Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health [R01GM121847]; il Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); e MSKCC Functional Genomics Initiative.

1. Generazione di mRNA reporter
<ol><li>Modificare un modello di trascrizione del DNA che codifica un mRNA reporter "senza tag" di test di massa inserendo una sequenza di codifica tag epitopo N-terminale per generare un modello di trascrizione del DNA per un mRNA reporter "taggato" (Figura 2A). NOTA: L'interazione 3xFLAG/anti-FLAG è consigliata per questo test grazie alla sua sensibilità superiore e alla breve lunghezza dell'etichetta 3xFLAG. Tuttavia, il saggio è compatibile con alt...

Rispetto ai tipici esperimenti tirf a singola molecola in vitro, l'imaging a singola molecola con il saggio qui descritto è inoltre complesso a causa dell'uso di estratto cellulare e di un'alta concentrazione di anticorpi etichettati fluorescentmente. Rispetto alla pratica più comune di un ciclo di PEGylation superficiale, un secondo ciclo di PEGylation (fase 2) riduce notevolmente il legame anticorpale non specifico alla superficiedi rilevamento 15. L'alta concentrazione di anticorpi f...

La traduzione nei sistemi eucarioti avviene prevalentemente attraverso vie 7-metilguanosina (m7G) cap-dipendenti1. Gli studi indicano che la fase di iniziazione della traduzione eucariota è la limitazione del tasso e un obiettivo comune perla regolamentazione 2,3,4. I meccanismi di traduzione dipendente dal tappo sono stati ampiamente studiatiutilizzando approcci genetici 5,biochimici 6,7,8,strutturali 9e genomici a 10 rinfuse. Sebbene questi metodi abbiano identificato diversi meccanismi che regolano l'iniziazione dipendente dal limite, la loro risoluzione li limita alla media dei segnali provenienti da eventi di iniziazione eterogenei e asincroni. Più recentemente, singoli eventi di traduzione in vivo sono stati visualizzati con metodi che misurano il legame degli anticorpi fluorescenti agli epitopi sui polipeptidinascenti 11,12,13,14. Tuttavia, questi nuovi approcci sono anche limitati nella loro capacità di risolvere singoli eventi di iniziazione perché più anticorpi fluorescenti devono legare un peptide nascente per consentire a singoli eventi di traduzione di essere risolti da un alto sfondo di fluorescenza intracellulare. In molte interazioni biologiche, i singoli eventi cinetici risolti hanno fornito approfondimenti critici sulla comprensione di complessi processi biologici multistep e ripetitivi che non sono possibili sincronizzare a livello molecolare. Sono necessari nuovi metodi in grado di tenere traccia delle dinamiche dei singoli eventi di traduzione per una migliore comprensione dell'avvio e della regolazione dipendenti dal limite.
Recentemente abbiamo sviluppato un saggio in vitro che misura la cinetica di iniziazione dipendente dal tappo con risoluzione a singola molecola15. Considerando il gran numero di fattori proteici noti e sconosciuti coinvolti in questa viadi iniziazione 3,16, il saggio a singola molecola è stato sviluppato per essere compatibile con i sistemi di traduzione in vitro esistenti per beneficiare della loro conservazione dei fattori cellulari e della robusta attività ditraduzione 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Inoltre, l'uso di sistemi di traduzione senza cellule consente confronti più compatibili tra osservazioni a singola molecola e risultati di massa precedenti. Questo approccio fornisce un'integrazione diretta di nuove intuizioni cinetiche a singola molecola nel quadro meccanicistico esistente di iniziazione dipendente dal tappo. Per stabilire il saggio a singola molecola, il tradizionale sistema di traduzione senza cellule viene modificato in tre modi: una sequenza di codifica epitopica viene inserita all'inizio del frame di lettura aperto (ORF) di un mRNA reporter; l'estremità 3′ dell'mRNA reporter è biotinilata per facilitare il end-tethering dell'mRNA alla superficie di rilevamento a singola molecola; e gli anticorpi con etichetta fluorescente sono integrati nell'estratto di traduzione. Queste modifiche richiedono solo tecniche di biologia molecolare di base e reagenti comunemente disponibili. Inoltre, queste modifiche e le condizioni di imaging a singola molecola preservano la cinetica di traduzione delle reazioni di traduzione senza cellule sfuse15.
In questo saggio (Figura 1), l'mRNA del reporter biotinilato 5′-end limitato e 3′-end è immobilizzato su una superficie di rilevamento rivestita di streptavidina in una camera di flusso. La camera di flusso viene quindi riempita con una miscela di traslazione priva di cellule integrata con anticorpi etichettati fluorescentmente. Dopo che la traduzione dell'mRNA si è verificata per circa 30-40 codoni a valle della sequenza epitopica26,27, l'epitopo emerge dal tunnel di uscita ribosoma e diventa accessibile per interagire con anticorpi etichettati fluorescentmente. Questa interazione è rapida e il suo rilevamento da parte di tecniche di imaging a fluorescenza a singola molecola consente il tracciamento della cinetica di traslazione con risoluzione a singola molecola durante la traduzione attiva senza cellule. Questo saggio dovrebbe ampiamente giovare agli studi in vitro sulla cinetica traslazione dipendente dal tappo e sulla sua regolazione, in particolare per i sistemi con una massa di lavoro in test in vitro.
Un prerequisito per stabilire questo saggio a singola molecola è un saggio di traduzione senza cellule sfuse funzionante, che può essere ottenuto utilizzando estratto di traduzione disponibile in commercio o preparato seguendo i metodiprecedentemente descritti 28. L'estratto di traduzione eucariotica può essere ottenuto da diverse cellule, tra cui fungino, mammifero e pianta28. Per l'imaging, questo test richiede un microscopio TIRF dotato di intensità laser tonnibile e angolo incidente, uno stadio campione motorizzato, un sistema di fluidic motorizzato e un dispositivo di controllo della temperatura del campione. Tali requisiti sono generici per i moderni esperimenti TIRF a singola molecola in vitro e possono essere raggiunti in modo diverso. L'esperimento qui presentato utilizza un sistema TIRF di tipo oggettivo composto da microscopio, software e accessori disponibili in commercio tutti elencati nella Tabella dei Materiali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

La sintesi proteica cap-dipendente è la via di traduzione predominante nelle cellule eucariotiche. Mentre vari approcci biochimici e genetici hanno permesso studi approfonditi sulla traduzione dipendente dal tappo e sulla sua regolazione, manca ancora la caratterizzazione cinetica ad alta risoluzione di questo percorso di traduzione. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio in vitro per misurare la cinetica di traduzione dipendente dal tappo con risoluzione a singola molecola. Il saggio si basa sul legame anticorpale etichettato fluorescentmente al polipeptide nascente con tag epitopo. Imaging del legame e della dissociazione degli anticorpi da e verso i nascenti complessi peptidico-ribosoma-mRNA, è possibile tracciare la progressione di traslazione sui singoli mRNA. Qui, presentiamo un protocollo per stabilire questo saggio, tra cui mRNA e preparati di scorrimento PEGylated, imaging in tempo reale della traduzione e analisi delle traiettorie di singole molecole. Questo saggio consente il monitoraggio dei singoli eventi di traduzione dipendenti dal tappo e risolve la cinetica di traduzione chiave, come i tassi di iniziazione e allungamento. Il saggio può essere ampiamente applicato a sistemi di traduzione distinti e dovrebbe ampiamente beneficiare di studi in vitro di cinetica di traduzione cap-dependent e meccanismi di controllo traslizionale.

Seguendo il protocollo descritto si consente l'imaging di singole interazioni anticorpali con i nascenti polipeptidi con tag N-terminale con risoluzione a singola molecola durante la traduzione attiva senza cellule dell'mRNA reporter con reticolo finale 3' (Figura 1). Un esperimento dimostrativo minimo è riportato con l'uso di tre mRNA sintetici: LUC (codifica luciferasi non taggata), LUCFLAG (codifica 3xFLAG-tagged luciferase) e hp-LUC</em...

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An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Il monitoraggio dei singoli eventi di traduzione consente studi cinetici ad alta risoluzione sui meccanismi di traduzione dipendenti dal cappuccio. Qui dimostriamo un saggio a singola molecola in vitro basato sulle interazioni di imaging tra anticorpi etichettati fluorescentmente e peptidi nascenti etichettati epitopi. Questo metodo consente la caratterizzazione a singola molecola della cinetica di iniziazione e allungamento peptidico durante la traduzione attiva in vitro dipendente dal cappuccio.

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

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