Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health [R01GM121847]; la subvention de soutien/subvention de base du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) (P30 CA008748); et MSKCC Functional Genomics Initiative.

1. Génération de reporter mRNA
<ol><li>Modifier un modèle de transcription de l’ADN qui code un arna reporter « non marqué » en vrac en insérant une séquence d’encodage d’étiquettes d’épitope N-terminus pour générer un modèle de transcription de l’ADN pour un arNm reporter « marqué »(figure 2A). REMARQUE : L’interaction 3xFLAG/anti-FLAG est recommandée pour cet essai en raison de sa sensibilité supérieure et de la courte longueur d’étiquette 3xFLAG. Cep...

Par rapport aux expériences typiques de tirf mono-molécule in vitro, l’imagerie à molécule unique avec l’analyse décrite ici est en outre complexe en raison de l’utilisation de l’extrait cellulaire et d’une forte concentration d’anticorps fluorescents étiquetés. Par rapport à la pratique plus courante d’un tour de surface PEGylation, un deuxième tour de PEGylation (étape 2) réduit considérablement la liaison anticorps non spécifique à la surface de détection15...

La traduction dans les systèmes eucaryotes se fait principalement par des voies dépendantes du capuchon 7-méthylguanosine (m7G)1. Des études indiquent que l’étape d’initiation de la traduction eucaryotique limite les taux et est une cible commune pourla réglementation 2,3,4. Les mécanismes de traduction dépendant du cap ont été largement étudiés à l’aided’approches génétiques 5,biochimiques6,7,8,structurelles 9etgénomiques 10 en vrac. Bien que ces méthodes aient identifié divers mécanismes qui régulent l’initiation dépendante du cap, leur résolution les limite à la moyenne des signaux provenant d’événements d’initiation hétérogènes et asynchrones. Plus récemment, des événements individuels de traduction in vivo ont été visualisés par des méthodes qui mesurent la liaison fluorescente d’anticorps aux épitopes sur les polypeptides naissants11,12,13,14. Cependant, ces nouvelles approches sont également limitées dans leur capacité à résoudre les événements d’initiation individuels parce que les anticorps fluorescents multiples doivent lier un peptide naissant pour permettre aux événements de traduction simples d’être résolus à partir d’un fond élevé de fluorescence intracellulaire. Dans de nombreuses interactions biologiques, les événements cinétiques individuels résolus ont fourni des aperçus critiques dans la compréhension de processus biologiques complexes en plusieurs étapes et répétitifs qui ne sont pas possibles de se synchroniser au niveau moléculaire. De nouvelles méthodes qui peuvent suivre la dynamique des événements de traduction individuels sont nécessaires pour mieux comprendre l’initiation et la réglementation dépendantes du plafond.
Nous avons récemment développé un test in vitro qui mesure la cinétique d’initiation dépendante du capuchon avec résolution à molécule unique15. Compte tenu du grand nombre de facteurs protéiques connus et inconnus impliqués dans cette voie d’initiation3,16, l’analyse d’une seule molécule a été développée pour être compatible avec les systèmes de traduction in vitro sans cellules pour bénéficier de leur préservation des facteurs cellulaires et de l’activité de traductionrobuste 17,18,19,20,21,22,23,24,25. En outre, l’utilisation de systèmes de traduction sans cellules permet des comparaisons plus compatibles entre les observations à molécule unique et les résultats en vrac antérieurs. Cette approche fournit une intégration simple de nouvelles idées cinétiques à molécule unique dans le cadre mécaniste existant de l’initiation dépendante du capuchon. Pour établir l’analyse à molécule unique, le système de traduction traditionnel sans cellules est modifié de trois façons : une séquence d’encodage d’épitope est insérée au début du cadre de lecture ouvert (ORF) d’un armature de reporter; l’extrémité 3′ de l’ARNm reporter est biotinylée pour faciliter l’attache de l’ARNm à la surface de détection d’une seule molécule; et les anticorps étiquetés fluorescents sont complétés à l’extrait de traduction. Ces modifications ne nécessitent que des techniques de biologie moléculaire de base et des reagents couramment disponibles. En outre, ces modifications et les conditions d’imagerie à molécule unique préservent la cinétique de traduction des réactions de traduction sans cellules envrac 15.
Dans cet essai (Figure 1), 5′-end plafonné et 3′end biotinylated reporter ARNm est immobilisé à une surface de détection enduite de streptavidine dans une chambre d’écoulement. La chambre d’écoulement est ensuite remplie d’un mélange de traduction sans cellules complété par des anticorps étiquetés fluorescents. Après la traduction de l’ARNm a eu lieu pour environ 30-40 codons en aval de la séquence épitopique26,27, l’épitope émerge du tunnel de sortie ribosome et devient accessible pour interagir avec des anticorps fluorescents étiquetés. Cette interaction est rapide et sa détection par des techniques d’imagerie par fluorescence à molécule unique permet le suivi de la cinétique de traduction avec résolution d’une molécule unique lors de la traduction active sans cellules. Cet essai devrait largement bénéficier d’études in vitro de la cinétique de traduction dépendante du capuchon et de sa régulation, en particulier pour les systèmes avec un essai in vitro en vrac de travail.
Une condition préalable à l’établissement de cet essai à molécule unique est un essai de traduction en vrac sans cellules, qui peut être réalisé à l’aide d’extrait de traduction qui est disponible sur le marché ou préparé selon les méthodes décritesprécédemment 28. Extrait de traduction eucaryotique peut être obtenu à partir de diverses cellules, y compris fongique, mammifère, et laplante 28. Pour l’imagerie, cet essai nécessite un microscope TIRF équipé de l’intensité laser tunable et l’angle d’incident, un stade d’échantillon motorisé, un système fluidique motorisé, et dispositif de contrôle de la température de l’échantillon. Ces exigences sont génériques pour les expériences modernes de TIRF à molécule unique in vitro et peuvent être réalisées différemment. L’expérience présentée ici utilise un système TIRF de type objectif composé de microscopes, de logiciels et d’accessoires disponibles dans le commerce, tous énumérés dans le Tableau des matériaux.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

La synthèse des protéines dépendantes du cap est la voie de traduction prédominante dans les cellules eucaryotes. Bien que diverses approches biochimiques et génétiques aient permis des études approfondies de la traduction dépendante du capuchon et de sa régulation, la caractérisation cinétique à haute résolution de cette voie de traduction fait encore défaut. Récemment, nous avons développé un test in vitro pour mesurer la cinétique de traduction dépendante du capuchon avec résolution d’une molécule unique. L’essai est basé sur la liaison fluorescente d’anticorps à polypeptide épitope-marqué. En imagerie de la liaison et de la dissociation des anticorps vers et depuis les complexes naissants de peptide-ribosome-ARNm, la progression de la traduction sur les ARNM individuels peut être suivie. Ici, nous présentons un protocole pour établir ce test, y compris l’ARNm et les préparations de diapositives pegylated, l’imagerie en temps réel de la traduction, et l’analyse des trajectoires d’une molécule unique. Cet essai permet le suivi des événements de traduction individuels dépendant du plafond et résout la cinétique de traduction clé, telles que les taux d’initiation et d’allongement. L’analyse peut être largement appliquée à des systèmes de traduction distincts et devrait largement bénéficier d’études in vitro de la cinétique de traduction dépendante du capuchon et des mécanismes de contrôle translationnel.

Suivre le protocole décrit permet l’imagerie d’interactions individuelles d’anticorps avec des polypeptides naissants marqués n-terminal avec résolution d’une molécule lors de la traduction active sans cellules de l’ARNm reporter attaché à la fin de 3 ' (Figure 1). Une expérience de démonstration minimale est signalée avec l’utilisation de trois ARNM synthétiques : LUC (codage luciferase non étiqueté), LUCFLAG (codage 3xFLAG-marqu...

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An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Le suivi des événements de traduction individuels permet des études cinétiques à haute résolution des mécanismes de traduction dépendant du plafond. Ici nous démontrons un essai in vitro d’une seule molécule basé sur des interactions de formation image entre les anticorps fluorescents étiquetés et les peptides naissants épitope-marqués. Cette méthode permet la caractérisation à molécule unique de la cinétique d’initiation et d’élongation peptidique lors de la traduction active in vitro dépendante du capuchon.

Un essai in vitro d’imagerie à molécule unique pour l’analyse de la cinétique de traduction cap-dépendante

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

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Biochimie

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