Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R01GM121847]; de Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); en MSKCC Functional Genomics Initiative.

1. Generatie verslaggever mRNA
<ol><li>Wijzig een DNA-transcriptiesjabloon die codeert voor een bulktest "untagged" reporter mRNA door een N-terminus epitoop tag-coderingssequentie in te voegen om een DNA-transcriptiesjabloon te genereren voor een "gelabelde" reporter mRNA (Figuur 2A). OPMERKING: 3xFLAG/anti-FLAG interactie wordt aanbevolen voor deze test vanwege de superieure gevoeligheid en de korte 3xFLAG tag lengte. De test is echter compatibel met andere epitoop-/antilichaamparen.<...

In vergelijking met typische in vitro TIRF-experimenten met één molecuul is beeldvorming met één molecuul met de hier beschreven test bovendien complex vanwege het gebruik van celextract en een hoge concentratie fluorescerend gelabeld antilichaam. In vergelijking met de meer gebruikelijke praktijk van één ronde pegylatie van het oppervlak, vermindert een tweede ronde PEGylation (stap 2) de niet-specifieke antilichaambinding aan het detectieoppervlakaanzienlijk 15. De hoge concentrat...

Vertaling in eukaryotische systemen vindt voornamelijk plaats via 7-methylguanosine (m7G) cap-afhankelijke trajecten1. Studies tonen aan dat de initiatiestap van eukaryotische vertaling tariefbeperkend is en een gemeenschappelijk doel voor voorschrift2,3,4. Mechanismen van cap-afhankelijke vertaling zijn uitgebreid bestudeerd met behulp van genetische5,biochemische6,7,8,structurele9en genomische10 bulkbenaderingen. Hoewel deze methoden verschillende mechanismen hebben geïdentificeerd die cap-afhankelijke initiatie reguleren, beperkt hun resolutie ze tot ensemble-middeling van signalen van heterogene en asynchrone initiatiegebeurtenissen. Meer recentelijk zijn individuele in vivo vertaalgebeurtenissen gevisualiseerd door methoden die fluorescerende antilichamen meten die zich binden aan epitopen op ontluikende polypeptiden11,12,13,14. Deze nieuwe benaderingen zijn echter ook beperkt in hun vermogen om individuele initiatiegebeurtenissen op te lossen, omdat meerdere fluorescerende antilichamen een ontluikend peptide moeten binden om enkelvoudige vertaalgebeurtenissen op te lossen vanuit een hoge intracellulaire fluorescentieachtergrond. In veel biologische interacties hebben opgeloste individuele kinetische gebeurtenissen kritische inzichten opgeleverd in het begrijpen van complexe multistep en repetitieve biologische processen die niet kunnen worden gesynchroniseerd op moleculair niveau. Nieuwe methoden die de dynamiek van individuele vertaalgebeurtenissen kunnen volgen, zijn nodig voor een beter begrip van cap-afhankelijke initiatie en regulering.
We hebben onlangs een in vitro test ontwikkeld die cap-afhankelijke initiatiekinetiek meet met single-molecule resolutie15. Gezien het grote aantal bekende en onbekende eiwitfactoren die betrokken zijn bij dit initiatietraject3,16, werd de test met één molecuul ontwikkeld om compatibel te zijn met bestaande in vitro celvrije vertaalsystemen om te profiteren van hun behoud van cellulaire factoren en robuuste vertaalactiviteit17,18,19,20,21,22,23,24,25. Bovendien maakt het gebruik van celvrije vertaalsystemen meer compatibele vergelijkingen mogelijk tussen waarnemingen met één molecuul en eerdere bulkresultaten. Deze aanpak biedt een eenvoudige integratie van nieuwe kinetische inzichten met één molecuul in het bestaande mechanistische kader van cap-afhankelijke initiatie. Om de test met één molecuul vast te stellen, wordt het traditionele celvrije vertaalsysteem op drie manieren gewijzigd: een epitoopcoderingssequentie wordt ingevoegd aan het begin van het open leeskader (ORF) van een reporter mRNA; het 3′-uiteinde van het reporter-mRNA wordt gebiotinyleerd om mRNA-eindtenthering aan het detectieoppervlak met één molecuul te vergemakkelijken; en fluorescerend gelabelde antilichamen worden aangevuld met het vertaalextract. Deze modificaties vereisen alleen basismoleculaire biologietechnieken en algemeen beschikbare reagentia. Bovendien behouden deze modificaties en de beeldvormingsomstandigheden met één molecuul de vertaalkinetiek van bulkcelvrije vertaalreacties15.
In deze test(figuur 1)wordt 5′-end capped en 3′-end biotinylated reporter mRNA geïmmobiliseerd naar een met streptavidine bedekt detectieoppervlak in een flowkamer. De stromingskamer wordt vervolgens gevuld met een celvrij vertaalmengsel aangevuld met fluorescerend gelabelde antilichamen. Nadat mRNA-vertaling heeft plaatsgevonden gedurende ongeveer 30-40 codons stroomafwaarts van de epitoopsequentie26,27, komt de epitoop uit de ribosoomuitgangstunnel en wordt toegankelijk voor interactie met fluorescerend gelabeld antilichaam. Deze interactie is snel en de detectie ervan door fluorescentiebeeldvormingstechnieken met één molecuul maakt het mogelijk om vertaalkinetiek met een enkele molecuulresolutie te volgen tijdens actieve celvrije vertaling. Deze test zou in grote lijnen ten goede moeten komen aan in vitro studies van cap-afhankelijke vertaalkinetiek en de regulering ervan, met name voor systemen met een werkende bulk in-vitrotest.
Een voorwaarde voor het vaststellen van deze test met één molecuul is een werkende bulkcelvrije vertaaltest, die kan worden bereikt met behulp van vertaalextract dat in de handel verkrijgbaar is of is bereid volgens eerder beschreven methoden28. Eukaryotisch vertaalextract kan worden verkregen uit verschillende cellen, waaronder schimmel, zoogdieren en planten28. Voor beeldvorming vereist deze test een TIRF-microscoop die is uitgerust met afstembare laserintensiteit en incidenthoek, een gemotoriseerd monsterstadium, een gemotoriseerd vloeistofsysteem en een monstertemperatuurregelingsapparaat. Dergelijke vereisten zijn generiek voor moderne in vitro TIRF-experimenten met één molecuul en kunnen anders worden bereikt. Het hier gepresenteerde experiment maakt gebruik van een objectief TIRF-systeem dat bestaat uit in de handel verkrijgde microscoop, software en accessoires die allemaal in de tabel met materialenworden vermeld.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

Cap-afhankelijke eiwitsynthese is de overheersende vertaalroute in eukaryotische cellen. Hoewel verschillende biochemische en genetische benaderingen uitgebreide studies van cap-afhankelijke vertaling en de regulering ervan mogelijk hebben maken, ontbreekt het nog steeds aan kinetische karakterisering van deze vertaalroute met hoge resolutie. Onlangs hebben we een in vitro test ontwikkeld om cap-afhankelijke vertaalkinetiek met single-molecule resolutie te meten. De test is gebaseerd op fluorescerend gelabeld antilichaambinding aan ontluikend epitoop-gelabeld polypeptide. Door de binding en dissociatie van antilichamen van en naar ontluikende peptide-ribosoom-mRNA-complexen in beeld te brengen, kan de vertaalprogressie op individuele mRNAs worden gevolgd. Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van deze test, inclusief mRNA- en PEGylated-diapreparaten, realtime beeldvorming van vertaling en analyse van trajecten met één molecuul. Deze test maakt het mogelijk om individuele cap-afhankelijke vertaalgebeurtenissen te volgen en lost belangrijke vertaalkinetiek op, zoals initiatie- en reksnelheden. De test kan op grote schaal worden toegepast op verschillende vertaalsystemen en zou in grote lijnen ten goede moeten komen aan in vitro studies van cap-afhankelijke vertaalkinetiek en translationele controlemechanismen.

Volgens het beschreven protocol kunnen individuele antilichaaminteracties met ontluikende N-terminal-gelabelde polypeptiden met single-molecule resolutie worden gebeeldomd tijdens actieve celvrije vertaling van 3' end-tethered reporter mRNA (Figuur 1). Een minimaal demonstratie-experiment wordt gerapporteerd met het gebruik van drie synthetische mRNAs: LUC (codering untagged luciferase), LUCFLAG (codering 3xFLAG-gelabeld luciferase) en hp-LU...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Het volgen van individuele vertaalgebeurtenissen maakt kinetische studies met hoge resolutie van cap-afhankelijke vertaalmechanismen mogelijk. Hier demonstreren we een in vitro single-molecule assay op basis van beeldvormende interacties tussen fluorescerend gelabelde antilichamen en epitoop-gelabelde ontluikende peptiden. Deze methode maakt single-molecule karakterisering van initiatie en peptide rekkinetiek mogelijk tijdens actieve in vitro cap-afhankelijke vertaling.

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molecule Super-resolutie beeldvorming van fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat in het plasmamembraan met Novel Fluorescerende Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...