Name: lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia en Imágenes Moleculares Avanzadas (CE140100011) del Consejo Australiano de Investigación (http://www.imagingcoe.org/). Esta investigación se llevó a cabo en parte utilizando la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO, y hizo uso del detector de la Fundación Australiana de Investigación del Cáncer (ACRF).

1. Preparación de cristales en un medio viscoso alto utilizando jeringas de vidrio
<ol><li>Centrífuga la solución de cristal suavemente (~ 1,000 x g, ~ 10 min a 22 °C) para formar un pellet de cristal suave y eliminar el exceso de búfer. Esto dará lugar a una alta concentración de cristales en el pellet que se puede utilizar para la recopilación de datos. NOTA: Para evitar la dilución del medio viscoso aumentar la concentración de cristal en este paso. Optimice la relación entre el medio viscoso ...

<ol>
	<li>Boutet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+protein+structure+determination+by+serial+femtosecond+crystallography.">High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography.</a> Science. 337 (6092), 362-364 (2012).</li><li>Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. 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(115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

Se ha desarrollado un HVI alternativo, ideal para llevar a cabo experimentos SX en fuentes sincrotrón. Tiene dos ventajas clave sobre los HVIs existentes. En primer lugar, es fácil de instalar en la línea de haz que permite el cambio rápido entre la cristalografía convencional y SX, sólo ~ 30 minutos es necesario para la instalación y alineación en MX2. En segundo lugar, las jeringas de muestra utilizadas para cultivar cristales se pueden utilizar directamente como reservorios para inyección, lo que limita el de...

La cristalografía en serie (SX) es una técnica que se desarrolló inicialmente en el contexto de láseres electrónicos libres de rayos X (XFELs)1,2,3,4. Aunque los enfoques de destino fijos se pueden utilizar para SX5,6,7, normalmente, los sistemas de inyectores se emplean para entregar cristales en un flujo continuo al haz de rayos X. Debido a que combina datos de un gran número de cristales, SX evita la necesidad de cualquier alineación de cristal durante el experimento, y permite recopilar datos a temperatura ambiente8,9. Con la ayuda de un inyector adecuado, los cristales se transmiten uno por uno en el área de interacción de rayos X y los datos de difracción resultantes se recogen en un detector de área9,10. Hasta la fecha, SX ha tenido éxito en la resolución de una serie de estructuras proteicas1,11,12,13 incluyendo cristales demasiado pequeños para medir utilizando cristalografía convencional. También ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la dinámica molecular resuelta en el tiempo mediante la explotación de la duración del pulso femtosegundo de la XFEL. Al iniciar reacciones bomba-sonda con fuentes láser ópticas, se han realizado estudios en profundidad en el fotosistema II14,15,proteína amarilla fotoactiva16,17,citocromo C oxidasa18,así como bacteriorhodopsina19,20,21. Estos estudios han sondeado la dinámica de transferencia de electrones que se produce después de la activación de la luz que demuestra el potencial significativo de la cristalografía en serie para comprender los procesos biológicos resueltos por el tiempo.
El desarrollo de la cristalografía en serie también es cada vez más frecuente en las fuentes de sincrotrón9,12,20,22,23,24. SX basado en sincrotrón permite medir un gran número de cristales individuales eficientemente a temperatura ambiente utilizando un sistema de inyector adecuado. Este enfoque es adecuado para cristales más pequeños, por lo tanto, además de requerir un detector rápido de velocidad de fotogramas para recopilar los datos, también se requiere un haz microenfoque. En comparación con la cristalografía convencional, SX no implica el montaje y alineación de cristales individuales en el haz de rayos X. Debido a que los datos de un gran número de cristales individuales se fusionan, la dosis de radiación recibida por cada cristal se puede reducir sustancialmente en comparación con la cristalografía convencional. Synchrotron SX también se puede aplicar al estudio de reacciones resueltas en el tiempo, incluso hasta el régimen de milisegundos, siempre que haya un detector con una velocidad de fotogramas suficientemente alta (por ejemplo, 100 Hz o más). Se han llevado a cabo varios experimentos de cristalografía en serie en el sincrotrón utilizando inyectores que se desarrollaron inicialmente en fuentes XFEL20,22,23. Los dos tipos más comunes de inyector son la boquilla virtual dinámica de gas (GDVN)25 y el inyector viscoso alto (HVI)9,24,26,27,28. El GDVN es ideal para inyectar baja viscosidad, muestras líquidas, pero requiere altos caudales para lograr flujos estables, lo que a su vez conduce a altas tasas de consumo de muestras. Por el contrario, los HVI son adecuados para muestras de alta viscosidad que permiten la generación de una corriente estable a caudales mucho más bajos, lo que conduce a un consumo de muestra mucho menor. El inyector HVI, por lo tanto, favorece la entrega de muestras cuando un portador viscoso es preferible (por ejemplo, a base de lípidos para proteínas de membrana) y/o grandes cantidades de muestra no están disponibles. Los inyectores SX son generalmente difíciles de usar y requieren una amplia capacitación para operar. También implican largos protocolos de transferencia de muestras, ya que la muestra necesita ser cargada en un depósito especializado, esto generalmente tiene un alto riesgo asociado con que se pierda la muestra ya sea en el "volumen muerto" o a través de fugas en las conexiones. Por lo tanto, es deseable optimizar el diseño del inyector para mitigar cualquier pérdida antes de que la muestra llegue al haz de rayos X.
Recientemente, los primeros resultados de SX se publicaron usando Lipidico23 con un objetivo de lysozyme, utilizando un detector Eiger 16M. Este diseño del inyector limita el desperdicio de muestras al minimizar el número de pasos implicados en pasar de la cristalización inicial a la transferencia de cristales al inyector, seguido de la entrega de muestras al haz de rayos X. Este manuscrito describe y muestra el procedimiento de transferencia de muestras a partir de la preparación de la muestra, pasando al proceso de inyección y, finalmente, a la recopilación de datos, utilizando el mismo recipiente de cristalización. También se describe el funcionamiento del inyector.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

Se ha desarrollado una instalación para realizar mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. Esta instalación incorpora un inyector de alto viscoso construido específicamente, Lipidico, como parte de la línea de haz de cristalografía macromolecular (MX2) para medir un gran número de pequeños cristales a temperatura ambiente. El objetivo de esta técnica es permitir que los cristales se cultieran/transfieran a jeringas de vidrio para ser utilizados directamente en el inyector para la recopilación de datos de cristalografía en serie. Las ventajas de este inyector incluyen la capacidad de responder rápidamente a los cambios en el caudal sin interrupción de la corriente. Existen varias limitaciones para este inyector de alta viscosidad (HVI) que incluyen una restricción a las viscosidades de muestra permitidas a >10 Pa.s. La estabilidad de la secuencia también puede ser un problema en función de las propiedades específicas del ejemplo. Aquí se presenta un protocolo detallado sobre cómo configurar muestras y utilizar el inyector para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. El método demuestra la preparación de la muestra, incluyendo la transferencia de cristales de liozima a un medio viscoso alto (grasa de silicona), y el funcionamiento del inyector para la recolección de datos en MX2.

Lipidico es un HVI construido como un sistema de entrega alternativo para su uso en MX2 (Figura 1). Es ideal para SX, donde los cristales se cultivan en fase cúbica lipídica o se transfieren a un medio inerte viscoso alto.
Para demostrar la aplicación del inyector, la grasa de silicona mezclada con cristales de liozima se utilizó para recopilar datos SX en la línea de haz MX2 en el sincrotrón australiano. Para montar el inyector en la línea de haz MX2, la b...

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Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo preparar muestras de cristalografía en serie para la recopilación de datos en un inyector viscoso alto, Lipidico, recientemente encargado en el sincrotrón australiano.

Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Investigación

Bioingeniería

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica

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Síntesis de hidrogeles con propiedades antiincrustantes como membranas de purificación de agua

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Medidas de entrada de potencia en biorreactores agitados a escala de laboratorio

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

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Inyección de nanopartículas de Retroductal a la glándula submaxilar de ratón

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Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Sistema Centrífugo de Contraflujo Automatizado para Procesamiento celular a pequeña escala

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Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

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Cuantificación experimental de las interacciones entre los sistemas de administración de fármacos y las células in vitro: una guía para la evaluación preclínica de nanomedicina