Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01GM121847); Мемориальный онкологический центр Слоан Кеттеринг (MSKCC) Грант/Основной Грант (P30 CA008748); и Инициатива MSKCC по функциональной геномике.

1. Поколение репортеров мРНК
<ol><li>Изменение шаблона транскрипции ДНК, который кодирует объемный анализ "untagged" репортер mRNA, вставив N-терминус эпитоп тегов кодирования последовательности для создания шаблона транскрипции ДНК для "тегами" репортер mRNA (Рисунок 2A). ПРИМЕЧА...

По сравнению с типичными в пробирке TIRF одномекулярных экспериментов, одноямекулярная визуализация с анализом, описанным здесь, дополнительно сложна из-за использования клеточного экстракта и высокой концентрации флуоресцентно помеченных антител. По сравнению с более распростр?...

Перевод в эукариотических системах происходит преимущественно через 7-метилгуанозин(м 7G) крышка-зависимых путей1. Исследования показывают, что инициационный шаг эукариотического перевода является ограничением скорости и общей цельюдля регулирования 2,3,4. Механизмы капремонтозависимых переводов были широко изучены с использованиемгенетических 5,биохимических 6,7,8, структурных9игеномных 10 навалочных подходов. Хотя эти методы выявили различные механизмы, которые регулируют ограничения зависимых инициации, их разрешение ограничивает их ансамбль усреднение сигналов от неоднородных и асинхронных событий посвящения. Совсем недавно, отдельные события перевода in vivo были визуализированы методами, которые измеряют флуоресцентные антитела, связывающиеся с эпитопами на зарождающихсяполипептидах 11,12,13,14. Тем не менее, эти новые подходы также ограничены в их способности решать отдельные события посвящения, потому что множественные флуоресцентные антитела должны связывать зарождающийся пептид, чтобы отдельные события перевода были решены из высокого внутриклеточного фона флуоресценции. Во многих биологических взаимодействиях, решенные отдельные кинетические события предоставили критические идеи в понимании сложных многоступенчатых и повторяющихся биологических процессов, которые невозможно синхронизировать на молекулярном уровне. Необходимы новые методы, которые могут отслеживать динамику отдельных событий перевода для лучшего понимания ограничения зависимости от инициации и регулирования.
Недавно мы разработали анализ in vitro, который измеряет зависящая от крышки инициация кинетики с одномекулярнойразрешением 15. Учитывая большое количество известных и неизвестных белковых факторов, участвующихв этом пути инициации 3,16, одномекулярный анализ был разработан, чтобы быть совместимым с существующими системами перевода без клеток in vitro, чтобы извлечь выгоду из их сохранения клеточных факторов инадежной переводческой активности 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Кроме того, использование систем перевода без клеток позволяет проводить более совместимые сопоставления между одномекулярными наблюдениями и предыдущими результатами. Этот подход обеспечивает прямую интеграцию новых одномекулярных кинетических идей в существующие механистические рамки ограничения зависимой инициации. Для установления одномекулярного анализа традиционная система перевода без клеток модифицировалась тремя способами: в начале открытого считывочного кадра (ORF) репортер mRNA вставляется последовательность кодирования эпитопа; 3 "конец репортер мРНК биотинилированных для облегчения мРНК конца привязывая к одной молекулы обнаружения поверхности; и флуоресцентно помеченные антитела дополняются экстрактом перевода. Эти модификации требуют только основных методов молекулярной биологии и общедоступных реагентов. Кроме того, эти модификации и условия одномекулярной визуализации сохраняют кинетику перевода реакций перевода без навалочныхклеток 15.
В этом анализе (Рисунок 1), 5 "конец ограничен и 3"-конец биотинилированных репортер мРНК обездвижены на стрептавидин покрытием обнаружения поверхности в камере потока. Затем камера потока заполняется безклеточной переводной смесью, дополненной флуоресцентно помеченными антителами. После перевода мРНК произошло около 30-40 кодонов вниз потечению эпитопной последовательности 26,27, эпитоп выходит из рибосомного туннеля выхода и становится доступным для взаимодействия с флуоресцентно помеченными антителами. Это взаимодействие происходит быстро, и его обнаружение с помощью одномекулярных методов визуализации флуоресценции позволяет отслеживать перевод кинетики с одномекулярной разрешением во время активного перевода без клеток. Этот анализ должен в целом принести пользу в пробирке исследований кап-зависимых перевод кинетики и ее регулирования, особенно для систем с рабочей массой in vitro анализа.
Предпосылкой для создания этого одномекулярного анализа является рабочая навалом без клеток перевод анализа, который может быть достигнут с помощью перевода экстракт, который является либо коммерчески доступным или подготовлены следующие ранее описанныеметоды 28. Эукариотический перевод экстракт может быть получен из различных клеток, в том числе грибковых, млекопитающих ирастений 28. Для визуализации для этого анализа требуется микроскоп TIRF, оснащенный настраиваемой лазерной интенсивностью и углом инцидента, моторизованной стадией образца, моторизованной системой жидкости и устройством контроля температуры образца. Такие требования являются общими для современных одноямператекулярных экспериментов TIRF in vitro и могут быть достигнуты по-разному. Эксперимент, представленный здесь, использует объективную систему TIRF, состоит из коммерчески доступных микроскопов, программного обеспечения и аксессуаров, перечисленных в таблице материалов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

Синтез белка, зависящий от крышки, является преобладающим переводом в эукариотических клетках. Хотя различные биохимические и генетические подходы позволили проведить обширные исследования зависящего от ограничения перевода и его регулирования, кинетической характеристики этого пути перевода с высоким разрешением по-прежнему не хватает. Недавно мы разработали анализ in vitro для измерения кинетической системы перевода, зависящей от колпачка, с разрешением одной молекулы. Анализ основан на флуоресцентно помечены антитела связывания с зарождающейся эпитоп-тегами полипептида. Путем изображения связывания и диссоциации антител к зарождающимся пептидно-рибосомно-мРНК комплексов и из них можно отслеживать прогрессию перевода на отдельных мРНК. Здесь мы представляем протокол для установления этого анализа, включая подготовку мРНК и PEGylated слайдов, визуализацию перевода в режиме реального времени и анализ траекторий одной молекулы. Этот анализ позволяет отслеживать отдельные события перевода, зависящие от ограничения, и решает ключевые кинетики перевода, такие как инициация и удлинение ставок. Анализ может быть широко применен к отдельным системам перевода и должен в целом принести пользу в пробирке исследований зависит от ограничения перевода кинетики и переводческих механизмов контроля.

После протокола описано позволяет изображения отдельных взаимодействий антител с зарождающейся N-терминал помечены полипептидов с одной молекулы резолюции во время активного клеточного перевода 3 ' конец-tethered репортер mRNA (Рисунок 1). Минимальный демонстрационный экспе...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Отслеживание отдельных событий перевода позволяет проводить кинетические исследования механизмов перевода с высоким разрешением. Здесь мы демонстрируем одномекулярный анализ in vitro, основанный на взаимодействии изображений между флуоресцентно помеченными антителами и эпитопными зарождающимися пептидами. Этот метод позволяет одномекулярной характеристики инициации и пептидной кинетики удлинения во время активного в пробирке крышка-зависимый перевод.

In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Одиночных молекул Super-Resolution Imaging фосфатидилинозит 4,5-бисфосфат в плазматической мембране с новыми флуоресцентных зондов

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Простая, прочная и высокая пропускная способность одной молекулы потока растяжения Assay осуществления для изучения транспорт молекул вдоль ДНК

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...