Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) støtter tilskudd/kjernestipend (P30 CA008748); og MSKCC Functional Genomics Initiative.

1. Generasjon av reporter mRNA
<ol><li>Endre en DNA-transkripsjonsmal som koder en bulkanalyse "ukodet" reporter mRNA ved å sette inn en N-terminus epitop-tag-kodingssekvens for å generere en DNA-transkripsjonsmal for en "tagget" reporter mRNA (Figur 2A). MERK: 3xFLAG/anti-FLAG-interaksjon anbefales for denne analysen på grunn av dens overlegne følsomhet og den korte 3xFLAG-kodelengden. Analysen er imidlertid kompatibel med andre epitope/antistoffpar.</li>
	<li>Syntetisere ukodede o...

Sammenlignet med typiske in vitro TIRF enkeltmolekyleksperimenter, er enkeltmolekylavbildning med analysen beskrevet her i tillegg kompleks på grunn av bruk av celleekstrakt og en høy konsentrasjon av fluorescerende merket antistoff. Sammenlignet med den vanligste praksisen med en runde med overflate PEGylering, reduserer en andre runde PEGylering (trinn 2) i stor grad ikke-spesifikk antistoffbinding til deteksjonsoverflate15. Den høye konsentrasjonen av diffuserende fluorescerende ant...

Oversettelse i eukaryote systemer skjer hovedsakelig gjennom 7-metylguanosin (m7G) cap-avhengige veier1. Studier indikerer at initieringstrinnet for eukaryotisk oversettelse er prisbegrensende og et felles mål for regel2,3,4. Mekanismer for cap-avhengig oversettelse har blitt grundig studert ved hjelp av genetiske5, biokjemiske6,7,8, strukturelle9og genomiske10 bulk tilnærminger. Selv om disse metodene har identifisert forskjellige mekanismer som regulerer cap-avhengig initiering, begrenser oppløsningen dem til ensemblegjennomsnitt av signaler fra heterogene og asynkrone initieringshendelser. Mer nylig har individuelle in vivo-oversettelseshendelser blitt visualisert ved hjelp av metoder som måler fluorescerende antistoffbinding til epitoper på nascent polypeptider11,12,13,14. Imidlertid er disse nye tilnærmingene også begrenset i deres evne til å løse individuelle initieringshendelser fordi flere fluorescerende antistoffer må binde et nascent peptid for å tillate at enkeltoversettelseshendelser løses fra en høy intracellulær fluorescensbakgrunn. I mange biologiske interaksjoner har løst individuelle kinetiske hendelser gitt kritisk innsikt i å forstå komplekse multistep og repeterende biologiske prosesser som ikke er mulig å synkronisere på molekylært nivå. Nye metoder som kan spore dynamikken i individuelle oversettelseshendelser er nødvendig for en bedre forståelse av cap-avhengig initiering og regulering.
Vi utviklet nylig en in vitro-analyse som måler cap-avhengig initieringskinetikk med enkeltmolekyloppløsning15. Tatt i betraktning det store antallet kjente og ukjente proteinfaktorer som er involvert i denne initieringsveien3,16, ble enkeltmolekylanalysen utviklet for å være kompatibel med eksisterende in vitro cellefrie oversettelsessystemer for å dra nytte av bevaring av cellulære faktorer og robust oversettelsesaktivitet17,18,19,20,21,22,23,24,25. Videre tillater bruk av cellefrie oversettelsessystemer mer kompatible sammenligninger mellom observasjoner av enkeltmolekyler og tidligere bulkresultater. Denne tilnærmingen gir en rett frem integrasjon av ny kinetisk innsikt i det eksisterende mekanistiske rammeverket for capavhengig initiering. For å etablere enkeltmolekylanalysen, endres det tradisjonelle cellefrie oversettelsessystemet på tre måter: en epitopkodingssekvens settes inn i begynnelsen av den åpne leserammen (ORF) til en reporter mRNA; den 3′ enden av reporter mRNA er biotinylert for å lette mRNA end-tethering til single-molekyl deteksjon overflate; fluorescerende merkede antistoffer er supplert med oversettelsesekstraktet. Disse modifikasjonene krever bare grunnleggende molekylærbiologiske teknikker og vanlige reagenser. Videre bevarer disse modifikasjonene og bildeforholdene for enkeltmolekyler oversettelseskinetikken til bulkcellefrie oversettelsesreaksjoner15.
I denne analysen (Figur 1), 5′-end capped og 3′-end biotinylated reporter mRNA er immobilisert til en streptavidin-belagt deteksjon overflate i et strømningskammer. Strømningskammeret fylles deretter med en cellefri oversettelsesblanding supplert med fluorescerende merkede antistoffer. Etter at mRNA-oversettelsen har skjedd i omtrent 30-40 codons nedstrøms epitopsekvensen26,27, kommer epitopen ut av ribosomets utgangstunnel og blir tilgjengelig for å samhandle med fluorescerende merket antistoff. Denne interaksjonen er rask og dens deteksjon av enkeltmolekylet fluorescensavbildningsteknikker muliggjør sporing av oversettelseskinetikk med enkeltmolekyloppløsning under aktiv cellefri oversettelse. Denne analysen bør i stor grad være til nytte for in vitro-studier av cap-avhengige oversettelseskinetikk og dens regulering, spesielt for systemer med en fungerende bulk in vitro-analyse.
En forutsetning for å etablere denne enkeltmolekylanalysen er en fungerende bulkcellefri oversettelsesanalyse, som kan oppnås ved hjelp av oversettelsesekstrakt som enten er kommersielt tilgjengelig eller utarbeidet etter tidligere beskrevne metoder28. Eukaryotisk oversettelsesekstrakt kan fås fra forskjellige celler, inkludert sopp, pattedyr og plante28. For avbildning krever denne analysen et TIRF-mikroskop utstyrt med justerbar laserintensitet og hendelsesvinkel, et motorisert prøvestadium, et motorisert fluidikksystem og prøvetemperaturreguleringsenhet. Slike krav er generiske for moderne in vitro-tirf-eksperimenter med ett molekyl og kan oppnås annerledes. Eksperimentet som presenteres her, bruker et objektivt TIRF-system som består av kommersielt tilgjengelig mikroskop, programvare og tilbehør som alle er oppført i Materialfortegnelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

Cap-avhengig proteinsyntese er den dominerende oversettelsesveien i eukaryote celler. Mens ulike biokjemiske og genetiske tilnærminger har tillatt omfattende studier av cap-avhengig oversettelse og dens regulering, mangler fortsatt høyoppløselig kinetisk karakterisering av denne oversettelsesveien. Nylig utviklet vi en in vitro-analyse for å måle cap-avhengige oversettelseskinetikk med enkeltmolekyloppløsning. Analysen er basert på fluorescerende merket antistoffbinding til nascent epitopmerket polypeptid. Ved å forestille seg binding og dissosiasjon av antistoffer mot og fra nascent peptid-ribosom-mRNA-komplekser, kan oversettelsesprogresjonen på individuelle mRNAer spores. Her presenterer vi en protokoll for å etablere denne analysen, inkludert mRNA og PEGylated lysbildepreparater, sanntidsavbildning av oversettelse og analyse av enkeltmolekylbaner. Denne analysen gjør det mulig å spore individuelle cap-avhengige oversettelseshendelser og løser viktige oversettelseskinetikker, for eksempel initierings- og forlengelseshastigheter. Analysen kan brukes mye på distinkte oversettelsessystemer og bør i stor grad være til nytte for in vitro-studier av cap-avhengige oversettelseskinetikk og translasjonelle kontrollmekanismer.

Etter protokollen som er beskrevet, muliggjør avbildning av individuelle antistoffinteraksjoner med nascent N-terminal-taggede polypeptider med enkeltmolekyloppløsning under aktiv cellefri oversettelse av 3' end-tethered reporter mRNA (Figur 1). Et minimalt demonstrasjonseksperiment rapporteres ved bruk av tre syntetiske mRNAer: LUC (koding ukodet luciferase), LUCFLAG (koding 3xFLAG-merket luciferase) og hp-LUCFLAG (LUC<...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Sporing av individuelle oversettelseshendelser gir mulighet for kinetiske studier med høy oppløsning av capavhengige oversettelsesmekanismer. Her demonstrerer vi en in vitro enkeltmolekylanalyse basert på bildeinteraksjoner mellom fluorescerende merkede antistoffer og epitopmerkede nascent peptider. Denne metoden muliggjør enkeltmolekyl karakterisering av initiering og peptid forlengelse kinetikk under aktiv in vitro cap-avhengig oversettelse.

En In Vitro single-molecule imaging assay for analyse av cap-avhengig oversettelse kinetikk

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molekyl Super-Resolution Imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranen med Novel fluorescerende prober

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyte strekker analysen implementering for å studere Transport av molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molekylet manipulering av G-quadruplexes av magnetiske pinsett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fange samhandling Kinetics en Ion kanal protein med små molekyler av Bio-lags Interferometry analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...