Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); och MSKCC Functional Genomics Initiative.

1. Generation av reporter mRNA
<ol><li>Ändra en DNA-transkriptionsmall som kodar en massanalys "untagged" reporter mRNA genom att infoga en N-terminus epitop taggkodningssekvens för att generera en DNA-transkriptionsmall för en "taggad" reporter mRNA (Figur 2A). OBS: 3xFLAG/anti-FLAG interaktion rekommenderas för denna analys på grund av dess överlägsna känslighet och den korta 3xFLAG tagglängden. Analysen är dock kompatibel med andra epitop-/antikroppspar.</li>
	<li>Syntetise...

I jämförelse med typiska in vitro TIRF enmolekylsexperiment är enmolekylsavbildning med den analys som beskrivs här dessutom komplex på grund av användning av cellextrakt och en hög koncentration av fluorescerande märkt antikropp. Jämfört med den vanligare metoden med en omgång yt PEGylation minskar en andra omgång PEGylation (steg 2) kraftigt den ospecificerade antikroppsbindningen till detektionsytan15. Den höga koncentrationen av diffusa fluorescerande antikroppar orsakar ...

Översättning i eukaryota system sker främst genom 7-metylguanosin (m7G) cap-beroende vägar1. Studier visar att initieringssteget för eukaryota översättningar är räntebegränsande och ett gemensamt mål förförordning 2,3,4. Mekanismer för cap-beroende översättning har studerats utförligt med hjälp avgenetiska 5,biokemiska 6,7, 8,strukturella 9, ochgenomiska 10 bulk metoder. Även om dessa metoder har identifierat olika mekanismer som reglerar cap-beroende initiering, begränsar deras upplösning dem till ensemble genomsnitt av signaler från heterogena och asynkrona inledande händelser. På senare tid har enskilda in vivo-översättningshändelser visualiserats med metoder som mäter fluorescerande antikroppsbindning till epitoper på gryende polypeptider11,12,13,14. Men dessa nya metoder är också begränsade i sin förmåga att lösa enskilda initieringshändelser eftersom flera fluorescerande antikroppar måste binda en gryende peptid för att tillåta enstaka översättningshändelser att lösas från en hög intracellulär fluorescensbakgrund. I många biologiska interaktioner har lösta enskilda kinetiska händelser gett kritiska insikter om att förstå komplexa multisteg och repetitiva biologiska processer som inte är möjliga att synkronisera på molekylär nivå. Nya metoder som kan spåra dynamiken i enskilda översättningshändelser behövs för en bättre förståelse av cap-beroende initiering och reglering.
Vi utvecklade nyligen en in vitro-analys som mäter cap-beroende initieringskinetik med enmolekylsupplösning15. Med tanke på det stora antalet kända och okända proteinfaktorer som är involverade i denna initieringsväg3,16, utvecklades enmolekylsanalysen för att vara kompatibel med befintliga in vitro-cellfria översättningssystem för att dra nytta av deras bevarande av cellulära faktorer och robustöversättningsaktivitet 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Dessutom möjliggör användningen av cellfria översättningssystem mer kompatibla jämförelser mellan observationer med en molekyl och tidigare bulkresultat. Detta tillvägagångssätt ger en rak integration av nya kinetiska insikter med en molekyl i den befintliga mekanistiska ramen för cap-beroende initiering. För att fastställa enmolekylsanalysen modifieras det traditionella cellfria översättningssystemet på tre sätt: en epitopkodningssekvens sätts in i början av den öppna läsramen (ORF) hos en reporter mRNA; 3′ änden av reporter mRNA är biotinylerad för att underlätta mRNA end-tthering till enmolekyl detektionsyta; och fluorescerande märkta antikroppar kompletteras med översättningsextraktet. Dessa modifieringar kräver endast grundläggande molekylärbiologiska tekniker och allmänt tillgängliga reagenser. Dessutom bevarar dessa modifieringar och enmolekylsavbildningsförhållandena översättningskinetiken för bulkcellfria översättningsreaktioner15.
I denna analys (figur 1), är 5′-end kapsejsad och 3′-end biotinylerad reporter mRNA immobiliserad till en streptavidinbelagd detektionsyta i en flödeskammare. Flödeskammaren fylls sedan med en cellfri översättningsblandning kompletterad med fluorescerande märkta antikroppar. Efter mRNA översättning har inträffat för cirka 30-40 kodon nedströms epitopsekvensen26,27, epitopen framträder från ribosomutgångstunneln och blir tillgänglig för att interagera med fluorescerande märkt antikropp. Denna interaktion är snabb och dess detektion med enmolekyls fluorescensavbildningstekniker möjliggör spårning av översättningskinetik med enmolekylupplösning under aktiv cellfri översättning. Denna analys bör i stort sett gynna in vitro-studier av cap-beroende översättningskinetik och dess reglering, särskilt för system med en fungerande bulk in vitro-analys.
En förutsättning för att fastställa denna enmolekylsanalys är en fungerande bulkcellfri översättningsanalys, som kan uppnås med hjälp av översättningsextrakt som antingen är kommersiellt tillgängligt eller förberett enligt tidigare beskrivna metoder28. Eukaryotic översättning extrakt kan erhållas från olika celler, inklusive svamp, däggdjur och växt28. För avbildning kräver denna analys ett TIRF-mikroskop utrustat med tunabel laserintensitet och infallsvinkel, ett motoriserat provstadium, ett motoriserat fluidiksystem och provtemperaturregleringsanordning. Sådana krav är generiska för moderna TIRF-experiment in vitro och kan uppnås på olika sätt. Experimentet som presenteras här använder ett TIRF-system av objektiv typ som består av kommersiellt tillgängligt mikroskop, programvara och tillbehör som alla anges i materialförteckningen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

Cap-beroende proteinsyntes är den dominerande översättningsvägen i eukaryota celler. Medan olika biokemiska och genetiska metoder har tillåtit omfattande studier av cap-beroende översättning och dess reglering, saknas fortfarande högupplöst kinetisk karakterisering av denna översättningsväg. Nyligen utvecklade vi en in vitro-analys för att mäta cap-beroende översättningskinetik med enmolekylupplösning. Analysen är baserad på fluorescerande märkt antikroppsbindning till gryende epitopmärkt polypeptid. Genom att avbilda bindning och dissociation av antikroppar till och från gryende peptid-ribosom-mRNA-komplex kan översättningsprogressionen på enskilda mRNAs spåras. Här presenterar vi ett protokoll för att fastställa denna analys, inklusive mRNA och PEGylated glidpreparat, realtidsavbildning av översättning och analys av enmolekylbanor. Den här analysen möjliggör spårning av enskilda cap-beroende översättningshändelser och löser viktiga översättningskinetik, till exempel initierings- och förlängningshastigheter. Analysen kan tillämpas i stor utsträckning på distinkta översättningssystem och bör i stort sett gynna in vitro-studier av cap-beroende översättningskinetik och translationella kontrollmekanismer.

Enligt det beskrivna protokollet möjliggör avbildning av enskilda antikroppsinteraktioner med begynnande N-terminalmärkta polypeptider med enmolekylupplösning under aktiv cellfri översättning av 3' end-tthered reporter mRNA (Figur 1). Ett minimalt demonstrationsexperiment rapporteras med användning av tre syntetiska mRNAs: LUC (kodning av orolig luciferas), LUCFLAG (kodning 3xFLAG-märkt luciferas) och hp-LUCFLAG (LUC<su...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Spårning av enskilda översättningshändelser möjliggör högupplösta kinetiska studier av cap-beroende översättningsmekanismer. Här demonstrerar vi en in vitro-analys med en molekyl baserad på bildinteraktioner mellan fluorescerande märkta antikroppar och epitopmärkta gryende peptider. Denna metod möjliggör karakterisering av initiering och peptidförlängningskinetik under aktiv in vitro-cap-beroende översättning.

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Enda molekyl Super-upplösning avbildning av Fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat i plasmamembranet med nya fluorescerande Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fånga interaktion kineticsen av en jonkanal Protein med små molekyler av Bio-lager interferometri analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...