Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01GM121847]; מרכז הסרטן סלואן קטרינג הזיכרון (MSKCC) מענק תמיכה / מענק ליבה (P30 CA008748); ויוזמת הגנומיקה הפונקציונלית של MSKCC.

1. דור הכתב mRNA
<ol><li>שנה תבנית שעתוק DNA המקודד mRNA כתב "לא מתויג" בתפזורת על-ידי הוספת רצף קידוד תגים של N-terminus כדי ליצור תבנית שעתוק DNA עבור mRNA כתב "מתויג"(איור 2A). הערה: אינטראקציה של 3xFLAG/anti-FLAG מומלצת לבדיקה זו בשל הרגישות המעולה שלה ואורך התג הקצר של 3xFLAG. עם זאת, ההסתעפות תואמת ל?...

בהשוואה לניסויים טיפוסיים במבחנה TIRF מולקולה אחת, הדמיה של מולקולה אחת עם ההסתייגות המתוארת כאן מורכבת בנוסף בשל השימוש בתמצית תאים וריכוז גבוה של נוגדן שכותרתו פלואורסצנטית. בהשוואה לנוהג הנפוץ יותר של סיבוב אחד של PEGylation משטח, סיבוב שני של PEGylation (שלב 2) מפחית מאוד נוגדן לא ספציפי מחיי?...

תרגום במערכות אוקריוטיות מתרחש בעיקר באמצעות מסלולים תלויי כובע 7-מתילגואנוסין (m7G)1. מחקרים מראים כי שלב החניכה של תרגום אוקריוטי הוא הגבלת שיעור ויעד נפוץ לתקנה2,3,4. מנגנונים של תרגום תלוי כובע נחקרו בהרחבה באמצעותגנטיקה 5, ביוכימי6,7,8, מבני9, וגנומי10 גישות בתפזורת. למרות ששיטות אלה זיהו מנגנונים מגוונים המווסתים חניכה תלוית כובע, הרזולוציה שלהם מגבילה אותם לממוצע של אותות מאירועי חניכה הטרוגניים ואסינכרוניים. לאחרונה, בודדים באירועי תרגום vivo כבר דמיינו על ידי שיטות למדוד נוגדנים פלואורסצנטי מחייב אפיטופים על פוליפפטידים המתהווה11,12,13,14. עם זאת, גישות חדשות אלה מוגבלות גם ביכולתן לפתור אירועי חניכה בודדים מכיוון שנוגדנים פלואורסצנטיים מרובים חייבים לקשור פפטיד מתפתח כדי לאפשר פענוח אירועי תרגום יחיד מרקע פלואורסצנטי תאי גבוה. באינטראקציות ביולוגיות רבות, אירועים קינטיים אינדיבידואליים שנפתרו סיפקו תובנות קריטיות להבנת תהליכים ביולוגיים מורכבים ורב-שלביים שחוזרים על עצמו, שלא ניתן לסנכרן ברמה המולקולרית. שיטות חדשות שיכולות לעקוב אחר הדינמיקה של אירועי תרגום בודדים נדרשות להבנה טובה יותר של ייזום ורגולציה תלויי כובע.
לאחרונה פיתחנו מבחנה במבחנה המודדת קינטיקה חניכה תלוית כובע עם רזולוציה של מולקולה אחת15. בהתחשב במספר הגדול של גורמי חלבון ידועים ולא ידועים המעורבים במסלול חניכה זה3,16, מבחני המולקולה הבודדת פותחו כדי להיות תואמים למערכות תרגום קיימות ללא תאי במבחנה כדי ליהנות משימור גורמים תאיים ופעילות תרגום חזקה17,18,19,20,21,22,23,24,25. יתר על כן, השימוש במערכות תרגום ללא תאים מאפשר השוואות תואמות יותר בין תצפיות של מולקולות בודדות לבין תוצאות קודמות בצובר. גישה זו מספקת שילוב ישיר קדימה של תובנות קינטיות חדשות של מולקולה אחת למסגרת המכניסטית הקיימת של חניכה תלוית כובע. כדי להקים את מבחני המולקולות הבודדות, מערכת התרגום המסורתית נטולת התאים משתנה בשלוש דרכים: רצף קידוד אפיטופ מוכנס בתחילת מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של mRNA כתב; הסוף 3′ של הכתב mRNA הוא biotinylated כדי להקל על mRNA קצה קשירה למשטח זיהוי מולקולה אחת; ונוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית מתווספים לתמצית התרגום. שינויים אלה דורשים רק טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות ריאגנטים זמינים בדרך כלל. יתר על כן, שינויים אלה ותנאי הדמיה של מולקולה אחת לשמר את קינטיקה תרגום של תגובות תרגום ללא תאים בתפזורת15.
ב assay זה (איור 1), 5′-end כתרים ו 3′-end biotinylated כתב mRNA משותק למשטח זיהוי מצופה סטרפטבידין בתא זרימה. תא הזרימה מתמלא לאחר מכן בתערובת תרגום נטולת תאים בתוספת נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית. לאחר תרגום mRNA התרחשה במשך כ 30-40 קודונים במורד הזרם של רצף האפיטופ26,27, האפיטופ עולה מנהרת היציאה ריבוזום הופך נגיש לאינטראקציה עם נוגדן שכותרתו פלואורסצנטית. אינטראקציה זו מהירה וזיהוי שלה על ידי טכניקות הדמיה פלואורסצנטיות של מולקולה אחת מאפשר מעקב אחר קינטיקה תרגום ברזולוציה של מולקולה אחת במהלך תרגום פעיל ללא תאים. בדיקה זו צריכה להפיק תועלת רחבה במחקרים במבחנה של קינטיקה תרגום תלוי כובע ורגולציה שלה, במיוחד עבור מערכות עם צובר עובד במבחנה.
תנאי מוקדם להקמת בדיקה זו של מולקולה אחת הוא בדיקה תרגום ללא תאים בתפזורת עובד, אשר ניתן להשיג באמצעות תמצית תרגום כי הוא גם זמין מסחרית או מוכן בעקבות שיטות שתוארו בעבר28. תמצית תרגום אוקריוטי ניתן להשיג מתאים מגוונים, כולל פטריות, יונקים, צמח28. להדמיה, מבחנים אלה דורשים מיקרוסקופ TIRF המצויד בעוצמת לייזר מתכווננת וזווית אירוע, שלב מדגם ממונע, מערכת נוזלים ממונעת ומכשיר בקרת טמפרטורה לדוגמה. דרישות כאלה הן גנריות עבור ניסויים מודרניים במבחנה מולקולה אחת TIRF וניתן להשיג באופן שונה. הניסוי המוצג כאן משתמש במערכת TIRF מסוג אובייקטיבי המורכבת ממיקרוסקופ, תוכנה ואביזרים זמינים מסחרית, כולם רשומים בטבלת החומרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

סינתזת חלבונים תלוית כיפה היא מסלול התרגום השולט בתאים אוקריוטיים. בעוד גישות ביוכימיות וגנטיות שונות אפשרו מחקרים מקיפים של תרגום תלוי כובע והרגולציה שלה, אפיון קינטי ברזולוציה גבוהה של מסלול תרגום זה עדיין חסר. לאחרונה, פיתחנו מבחנה במבחנה למדידת קינטיקה תרגום תלוית כובע עם רזולוציה של מולקולה אחת. ההסתייגות מבוססת על נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית המחייבים לפוליפפטיד המתהווה עם תווית אפיטופ. על ידי הדמיה של קשירה וניתוק של נוגדנים אל ומן מתחמי פפטיד-ריבוזום-mRNA המתהווה, ניתן לעקוב אחר התקדמות התרגום על mRNAs בודדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת בדיקה זו, כולל הכנות שקופיות mRNA ו PEGylated, הדמיה בזמן אמת של תרגום, וניתוח של מסלולי מולקולה אחת. בדיקה זו מאפשרת מעקב אחר אירועי תרגום בודדים התלויים בכובע ופותרת קינטיקה של תרגום מרכזי, כגון שיעורי חניכה והתארכות. ניתן ליישם את ההסתעפות באופן נרחב על מערכות תרגום נפרדות, והיא אמורה להפיק תועלת נרחבת ממחקרים במבחנה של קינטיקה של תרגום תלוי כובע ומנגנוני בקרה תרגום.

בעקבות הפרוטוקול המתואר מאפשר הדמיה של אינטראקציות נוגדנים בודדות עם פוליפפטידים המתהווים של N-terminal עם רזולוציה של מולקולה אחת במהלך תרגום פעיל ללא תאים של mRNA כתב קצה קשור 3 (איור 1). ניסוי הדגמה מינימלי מדווח על שימוש בשלושה mRNAs סינתטיים: LUC (קידוד לוציפראז לא מתויג), LU...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...