyret med justerbar laserintensitet og hændelsesvinkel, et motoriseret prøvestadie, et motoriseret fluidics-system og prøvetemperaturstyringsenhed. Sådanne krav er generiske for moderne in vitro enkeltmolekyle TIRF eksperimenter og kan opnås anderledes. Eksperimentet præsenteret her bruger en objektiv-type TIRF system, der består af kommercielt tilgængelige mikroskop, software og tilbehør alle opført i tabellen over materialer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

Cap-afhængig proteinsyntese er den fremherskende oversættelsesvej i eukaryote celler. Mens forskellige biokemiske og genetiske tilgange har tilladt omfattende undersøgelser af cap-afhængig oversættelse og dens regulering, mangler der stadig kinetisk karakterisering af denne oversættelsesvej i høj opløsning. For nylig udviklede vi en in vitro-analyse til måling af cap-afhængige oversættelse kinetik med enkelt-molekyle opløsning. Analysen er baseret på fluorescerende mærket antistofbinding til spirende epitop-mærket polypeptid. Ved at beskringe bindingen og dissociationen af antistoffer til og fra spirende peptid-ribosome-mRNA-komplekser kan oversættelsesprogressionen på individuelle mRNA'er spores. Her præsenterer vi en protokol til etablering af denne analyse, herunder mRNA og PEGylated slide præparater, real-time billeddannelse af oversættelse, og analyse af enkelt molekyle baner. Denne analyse gør det muligt at spore individuelle cap-afhængige oversættelse begivenheder og løser centrale oversættelse kinetik, såsom indledning og forlængelse satser. Analysen kan i vid udstrækning anvendes på særskilte oversættelsessystemer og bør i det store og hele være til gavn for in vitro-undersøgelser af cap-afhængige oversættelseskinetik og translationelle kontrolmekanismer.

Efter den beskrevne protokol muliggør billeddannelse af individuelle antistof interaktioner med spirende N-terminal-mærkede polypeptider med enkelt-molekyle opløsning under aktiv celle-fri oversættelse af 3 'end-bundet reporter mRNA (Figur 1). Der rapporteres om et minimalt demonstrationseksperiment med brug af tre syntetiske mRNA'er: LUC (kodning af umærket luciferase), LUCFLAG (kodning af 3xFLAG-mærket luciferase) og hp-LUC...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Sporing af individuelle oversættelseshændelser giver mulighed for kinetiske undersøgelser i høj opløsning af cap-afhængige oversættelsesmekanismer. Her demonstrerer vi en in vitro enkeltmolekyleanalyse baseret på billeddiagnostiske interaktioner mellem fluorescerende mærkede antistoffer og epitop-mærkede spirende peptider. Denne metode muliggør enkeltmolekylekarakterisering af initiering og peptidforlængelse kinetik under aktiv in vitro cap-afhængig oversættelse.

En In Vitro Single-Molecule Imaging Assay til analyse af cap-afhængige oversættelse kinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molekyle Super-resolution Imaging af Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse af oversættelse indledningen kompleks dannelse på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...