Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01GM121847]; el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); y mskcc iniciativa genómica funcional.

1. Generación de ARNm reportero
<ol><li>Modifique una plantilla de transcripción de ADN que codifique un ARN de reportero "sin etiquetar" mediante la inserción de una secuencia de codificación de etiquetas de epitopo N-terminus para generar una plantilla de transcripción de ADN para un ARNm de reportero "etiquetado" (Figura 2A). NOTA: Se recomienda la interacción 3xFLAG/anti-FLAG para este ensayo debido a su sensibilidad superior y la corta longitud de la etiqueta 3xFLAG. Sin emba...

En comparación con los experimentos típicos in vitro de una sola molécula TIRF, la imagen de una sola molécula con el ensayo descrito aquí es adicionalmente compleja debido al uso de extracto celular y una alta concentración de anticuerpos etiquetados fluorescentemente. En comparación con la práctica más común de una ronda de superficie PEGylation, una segunda ronda de PEGylation (paso 2) reduce en gran medida la unión de anticuerpos no específicos a la superficie de detección15</s...

La traducción en sistemas eucariotas se produce predominantemente a través de vías dependientes de la tapa de 7-metilguanosina (m7G)1. Los estudios indican que el paso de iniciación de la traducción eucariota es la limitación de tipos y un objetivo común para lareglamentación 2,3,4. Los mecanismos de traducción dependiente de la tapa se han estudiado ampliamente utilizando enfoques genéticos5,bioquímicos6,7,8,estructurales9y genómicos agranel. Aunque estos métodos han identificado diversos mecanismos que regulan la iniciación dependiente de la tapa, su resolución los limita al ensamble de señales de eventos de iniciación heterogéneos y asincrónicos. Más recientemente, los eventos de traducción in vivo individuales han sido visualizados por métodos que miden la unión de anticuerpos fluorescentes a los epítopos en polipéptidos nacientes11,12,13,14. Sin embargo, estos nuevos enfoques también están limitados en su capacidad para resolver eventos de iniciación individuales porque múltiples anticuerpos fluorescentes deben unir un péptido naciente para permitir que los eventos de traducción única se resuelvan a partir de un alto fondo de fluorescencia intracelular. En muchas interacciones biológicas, los eventos cinéticos individuales resueltos han proporcionado información crítica sobre la comprensión de procesos biológicos complejos multipaso y repetitivos que no son posibles sincronizar a nivel molecular. Se necesitan nuevos métodos que puedan realizar un seguimiento de la dinámica de los eventos de traducción individuales para una mejor comprensión de la iniciación y la regulación dependientes de la limitación.
Recientemente desarrollamos un ensayo in vitro que mide la cinética de iniciación dependiente de la tapa con resolución de una sola molécula15. Teniendo en cuenta el gran número de factores proteicos conocidos y desconocidos implicados en esta vía de iniciación3,16,el ensayo de molécula única fue desarrollado para ser compatible con los sistemas de traducción in vitro existentes libres de células para beneficiarse de su preservación de factores celulares y su sólida actividad de traducción17,18,19,20,21,22,23,24,25. Además, el uso de sistemas de traducción sin células permite comparaciones más compatibles entre observaciones de moléculas únicas y resultados masivos anteriores. Este enfoque proporciona una integración directa de nuevos conocimientos cinéticos de molécula única en el marco mecanicista existente de la iniciación dependiente de la tapa. Para establecer el ensayo de una sola molécula, el sistema de traducción libre de células tradicional se modifica de tres maneras: se inserta una secuencia de codificación de epítopos al principio del marco de lectura abierto (ORF) de un ARNm reportero; el extremo de 3′ del ARNm reportero se biotinila para facilitar el anclaje final del ARNm a la superficie de detección de moléculas únicas; y anticuerpos con etiqueta fluorescente se complementan con el extracto de traducción. Estas modificaciones requieren únicamente técnicas básicas de biología molecular y reactivos comúnmente disponibles. Además, estas modificaciones y las condiciones de imagen de una sola molécula preservan la cinética de traducción de las reacciones de traducción masivas libres de células15.
En este ensayo(Figura 1),el ARNm de reportero biotinilado de 5'end tapado y 3′-end se inmoviliza a una superficie de detección recubierta de estreptavidina en una cámara de flujo. La cámara de flujo se llena con una mezcla de traducción libre de células complementada con anticuerpos etiquetados fluorescentemente. Después de que la traducción del ARNM se ha producido durante aproximadamente 30-40 codón aguas abajo de la secuencia de epítopos26,27,el epítopo emerge del túnel de salida ribosoma y se vuelve accesible para interactuar con anticuerpos con etiqueta fluorescente. Esta interacción es rápida y su detección mediante técnicas de imágenes de fluorescencia de una sola molécula permite el seguimiento de la cinética de traducción con resolución de una sola molécula durante la traducción activa sin células. Este ensayo debe beneficiar ampliamente los estudios in vitro de la cinética de traducción dependiente de la tapa y su regulación, particularmente para sistemas con un ensayo in vitro a granel de trabajo.
Un requisito previo para establecer este ensayo de molécula única es un ensayo de traducción a granel sin células de trabajo, que se puede lograr utilizando extracto de traducción que está disponible comercialmente o preparado siguiendo los métodos descritos anteriormente28. Extracto de traducción eucariota se puede obtener de diversas células, incluyendo hongo, mamífero, y planta28. Para la toma de imágenes, este ensayo requiere un microscopio TIRF equipado con intensidad láser ajustable y ángulo de incidente, una etapa de muestra motorizada, un sistema de fluidos motorizados y un dispositivo de control de temperatura de la muestra. Estos requisitos son genéricos para los experimentos tirf in vitro modernos de una sola molécula y pueden lograrse de manera diferente. El experimento presentado aquí utiliza un sistema TIRF de tipo objetivo compuesto por microscopio, software y accesorios disponibles comercialmente, todos enumerados en la Tabla de Materiales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

La síntesis de proteínas dependientes de la tapa es la vía de traducción predominante en las células eucariotas. Si bien varios enfoques bioquímicos y genéticos han permitido estudios exhaustivos de traducción dependiente de la tapa y su regulación, todavía falta una caracterización cinética de alta resolución de esta vía de traducción. Recientemente, desarrollamos un ensayo in vitro para medir la cinética de traducción dependiente de la tapa con resolución de una sola molécula. El ensayo se basa en la unión de anticuerpos etiquetado fluorescentemente a polipéptido naciente etiquetado con epítopo. Al tomar imágenes de la unión y disociación de anticuerpos hacia y desde complejos nacientes de péptido–ribosoma-ARNM, se puede realizar un seguimiento de la progresión de la traducción en los ARN individuales. Aquí, presentamos un protocolo para establecer este ensayo, incluyendo preparaciones de mRNA y diapositivas PEGylated, imágenes en tiempo real de traducción y análisis de trayectorias de moléculas únicas. Este ensayo permite el seguimiento de eventos de traducción dependientes de límites individuales y resuelve la cinética de traducción clave, como las tasas de iniciación y alargamiento. El ensayo puede aplicarse ampliamente a sistemas de traducción distintos y debe beneficiar ampliamente estudios in vitro de cinética de traducción dependiente de la tapa y mecanismos de control traslacional.

Seguir el protocolo descrito permite la toma de imágenes de interacciones individuales de anticuerpos con polipéptidos incipientes etiquetados con N-terminal con resolución de molécula única durante la traducción activa sin células de ARN de reportero de anclaje final de 3 ' (Figura 1). Se informa de un experimento de demostración mínimo con el uso de tres mRNAs sintéticos: LUC (codificación luciferasa sin etiquetar), LUCFLAG (codificación 3x...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

El seguimiento de eventos de traducción individuales permite estudios cinéticos de alta resolución de mecanismos de traducción dependientes de la tapa. Aquí demostramos un ensayo in vitro de una sola molécula basado en interacciones por imágenes entre anticuerpos etiquetados fluorescentemente y péptidos nacientes etiquetados con epitopos. Este método permite la caracterización de moléculas únicas de cinética de iniciación y elongación peptídica durante la traducción activa dependiente de la tapa in vitro.

Un ensayo de imágenes de molécula única in vitro para el análisis de cinética de traducción dependiente de la tapa

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Investigación

Bioquímica

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Captura de la cinética de la interacción de una proteína de canal iónico con moléculas pequeñas por el ensayo de interferometría de la Bio-capa

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...