Name: quantifying the brain metastatic tumor micro-environment using an organ-on-a chip 3d model, machine learning, and confocal tomography
Uploaded: 2020-08-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography at JoVE.com

हम नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट में एमडीए-एमबी-231-बीआर-जीएफपी कोशिकाओं के उदार दान के लिए स्टीग लैब को धन्यवाद देते हैं । यूनिवर्सिटी ऑफ मिशिगन बायोइंटरफेस इंस्टीट्यूट (बीआई) में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया । फ्लो साइटोमेट्री यूनिवर्सिटी ऑफ मिशिगन फ्लो साइटोमेट्री कोर में किया गया था। वायरल वैक्टर मिशिगन विश्वविद्यालय वेक्टर कोर द्वारा बनाए गए थे । हम इन आंकड़ों के सांख्यिकीय विश्लेषण में मार्गदर्शन के लिए केले किडवेल को भी धन्यवाद देते हैं।
धन:
C.R.O. आंशिक रूप से एक NIH टी-३२ प्रशिक्षण फैलोशिप (T32CA009676) और 1R21CA245597-01 द्वारा समर्थित किया गया था । टी.M डब्ल्यू आंशिक रूप से 1R21CA245597-01 और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के अनुवाद विज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए केंद्र द्वारा पुरस्कार संख्या UL1TR0022240 द्वारा समर्थित किया गया था । पुरस्कार संख्या 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor फाउंडेशन, और स्तन कैंसर अनुसंधान फाउंडेशन के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा सामग्री और लक्षण वर्णन के लिए धन प्रदान किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है

1. रक्त मस्तिष्क बाधा आला मोल्ड तैयार
नोट: इस मंच में उपयोग किया जाने वाला खेती उपकरण एक पीडीएमएस आधारित पाड़ है जिस पर हम एक सेलुलर रक्त मस्तिष्क बाधा का निर्माण करते हैं। यह एक छिद्रपूर्ण झिल?...

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हमने एक नई विधि विकसित की है और प्रस्तुत की है जो मस्तिष्क के ऊतकों में एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं के अपव्यय और प्रवास के मापन के लिए अक्सर नैदानिक इमेजिंग विश्लेषणों में उपयोग किए ?...

मस्तिष्क मेटास्टेस सबसे घातक कैंसर घाव हैं; सभी कैंसर का 10-30% मस्तिष्क के लिए मेटास्टेसाइज, केवल ~ 5-20 महीने के औसत अस्तित्व के साथ, कैंसर प्रकार1,,2पर निर्भर करता है । कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करते समय एक प्रमुख प्रश्न यह उठता है कि उप क्लोन रक्तधारा के विनोदी वातावरण से मस्तिष्क3,4जैसे अंग में कैसे प्रवास करते हैं । इस सवाल के कारण पलायन, आक्रमण और अपर्णा में कई भिन्नताएं हैं। ये सभी विधियां कोशिकाओं के गुणों को गिनने या मापने के महत्वपूर्ण कदम को साझा करती हैं जो उत्तेजना के जवाब में एक स्थान से दूसरे स्थान पर जाती हैं। अधिकांश माइग्रेशन परख आसानी से उपलब्ध है कैंसर कोशिकाओं के दो आयामी (2 डी) प्रवास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। इनसे ज्ञान का खजाना स्पष्ट हो गया है; हालांकि, वे वीवो सिस्टम में तीन आयामी प्रकृति का पुनर्पूंजीकरण नहीं करते हैं कि अन्य तरीके5प्रदान कर सकते हैं । इसलिए, त्रि-आयामी (3 डी) प्रणालियों में ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण (टीएमई) का अध्ययन करना आवश्यक है, लेकिन 3 डी संरचनाओं के लिए उपलब्ध विश्लेषण दृष्टिकोण सीमित हैं और अक्सर असंगत होते हैं।
सबसे लोकप्रिय 3 डी उपकरणों में से एक बॉयडन चैंबर है जिसमें एक कुएं के तल पर निलंबित झिल्ली होती है, जो दो अलग-अलग क्षेत्रों को अलग करती है। बॉयडन ने ल्यूकोसाइट केमोटैक्सिस4का अध्ययन करने के लिए परख की शुरुआत की । निचले क्षेत्रों को निचले क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए ऊपरी क्षेत्र में कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए रसायन विज्ञान या अन्य साधनों6,,7 द्वारा भिन्न किया जा सकता है। माइग्रेट की गई कोशिकाओं की संख्या को निर्धारित करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण यह है कि एक बफर समाधान का उपयोग करके झिल्ली के नीचे से कोशिकाओं को जारी किया जाए, उन्हें lyse किया जाए, और फिर समाधान7में डीएनए सामग्री की मात्रा के आधार पर उन्हें गिनें। यह अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण तकनीक परिवर्तनशीलता के कारण ऑपरेटर त्रुटि से ग्रस्त है और प्रक्रिया कैंसर फेनोटाइप और सूक्ष्म पर्यावरण के बारे में जानकारी को नष्ट कर देती है। बॉयडन चैम्बर परख की विविधताओं में झिल्ली पर रहने वाली प्रवासी कोशिकाओं का निर्धारण शामिल है, लेकिन केवल उन कोशिकाओं की गिनती प्रदान करता है जो,अब निरंतर अध्ययन6,,8,9के लिए व्यवहार्य नहीं हैं।
बॉयडन चैंबर की सीमाओं और माइक्रोफ्लुइडिक समुदाय में नवाचारों के विकास के कारण, माइग्रेशन परख चिप्स विकसित किए गए हैं जो तीन 10 ,11, 12,11,12के बजाय एक दिशा में उत्तेजना के जवाब में कोशिकाओं की गति का पालन करते हैं। ये माइग्रेशन परख प्रवाह या एकल कोशिका पृथक्करण13, 14,14 जैसे कारकों पर नियंत्रण की सुविधा प्रदान करते हैं जो परिणामों की बेहतर व्याख्या को सक्षम करते हैं; हालांकि, उनका 2D प्रारूप अनिवार्य रूप से कुछ गतिशील जानकारी खो देता है। हाल के अध्ययनों में 3 डी वातावरण14, 15,15में एक ऊतक में परिसंचरण से कोशिकाओं की आवाजाही (यानी, रक्त मस्तिष्क बाधा) पर ध्यान केंद्रित किया है। सेलुलर बैरियर/झिल्ली पर होने वाले ऊतक और जांच व्यवहार में अपूथ दूरी बॉयडन चैंबर या 2डी माइक्रोफ्लुइडिक माइग्रेशन डिवाइस16का उपयोग करके प्राप्त मापों की तुलना में अधिक परिष्कृत होती है । इस प्रकार, उपकरणों है कि उचित इमेजिंग और 3 डी एक्स्ट्राावेशन के विश्लेषण सक्षम इन परिष्कृत माप पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन साहित्य में कमी कर रहे हैं ।
माइग्रेशन परख से स्वतंत्र, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और टोमोग्राफी के लिए मजबूत इमेजिंग तकनीक विकसित की गई है जो 3 डी स्पेस17,,18में ऊतकों की पहचान और सटीक पुनर्निर्माण करने में सक्षम हैं। ये तकनीकें ऊतक के गुणों के आधार पर जेड-स्टैक और छवि के खंड भागों में छवियां प्राप्त करती हैं और फिर खंडित छवियों को त्रि-आयामी meshes19,20,,21में परिवर्तित करती हैं।, यह चिकित्सकों को 3 डी व्यक्तिगत अंगों, हड्डियों और जहाजों में कल्पना करने की अनुमति देता है ताकि कैंसर या हृदय रोगके,निदान में शल्य चिकित्सा योजना या सहायता में सहायता की जासके। यहां, हम बताएंगे कि इन दृष्टिकोणों को सूक्ष्म नमूनों और 3 डी अपूश उपकरणों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
इस उद्देश्य के लिए, हमने अभिनव कॉन्फोकल टोमोग्राफी तकनीक विकसित की, जो यहां प्रस्तुत की गई है, जो मौजूदा टोमोग्राफी उपकरणों को अनुकूलित करके एक झिल्ली में ट्यूमर कोशिकाओं के अपव्यय का अध्ययन करने के लिए लचीलापन प्रदान करती है। यह दृष्टिकोण कैंसर सेल व्यवहार के पूर्ण सरगम के अध्ययन को सक्षम बनाता है क्योंकि वे एक सेलुलर बाधा के साथ बातचीत करते हैं, जैसे कि एंडोथेलियल सेल परत। कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार की जांच प्रदर्शन; कुछ आक्रमण कर सकते हैं, लेकिन झिल्ली के करीब रहते हैं, जबकि अन्य बाधा को आसानी से पार करते हैं। यह तकनीक सभी आयामों24में कोशिका के फेनोटाइप के बारे में जानकारी देने में सक्षम है । टीएमई का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करना अपेक्षाकृत सस्ती, व्याख्या करने में आसान और प्रजनन योग्य दोनों है, जब वीवो मुरीन मॉडल में अधिक जटिल की तुलना में। प्रस्तुत पद्धति स्ट्रोमल क्षेत्र को अनुकूल बनाकर कई प्रकार के ट्यूमर और सूक्ष्म वातावरण के अध्ययन के लिए एक मजबूत आधार प्रदान करना चाहिए।
हम 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक रक्त मस्तिष्क आला (μmBBN) मंच(चित्रा 1)के उपयोग का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं जहां बाधा और आला (मस्तिष्क सूक्ष्मकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स) के महत्वपूर्ण तत्वों को एक विस्तारित अवधि (लगभग 9 दिनों तक) के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, फ्लोरोसेंटली रूप से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेज डे, और हमारे कॉन्फोसल टॉमोग्राफी का उपयोग करके पुनर्निर्माण की गई छवियां(चित्रा 2) सभी के उद्देश्य से माइक्रो मेटास्टेसिस के विकास को समझने और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण में परिवर्तन एक दोहराने योग्य और मात्रात्मक तरीके से । मस्तिष्क आला के साथ रक्त मस्तिष्क बाधा इंटरफेस मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं से बना है जो बेसमेंट झिल्ली, एस्ट्रोसाइट पैर, और पेरिसाइट्स25द्वारा मजबूत होते हैं। हमने रक्त मस्तिष्क बाधा के गठन और विनियमन में उनके महत्व को देखते हुए एस्ट्रोसाइट और एंडोथेलियल घटकों पर चुनिंदा रूप से ध्यान केंद्रित किया। हम इस मंच का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं और ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण सेलुलर और विनोदी घटकों का निर्माण, बीज, छवि और विश्लेषण कैसे करते हैं, इसका प्रदर्शन करते हैं। अंत में, हम दिखाते हैं कि कैसे मशीन लर्निंग का उपयोग कैंसर कोशिकाओं के आंतरिक फेनोटाइपिक मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एक मॉडल μmBBN के माध्यम से पारगमन करने में सक्षम हैं और उन्हें मस्तिष्क मेटास्टेटिक क्षमता24का एक उद्देश्य सूचकांक प्रदान करने के लिए। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा सेट का उपयोग मेटास्टेसिस, चिकित्सीय रणनीतियों और दोनों में टीएमई की भूमिका के बारे में बुनियादी और अनुवादात्मक सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA with phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm biopsy punch with plunger</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS, without Ca and Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL pipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 mm wide packing tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-072-097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 x 75 mm glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>box cutter blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1721575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0879005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Heat inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMEC/D3</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCC066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter notebook</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced with phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231-BR-GFP</td>
			<td>Dr. Patricia Steeg, NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 growth supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal human astrocytes (NHA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange software</td>
			<td>University of Ljubljana</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography masks</td>
			<td>Photosciences Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7-dsRed</td>
			<td>University of Michigan Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL-EV-GFP</td>
			<td>University of Michigan Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLOX-TERT-iresTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate membrane, 5um pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol, 3 mg/mL</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td>Type I bovine collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo cup</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1416545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td>MicroChem Corporation</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 developer</td>
			<td>MicroChem Corporation</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth Adhesive Company</td>
			<td>NC0162601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179965-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricholoro perfluoro octyl silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the brain metastatic tumor micro-environment using an organ-on-a chip 3d model, machine learning, and confocal tomography

मस्तिष्क मेटास्टेस सबसे घातक कैंसर घाव हैं; कैंसर के प्रकार के आधार पर, केवल ~ 5-20 महीनों के औसत अस्तित्व के साथ, सभी कैंसर का 10-30% मस्तिष्क में मेटास्टेसाइज करता है। मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर बोझ को कम करने के लिए, बुनियादी और अनुवाद ज्ञान में अंतराल को दूर करने की जरूरत है । प्रमुख चुनौतियों में प्रजनन योग्य प्रीक्लीनिकल मॉडल और संबद्ध उपकरणों की कमी शामिल है। मस्तिष्क मेटास्टेसिस के त्रि-आयामी मॉडल समर्पित विश्लेषण उपकरणों के साथ संयुक्त होने पर इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक आणविक और फेनोटाइपिक डेटा प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, मुरीन मॉडल की तुलना में, रोगी ट्यूमर कोशिकाओं के अंग-ऑन-ए-चिप मॉडल मस्तिष्क माइक्रोएनवायरमेंट में रक्त मस्तिष्क बाधा को पार करते हैं, तेजी से परिणाम उत्पन्न करते हैं और मात्रात्मक तरीकों के साथ अधिक व्याख्या योग्य होते हैं, इस प्रकार उच्च थ्रूपुट परीक्षण के लिए उत्तरदायी होते हैं। यहां हम एक उपन्यास 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक रक्त मस्तिष्क आला (μmBBN) मंच के उपयोग का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं जहां आला के कई तत्वों को एक विस्तारित अवधि (कई दिनों) के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट रूप से इमेज्ड, और एक अभिनव कॉन्फोकल टोमोग्राफी तकनीक का उपयोग करके पुनर्निर्मित छवियों; सभी का उद्देश्य माइक्रो-मेटास्टेसिस के विकास और ट्यूमर माइक्रो-पर्यावरण (टीएमई) में एक दोहराने योग्य और मात्रात्मक तरीके से परिवर्तन को समझना है। हम इस मंच का उपयोग करके कैंसर कोशिकाओं और टीएमई सेलुलर और ह्यूमरल घटकों का निर्माण, बीज, छवि और विश्लेषण कैसे करते हैं, इसका प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि कैसे आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (एआई) का उपयोग कैंसर कोशिकाओं के आंतरिक फेनोटाइपिक मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जाता है जो एक मॉडल μmBBN के माध्यम से पारगमन करने में सक्षम हैं और उन्हें मस्तिष्क मेटास्टैटिक क्षमता का एक उद्देश्य सूचकांक प्रदान करते हैं। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा सेट का उपयोग मेटास्टेसिस के बारे में बुनियादी और अनुवादात्मक प्रश्नों, चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता और दोनों में टीएमई की भूमिका के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

इस तकनीक का उपयोग करके, हमने विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों के साथ लेबल किए गए सेल प्रकारों का विश्लेषण किया। हम hCMEC/D3-DsRed और गैर फ्लोरोसेंट एस्ट्रोसाइट्स के साथ तैयार एक μmBBN चिप के साथ इस दृष्टिकोण के...

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Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

यहां, हम एक रक्त मस्तिष्क बाधा मेटास्टेटिक ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण को तैयार करने और उसे बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और फिर कॉन्फोकल इमेजिंग और आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (मशीन लर्निंग) का उपयोग करके अपने राज्य की मात्रा निर्धारित करते हैं।

एक अंग पर एक चिप 3 डी मॉडल, मशीन लर्निंग, और Confocal टोमोग्राफी का उपयोग कर मस्तिष्क मेटास्टेटिक ट्यूमर माइक्रो पर्यावरण की मात्रा

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

कन्फोकल टोमोग्राफी कैंसर सेल व्यवहार का पूरा सरगम प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था, क्योंकि वे सेलुलर बाधा और आला के साथ बातचीत करते हैं। यह विधि मेटास्टेस का अध्ययन करने के लिए एक आधार प्रदान करती है क्योंकि वे होते हैं। यह दृष्टिकोण लाइव सेल व्यवहार की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी है।कॉन्फोकल टोमोग्राफी, जब मशीन लर्निंग के साथ संयुक्त होती है, तो विभिन्न प्रकार के अंग-ऑन-ए-चिप प्लेटफार्मों के लिए उपयोगी होती है। प्राथमिक या आवर्ती ट्यूमर का विश्लेषण करना या ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी करना मस्तिष्क मेटास्टेस की भविष्यवाणी करने और गैर मस्तिष्क मेटास्टैटिक कोशिकाओं से मस्तिष्क मेटास्टैटिक को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण का गठन कर सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक बीबीएन डिवाइस को इकट्ठा करने के लिए, वैक्यूम डेसिकेटर से एक डिवाइस को एक उपयुक्त सतह पर स्थानांतरित करें जिसमें इनलेट्स का सामना करना पड़ता है और पूरे सेटअप को प्लाज्मा कक्ष में रखें।एक प्लाज्मा कक्ष में पूरे सेटअप प्लेस और ८० वाट पर 30 सेकंड के लिए प्लाज्मा के साथ डिवाइस के इलाज से पहले एक वैक्यूम खींचो । उपचार के अंत में, डिवाइस को जल्दी से रखने के लिए एक गाइड का उपयोग करें, डिवाइस के पीडीएमएस और स्लाइड के बीच एक स्थायी बंधन बनाने के लिए लैब बेंच पर ग्लास स्लाइड पर इनलेट साइड करें। इसके बाद, 200 माइक्रोलिटर पिपेट टिप्स डालें, टिप से दो मिलीमीटर इनलेट्स और आउटलेट्स में काटें और डिवाइस को आठ मिनट, 200 वाट प्लाज्मा ट्रीटमेंट के लिए प्लाज्मा चैंबर में रखें।डिवाइस ठंडा होने के बाद, डिवाइस को बाँझ माध्यमिक कंटेनर में रखें और प्लाज्मिड उपचार के 15 मिनट के भीतर, नीचे कक्ष के लिए पिपेट टिप के माध्यम से डिवाइस में कोलेजन एस्ट्रोसाइट समाधान के 120 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। विपरीत पिपेट टिप में कक्ष भर में बाती करने के लिए समाधान की अनुमति दें और डिवाइस के अगले चैनल को भरें। जब डिवाइस के सभी चार चैनल भर गए हों तो चिप को एक घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।जब कोलेजन सेट किया है, उपयुक्त पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के साथ नीचे चैंबर खिला पिपेट युक्तियों के सभी बिल और 2% विकास कारक कम मैट्रिक्स के साथ ऊपरी कक्ष कोट, पूर्ण एंडोथेलियल माध्यम में । जब दोनों कक्षों को कोडित कर दिया गया हो, तो डिवाइस को उपयुक्त माध्यम के साथ ऊपरी कक्ष को धोने से पहले एक घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखें। बारी युक्तियां, एक बार 10 के 30 माइक्रोलीटर उचित माध्यम के मिलीलीटर प्रति छठे एंडोथेलियल कोशिकाओं को देखें, ऊपरी कक्ष में सुझावों के माध्यम से हर 15 मिनट, प्रति टिप कोशिकाओं के कुल चार aliquots के लिए ।सीडिंग के बीच में डिवाइस को इनक्यूबेट करें। जब सभी एंडोथेलियल कोशिकाओं को वरीयता दी गई है, तो सभी सुझावों को माध्यम से भरें और डिवाइस को 48 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। जब एंडोथेलियल परत परिपक्व हो जाती है, तो सेल संस्कृति माध्यम की भरपाई करने के लिए चिप में माध्यम को प्रति स्थान दें और प्रत्येक शीर्ष कक्ष चैनल को एक बार 10 के 30 माइक्रोलीटर के साथ उचित माध्यम के छह कैंसर कोशिकाओं को छह कैंसर कोशिकाओं के साथ बीज दें।कोशिकाओं के प्रत्येक 30 माइक्रोलीटर aliquot के बाद वरीयता प्राप्त किया गया है, 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर के लिए डिवाइस वापस तो उचित माध्यम के साथ सभी सुझावों को भरने के लिए 24 से ४८ घंटे के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए डिवाइस वापसी । डिवाइस को सुसंस्कृत और इमेज्ड करने के बाद, कैंसर कोशिकाओं के फेनोटाइप को मापने के लिए, प्रदान किए गए सॉफ्टवेयर को खोलें और स्मृति में कॉन्फोकल इमेज पढ़ें। सॉफ्टवेयर प्रत्येक रंग चैनल को 3डी कॉन्फोकल इमेज से एक अलग टिफ फाइल में बचाएगा।प्रत्येक माइक्रोस्कोप चैनल के लिए परिवर्तन अस्पष्टता मूल्यों का चयन करें और छवि में मौजूद रंग चैनलों के लिए चैनल अल्फा मूल्य को समायोजित करें, जैसे कि पृष्ठभूमि को हटा दिया जाता है और कोशिकाओं के भीतर केवल फ्लोरोसेंट रहता है। प्रभाव की कल्पना करने के लिए, थ्रेसहोल्ड को सही ढंग से सेट करने के लिए 3D रेंडरिंग का चयन करें और यदि छवि सही दिखती है, तो प्रयोग ट्रैकर स्प्रेडशीट में अस्पष्टता मूल्यों को सहेजें। फिर, वॉल्यूम इमेज को वीटीके डेटा फॉर्मेट में सहेजे गए अलग-अलग 3डी त्रिकोणीय मेशेड ऑब्जेक्ट्स में बदलने के लिए मार्चिंग क्यूब्स का उपयोग करें।एंडोथेलियल बैरियर के लिए एक विमान फिट करने के लिए, पहले सेल सेंट्रोइड का पता लगाएं। उन क्षेत्रों को निकालने के लिए वीटीके फ़ाइल में meshes की सूची के माध्यम से छंटने के लिए पॉलीडेटा कनेक्टिविटी फ़िल्टर का उपयोग करें जो जुड़े हुए नहीं हैं। प्रत्येक जाल के सेंट्रोइड की गणना करें और माप को उन मेश के लिए फ़िल्टर करने वाले सेंट्रोइड की सूची में जोड़ें जो बहुत बड़े या बहुत छोटे हैं।एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए सेंट्रोइड की सूची में एक विमान फिट करने के लिए, त्रुटि विधि के एक न्यूनतमीकरण का उपयोग करें, विमान को फिट करने और प्लॉट करने और विमान के फिट का निरीक्षण करने के लिए इमेजोइंग आरएफपी सेंट्रोइड और प्लेन फिट चलाएं, फिट को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। जब प्लेन को ठीक से फिट किया गया हो तो प्लेन के नॉर्मल को एक्सपेरिमेंट ट्रैकर फाइल में सेव कर लें। एक विमान के साथ एंडोथेलियल परत की विशेषता के बाद प्रत्येक कैंसर कोशिकाओं फेनोटाइप को मापने के लिए, सेल विश्लेषण समारोह लोड करें और प्रयोग ट्रैकर जानकारी में पढ़ें और मौजूद चैनलों का विश्लेषण करें "वीटीके फ़ाइल में प्रत्येक क्षेत्र का वार्नेट और विश्लेषण करने के लिए।प्रत्येक क्षेत्र के लिए, फ़ंक्शन प्रत्येक कोशिका को क्लिप करेगा ताकि झिल्ली के नीचे की जाली की गणना की जा सके। सेलुलर फेनोटाइप को मापने के लिए, प्रत्येक कैंसर कोशिका के आकार, मात्रा और स्थिति की गणना करें। फिर एंडोथेलियल बैरियर के माध्यम से अपूस्पेंड करने वाली कोशिका के प्रतिशत की गणना करने के लिए प्रत्येक काटा गया कैंसर सेल की मात्रा और स्थिति को मापें।कई प्रयोगों के लिए इन चरणों को करने के बाद डेटा को स्प्रेडशीट में डेटा को सहेजने के लिए एक एक्सएलएक्स फाइल के रूप में निर्यात करते हैं। एक कॉन्फ्लोटिक एंडोथेलियल बैरियर के साथ एक माइक्रोफ्लुइड बीबीएन चिप प्रयोग के लिए स्वीकार्य है, जबकि विशेष रूप से खराब एंडोथेलियल कवरेज के साथ एक माइक्रोफ्लुइड बीबीएन चिप नहीं है। इस प्रतिनिधि विश्लेषण में कैंसर सेल लाइन की मांग मस्तिष्क, कोशिकाओं की एक उपजनसंख्या प्रदर्शित करता है जो एंडोथेलियल बैरियर के पार एक्स्ट्राावेशन करता है और एक्सपोजर के दो और नौ दिनों में माइक्रोफ्लुइडिक बीबीएन चिप के मस्तिष्क आला अंतरिक्ष में गहराई से प्रवास करता है, माता-पिता की कैंसर कोशिकाओं ने मस्तिष्क आला अंतरिक्ष से दूर बाधा के शीर्ष पर कोशिकाओं का एक पर्याप्त अनुपात बनाए रखा , जबकि मस्तिष्क मेटास्टैटिक कैंसर सेल जनसंख्या कोशिकाओं का एक अनुपात है कि १००% से अधिक अतिव्ययाकृत थे बनाए रखा ।कैंसर सेल आकार के रूपात्मक मात्राकरण ने संकेत दिया कि माता-पिता की कोशिकाओं ने कम गोलाकार आकार की कोशिकाओं का प्रदर्शन किया, जो एक के बाद एक बोने वाले होते हैं, जबकि दो और नौ दिनों की बातचीत के बाद दोनों कैंसर सेल लाइनें उनकी स्पेरीसिटी को कम करने की ओर ट्रेंड करती हैं। इसके अलावा, कैंसर सेल उपजनसंख्या है कि एस्ट्रोट्रिक आला में एक्स्ट्राावेशन आकार में छोटे थे, कैंसर की कोशिकाओं की तुलना में है कि मस्तिष्क में एक्स्ट्राावेशन के बिना एंडोथेलियल बाधा के साथ बातचीत में बने रहे । मस्तिष्क कैंसर सेल लाइनों और रोगी व्युत्पन्न xenografts की मांग, माइक्रोफ्लुइडिबिक बीबीएन चिप में एक फेनोटाइपिक पैटर्न प्रदर्शित करता है जिसका शोषण मशीन लर्निंग द्वारा मस्तिष्क मेटास्टैटिक और गैर मस्तिष्क मेटास्टैटिक कैंसर कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है।आत्म चयन महत्वपूर्ण है । उच्च, कम मार्ग संख्या वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं ने परिवर्तनीय बाधा व्यवहार प्रदर्शित किए। इसके अलावा, कैंसर की कोशिकाओं और उनके फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति समय के साथ बदल सकते हैं।इस प्रक्रिया के बाद, शोधकर्ताओं ने मेटास्टेस के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए डिवाइस में गुप्त के घर या कोशिकाओं की आणविक प्रोफाइलिंग को नियोजित कर सकते हैं। यह तकनीक समय के साथ आला घटकों की मात्रात्मक इमेजिंग के साथ एक इंजीनियर माइक्रोएनवायरमेंट के संयोजन से कैंसर कोशिकाओं और उनके माइक्रोएनवायरमेंट के बीच जटिल बातचीत की खोज में सक्षम बनाती है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Imaginal डिस्क ट्यूमर आदर्श: दृश्य और जीन अभिव्यक्ति और ट्यूमर invasiveness की मात्रा जेनेटिक मोज़ाइक का प्रयोग

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

जिगर में कोलोरेक्टल मेटास्टेसिस के उन्नत पशु मॉडल: इमेजिंग तकनीक और metastatic क्लोन का गुण

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

ट्यूमर के ऊतकों में उच्च प्रवाह चिप-अनुक्रमण का उपयोग कर क्रोमेटिन राज्यों के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए एक एकीकृत मंच

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation प्रयोग Murine ब्रेन ट्यूमर Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऊतक के उपयोग-जैविक रूप से प्रासंगिक मेटास्टेटिक ट्यूमर की स्थापना के लिए सेलुलर आरोपण निर्देशित Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

डिजिटल पोलीमरेज़ एक छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस रोगी में आनुवंशिक भिंनता के लिए श्रृंखला प्रतिक्रिया परख चिप का उपयोग कर-a-ट्यूब प्रारूप

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

ट्यूमर के नैदानिक आवेदन ग्लियोब्लास्टोमा में खेतों चिकित्सा उपचार

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

अनुदैर्ध्य रूपात्मक और तीन आयामी ट्यूमर की शारीरिक निगरानी Spheroids ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

उच्च संकल्प Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी ट्यूमर स्फीरॉइड आक्रमण पर Migrastatic inhibitors के प्रभाव का चरित्र

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...