Name: an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01GM121847] tarafından desteklendi; Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (MSKCC) Destek Hibesi/Çekirdek Hibesi (P30 CA008748); ve MSKCC Fonksiyonel Genomik İnisiyatifi.

1. Muhabir mRNA'nın nesli
<ol><li>"Etiketli" bir muhabir mRNA için DNA transkripsiyon şablonu oluşturmak için bir N-terminus epitope etiket kodlama dizisi ekleyerek toplu test "etiketsiz" muhabir mRNA'yı kodlayan bir DNA transkripsiyon şablonunu değiştirin (Şekil 2A). NOT: Üstün hassasiyeti ve kısa 3xFLAG etiket uzunluğu nedeniyle bu test için 3xFLAG/bayrak karşıtı etkileşim önerilir. Bununla birlikte, test diğer epitop /antikor çiftleri ile uyumludur.</li>
	<li>Do...

Tipik in vitro TIRF tek moleküllü deneylere kıyasla, burada açıklanan test ile tek moleküllü görüntüleme, hücre ekstresi ve floresan etiketli antikorun yüksek konsantrasyonu nedeniyle ek olarak karmaşıktır. Bir tur yüzey PEGylation'ın daha yaygın uygulaması ile karşılaştırıldığında, ikinci bir PEGylation turu (adım 2), algılama yüzeyine spesifik olmayan antikor bağlanmasını büyük ölçüde azaltır15. Difüzör floresan antikorların yüksek konsantrasyo...

Ökaryotik sistemlerde çeviri ağırlıklı olarak 7-metilguanosin (m7G) kap bağımlı yollar1yoluyla gerçekleşir. Çalışmalar, ökaryotik çevirinin başlangıç adımının hız sınırlayıcı ve yönetmelik2, 3,4için ortak bir hedef olduğunu göstermektedir. Kapak bağımlı çeviri mekanizmaları genetik5, biyokimyasal6, 7 ,8,yapısal9ve genomik10 toplu yaklaşımlar kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu yöntemler kap bağımlı başlatmayı düzenleyen çeşitli mekanizmalar tanımlamış olsa da, çözünürlükleri onları heterojen ve zaman uyumsuz başlatma olaylarından gelen sinyallerin ortalamasıyla sınırlar. Daha yakın zamanda, bireysel in vivo çeviri olayları, nascent polipeptidleri 11 , 12 , 13,14üzerindeki epitoplara floresan antikor bağlanmasını ölçen yöntemlerle görselleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yeni yaklaşımların bireysel başlatma olaylarını çözme yetenekleri de sınırlıdır, çünkü çoklu floresan antikorların, tek çeviri olaylarının yüksek hücre içi floresan arka plandan çözülmesine izin vermek için bir nascent peptid bağlaması gerekir. Birçok biyolojik etkileşimde, çözülen bireysel kinetik olaylar, moleküler düzeyde senkronize olması mümkün olmayan karmaşık çok noktalı ve tekrarlayan biyolojik süreçleri anlamak için kritik içgörüler sağlamıştır. Kap'a bağımlı başlatma ve düzenlemenin daha iyi anlaşılması için bireysel çeviri olaylarının dinamiklerini izleyebilecek yeni yöntemlere ihtiyaç vardır.
Yakın zamanda tek moleküllü çözünürlük15ile kap bağımlı başlatma kinetiğini ölçen bir in vitro test geliştirdik. Bu başlangıç yolu3,16'da yer alan çok sayıda bilinen ve bilinmeyen protein faktörü göz önünealındığında,tek moleküllü test, hücresel faktörlerin korunmasından ve sağlam çeviri aktivitesinden yararlanmak için mevcut in vitro hücresiz çeviri sistemleriyle uyumlu olacak şekilde geliştirilmiştir17,18,19,20,21,22,23,24,25. Ayrıca, hücresiz çeviri sistemlerinin kullanımı, tek moleküllü gözlemler ve önceki toplu sonuçlar arasında daha uyumlu karşılaştırmalar sağlar. Bu yaklaşım, yeni tek moleküllü kinetik içgörülerin, kap bağımlı başlatmanın mevcut mekanistik çerçevesine doğrudan entegrasyonunu sağlar. Tek moleküllü tahlil oluşturmak için, geleneksel hücresiz çeviri sistemi üç şekilde değiştirilir: bir muhabir mRNA'nın açık okuma çerçevesinin (ORF) başına bir epitop kodlama dizisi eklenir; muhabir mRNA'nın 3′ ucu, mRNA'nın tek moleküllü algılama yüzeyine uç bağlamasını kolaylaştırmak için biyotinillenmiştir; ve floresan etiketli antikorlar çeviri özüne desteklenir. Bu değişiklikler sadece temel moleküler biyoloji tekniklerini ve yaygın olarak bulunan reaktifleri gerektirir. Ayrıca, bu değişiklikler ve tek moleküllü görüntüleme koşulları, toplu hücre içermeyen çeviri reaksiyonlarının çeviri kinetiğini korur15.
Bu tahlilde (Şekil 1), 5′-end kapaklı ve 3′-uç biyotiniled muhabir mRNA bir akış odasında streptavidin kaplı bir algılama yüzeyine hareketsiz hale getirilir. Akış odası daha sonra floresan etiketli antikorlarla desteklenmiş hücresiz bir çeviri karışımı ile doldurulur. MRNA çevirisi epitop dizisi 26 , 27'nin aşağı akışında yaklaşık30-40kodon meydana geldiktensonra,epitop ribozom çıkış tünelinden çıkar ve floresan etiketli antikorla etkileşime girmek için erişilebilir hale gelir. Bu etkileşim hızlıdır ve tek moleküllü floresan görüntüleme teknikleri ile algılanmasını, aktif hücresiz çeviri sırasında tek moleküllü çözünürlükle çeviri kinetiğinin izlenmesini sağlar. Bu tahlil, özellikle çalışan toplu in vitro teste sahip sistemler için, kap bağımlı çeviri kinetiğinin in vitro çalışmalarına ve düzenlenmesine geniş ölçüde fayda sağlamalıdır.
Bu tek moleküllü tahlilin kurulmasının bir ön koşulu, ticari olarak mevcut olan veya daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek hazırlanan çeviri özü kullanılarak elde edilebilen çalışan bir toplu hücre içermeyen çeviri tahlilidir28. Ökaryotik çeviri özü mantar, memeli ve bitki28dahil olmak üzere çeşitli hücrelerden elde edilebilir. Görüntüleme için, bu test ayarlanabilir lazer yoğunluğu ve olay açısı ile donatılmış bir TIRF mikroskobu, motorlu bir numune aşaması, motorlu akışkanlar sistemi ve numune sıcaklık kontrol cihazı gerektirir. Bu gereksinimler modern in vitro tek moleküllü TIRF deneyleri için geneldir ve farklı şekilde elde edilebilir. Burada sunulan deney, malzeme tablosundalistelenen ticari olarak kullanılabilen mikroskop, yazılım ve aksesuarlardan oluşan objektif tip bir TIRF sistemi kullanır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100X oil objective, N.A. 1.49</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acryamide/bis (40%, 19:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline liquid detergent</td>
			<td>Decon</td>
			<td>5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane)</td>
			<td>UCT Specialties, LLC</td>
			<td>A0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Solis software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Andor EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>532/640/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NF03-405/488/532/635E-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>309-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolterm software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For controlling the syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the microscope, camera, stage, and pump.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>R405/488/532/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1139450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>306-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1185500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen perioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Z-81226A</td>
			<td>Low auto-fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGASCRIPT T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-SVA</td>
			<td>Laysan Bio Inc</td>
			<td>mPEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS(PEG)4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (5M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 1.5 microscope Cover glass</td>
			<td>Fisherband</td>
			<td>12-544-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Laser, 532nm 100mM</td>
			<td>Olympus digital Laser system</td>
			<td>CMR-LAS 532nm 100mW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TirfCtrl software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the laser intensity and incident angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table</td>
			<td>TMC vibration control</td>
			<td>63-563</td>
			<td>With vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol chloroform isoamyl alcohol mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce RNA 3&#39; End Biotinylation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior motorized XY translation stage</td>
			<td>Prior</td>
			<td>PS3J100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prior PriorTest software</td>
			<td>Prior</td>
			<td></td>
			<td>For controlling the Prior motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNasin RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top Incubator</td>
			<td>In vivo scientific (world precision Instruments)</td>
			<td>98710-1</td>
			<td>With a custom built acrylic cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>43-4301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR green II</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>1725RN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>55-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (1M), pH = 7.0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AM9850G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>CPX1800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccinia Capping system</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymo-Spin IC Columns</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>C1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro single-molecule imaging assay for the analysis of cap-dependent translation kinetics

Kap bağımlı protein sentezi ökaryotik hücrelerde baskın çeviri yoludur. Çeşitli biyokimyasal ve genetik yaklaşımlar, kap bağımlı çeviri ve düzenlemesinin kapsamlı çalışmalarına izin vermiş olsa da, bu çeviri yolunun yüksek çözünürlüklü kinetik karakterizasyonu hala eksiktir. Son zamanlarda, kap bağımlı çeviri kinetiğini tek molekül çözünürlüğü ile ölçmek için bir in vitro test geliştirdik. Test, floresan etiketli antikorun nascent epitop etiketli polipeptide bağlanmasına dayanmaktadır. Antikorların nascent peptid–ribozom-mRNA komplekslerine bağlanması ve ayrışması görüntülenerek, bireysel mRNA'lardaki çeviri ilerlemesi izlenebilir. Burada, mRNA ve PEGylated slayt preparatları, çevirinin gerçek zamanlı görüntülenmesi ve tek molekül yörüngelerinin analizi de dahil olmak üzere bu tahlilin oluşturulması için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, kapak bağımlı çeviri olaylarının izlenmesini sağlar ve başlatma ve uzama oranları gibi anahtar çeviri kinetiğini çözümler. Test, farklı çeviri sistemlerine yaygın olarak uygulanabilir ve kap bağımlı çeviri kinetiği ve çeviri kontrol mekanizmalarının in vitro çalışmalarına geniş ölçüde fayda sağlamalıdır.

Açıklanan protokolün ardından, 3' son bağlı muhabir mRNA'nın aktif hücresiz çevirisi sırasında tek molekül çözünürlüğü ile nascent N-terminal etiketli polipeptitlerle bireysel antikor etkileşimlerinin görüntülenmesini sağlar (Şekil 1). Üç sentetik mRNA'nın kullanımıyla minimum bir gösteri deneyi rapor edilir: LUC (etiketlenmemiş lucifeaz kodlama), LUCFLAG (3xFLAG etiketli lucifease kodlaması) ve hp-LUC<s...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics at JoVE.com

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...