Name: quantifying the brain metastatic tumor micro-environment using an organ-on-a chip 3d model, machine learning, and confocal tomography
Uploaded: 2020-08-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography at JoVE.com

Ringraziamo lo Steeg Lab, del National Cancer Institute per la generosa donazione di cellule MDA-MB-231-BR-GFP. La microscopia confocale è stata eseguita presso l'Istituto Biointerfaces dell'Università del Michigan (BI). La citometria del flusso è stata eseguita presso l'University of Michigan Flow Cytometry Core. I vettori virali sono stati creati dall'Università del Michigan Vector Core. Ringraziamo anche Kelley Kidwell per la guida nell'analisi statistica di questi dati.
Finanziamento:
C.R.O. è stato parzialmente supportato da una NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) e 1R21CA245597-01. T.M.W. è stato parzialmente supportato da 1R21CA245597-01 e dal National Center for Advancing Translational Sciences del National Institutes of Health sotto il numero premio UL1TR002240. Il finanziamento per i materiali e la caratterizzazione è stato fornito dal National Cancer Institute of the National Institutes of Health con il numero premio 1R21CA24597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation e la Breast Cancer Research Foundation. Il contenuto è esclusivamente di competenza degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health

1. Preparare la barriera ematica di nicchia
NOTA: Il dispositivo di culto utilizzato in questa piattaforma è un'impalcatura basata su PDMS su cui costruiamo una nicchia di barriera cellulare della barriera ematica. È costituito da due parti separate da una membrana porosa. Per preparare la nicchia barriera ematica della barriera ematica sono necessari due stampi SU-8 realizzati con fotolithografia26,27. Il protocollo sarà descritto pr...

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Abbiamo sviluppato e presentato un nuovo metodo che adatta gli strumenti spesso utilizzati nelle analisi di imaging clinico per la misurazione della stravasazione e la migrazione delle cellule tumorali attraverso una barriera endoteliale nel tessuto cerebrale. Pongono questo approccio può essere utile sia per le misurazioni in vivo che in vitro; abbiamo dimostrato il suo uso su un sistema microfluidico 3D che ricapitola la vascolatura cerebrale. Le misurazioni delle cellule tumorali, tra cui la distanza stravasata, la p...

Le metastasi cerebrali sono le lesioni tumorali più letali; 10-30% di tutti i tumori metastasi al cervello, con una sopravvivenza mediana di soli 5-20 mesi, a seconda del tipo dicancro 1,2. Una domanda principale che si pone quando si studia la metastasi del cancro è come i sub cloni migrano dall'ambiente umoristico del flusso sanguigno in un organocome il cervello 3,4. Questa domanda ha portato a molte variazioni di analisi di migrazione, invasione e stravasazione. Tutti questi metodi condividono la fase critica del conteggio o della misurazione delle proprietà delle cellule che si spostano da una posizione all'altra in risposta a uno stimolo. La maggior parte dei saggi migratori prontamente disponibili sono utilizzati per studiare la migrazione bidimensionale (2D) delle cellule tumorali. Questi hanno chiarito una ricchezza di conoscenza; tuttavia, non ricapitolano la natura tridimensionale del sistema in vivo che altri metodi possono fornire5. Pertanto, è necessario studiare il micro-ambiente tumorale (TME) in sistemi tridimensionali (3D), ma gli approcci di analisi disponibili per le strutture 3D sono limitati e spesso incoerenti.
Uno degli strumenti 3D più popolari è una camera Boyden che consiste in una membrana sospesa nella parte inferiore di un pozzo, che separa due regioni distinte. Boyden ha introdotto il saggio per studiare la chemiocita leucocato4. Le regioni inferiori possono essere variate in base alla chimica o ad altrimezzi 6,7 per indurre le cellule nella regione superiore a migrare nella regione inferiore. L'approccio più comune per quantificare il numero di cellule migrate è quello di rilasciare le cellule dal fondo della membrana utilizzando una soluzione tampone, li lyse, e quindi contarli in base alla quantità di contenuto di DNA nella soluzione7. Questo approccio indiretto è soggetto a errori dell'operatore a causa della variabilità tecnica e la procedura distrugge le informazioni sul fenotipo del cancro e sul micro-ambiente. Variazioni del saggio camera Boyden comportano fissazione delle cellule migratorie che rimangono sulla membrana, ma fornisce solo un conteggio delle cellule che non sono più praticabili per lo studiocontinuo 6,8,9.
A causa dei limiti della camera Boyden e della crescita delle innovazioni nella comunità microfluidica, sono stati sviluppati chip di analisi della migrazione che osservano il movimento delle cellule in risposta a uno stimolo in una direzione piuttosto che intre 10,11,12. Questi saggi di migrazione facilitano il controllo su fattori quali il flusso o la separazione di singolecellule 13,14 che consentono una migliore interpretazione dei risultati; tuttavia, il loro formato 2D perde inevitabilmente alcune informazioni dinamiche. Recenti studi si sono concentrati sulla stravasazione (cioè il movimento delle cellule dalla circolazione in un tessuto, come la barriera ematica) in un ambiente 3D14,15. La distanza di stravasazione nel comportamento di tessuto e sonda che si verifica alla barriera/membrana cellulare è più raffinata rispetto alle misurazioni raccolte utilizzando la camera Boyden o un dispositivo di migrazione microfluidico 2D16. Pertanto, i dispositivi che consentono un'adeguata imaging e analisi della stravasazione 3D sono fondamentali per catturare queste misurazioni sofisticate, ma sono carenti nella letteratura.
Indipendentemente dai saggi di migrazione, sono state sviluppate robuste tecniche di imaging per la risonanza magnetica (RSI) e la tomografia che sono in grado di identificare e ricostruire con precisione il tessuto nello spazio 3D17,18. Queste tecniche acquisiscono immagini in z-stack e parti di segmento dell'immagine in base alle proprietà del tessuto e quindi convertono le immagini segmentate in mesh tridimensionali19,20,21. Questo permette ai medici di visualizzare in 3D singoli organi, ossa e vasi per aiutare nella pianificazione chirurgica o nell'aiuto nella diagnosi di cancro o malattiecardiache 22,23. Qui, mostreremo che questi approcci possono essere adattati per l'uso su campioni microscopici e dispositivi di stravasazione 3D.
A fine questo, abbiamo sviluppato l'innovativa tecnica di tomografia confocale, presentata qui, che offre flessibilità per studiare la stravasazione delle cellule tumorali attraverso una membrana adattando gli strumenti di tomografia esistenti. Questo approccio consente lo studio dell'intera gamma dei comportamenti delle cellule tumorali mentre interagiscono con una barriera cellulare, come uno strato cellulare endoteliale. Le cellule tumorali presentano comportamenti di sondaggio; alcuni possono invadere ma rimanere vicino alla membrana, mentre altri attraversano facilmente la barriera. Questa tecnica è in grado di produrre informazioni sul fenotipo della cellula in tutte le dimensioni24. L'utilizzo di questo approccio per studiare il TME è relativamente economico, facile da interpretare e riproducibile, rispetto ai modelli murine in vivo più complessi. La metodologia presentata dovrebbe fornire una solida base per lo studio di molti tipi di tumori e micro-ambienti adattando la regione stromica.
Descriviamo e dimostriamo l'uso di una piattaforma 3D di nicchia del cervello del sangue microfluidica(Figura 1)in cui gli elementi critici della barriera e della nicchia (cellule endoteliali microvascolari cerebrali e astrociti) possono essere ristrutturati per un periodo prolungato (circa fino a 9 giorni), fluorescentemente immagini dalla microscopia confocale, e le immagini ricostruite utilizzando la nostra tecnica tomografia confocale (Figura 2); tutti miravano a comprendere lo sviluppo di micro-metastasi e i cambiamenti nel micro-ambiente tumorale in modo ripetibile e quantitativo. L'interfaccia della barriera ematica con la nicchia cerebrale è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali che sono rafforzate da membrana seminterrato, piedi astrociti e periciti25. Ci siamo concentrati selettivamente sui componenti astrociti ed endoteliali data la loro importanza nella formazione e nella regolazione della barriera ematica. Dimostriamo come fabbricare, seminare, immagine e analizzare le cellule tumorali e i componenti cellulari e umoristici del micro-ambiente tumorale, utilizzando questa piattaforma. Infine, mostriamo come l'apprendimento automatico possa essere utilizzato per identificare le differenze fenotipici intrinseche delle cellule tumorali che sono in grado di transitare attraverso un modello di mBBN e per assegnare loro un indice oggettivo del potenziale metastatico cerebrale24. I set di dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per rispondere a domande di base e trasslezionali sulla metastasi, sulle strategie terapeutiche e sul ruolo del TME in entrambi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA with phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm biopsy punch with plunger</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>33-31A-P/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS, without Ca and Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200uL pipette tip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 inch silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 mm wide packing tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-072-097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 x 75 mm glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A9-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>box cutter blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1721575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0879005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Heat inactivated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-341-25D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMEC/D3</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCC066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter notebook</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel - growth factor reduced with phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231-BR-GFP</td>
			<td>Dr. Patricia Steeg, NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 growth supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal human astrocytes (NHA)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange software</td>
			<td>University of Ljubljana</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photolithography masks</td>
			<td>Photosciences Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7-dsRed</td>
			<td>University of Michigan Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL-EV-GFP</td>
			<td>University of Michigan Vector Core</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLOX-TERT-iresTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycarbonate membrane, 5um pore size</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TMTP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol, 3 mg/mL</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005</td>
			<td>Type I bovine collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo cup</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1416545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2075</td>
			<td>MicroChem Corporation</td>
			<td>Y111074 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8 developer</td>
			<td>MicroChem Corporation</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Ellsworth Adhesive Company</td>
			<td>NC0162601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179965-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricholoro perfluoro octyl silane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the brain metastatic tumor micro-environment using an organ-on-a chip 3d model, machine learning, and confocal tomography

Le metastasi cerebrali sono le lesioni tumorali più letali; 10-30% di tutti i tumori metastasi al cervello, con una sopravvivenza mediana di soli 5-20 mesi, a seconda del tipo di cancro. Per ridurre il carico del tumore metastatico del cervello, le lacune nella conoscenza di base e traslazione devono essere affrontate. Le sfide principali includono una scarsità di modelli preclinici riproducibili e strumenti associati. I modelli tridimensionali della metastasi cerebrale possono produrre i dati molecolari e fenotipi pertinenti utilizzati per affrontare queste esigenze quando combinati con strumenti di analisi dedicati. Inoltre, rispetto ai modelli murini, i modelli organo su chip delle cellule tumorali del paziente che attraversano la barriera ematica nel microambiente cerebrale generano risultati rapidamente e sono più interpretabili con metodi quantitativi, quindi suscettibili a test ad alta produttività. Qui descriviamo e dimostriamo l'uso di una nuova piattaforma di nicchia microfluidica del cervello del sangue 3D (mBBN) in cui più elementi della nicchia possono essere ricostrutti per un periodo prolungato (diversi giorni), fluorescently immagine da microscopia confocale, e le immagini ricostruite utilizzando un'innovativa tecnica di tomografia confocale; tutti miravano a comprendere lo sviluppo di micro-metastasi e i cambiamenti al micro-ambiente tumorale (TME) in modo ripetibile e quantitativo. Dimostriamo come fabbricare, seminare, immagine e analizzare le cellule tumorali e i componenti cellulari e umoristici TME, utilizzando questa piattaforma. Inoltre, mostriamo come l'intelligenza artificiale (AI) viene utilizzata per identificare le differenze fenotipici intrinseche delle cellule tumorali che sono in grado di transitare attraverso un modello di mBBN e per assegnare loro un indice oggettivo del potenziale metastatico cerebrale. I set di dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per rispondere a domande di base e trasfondiali sulla metastasi, sull'efficacia delle strategie terapeutiche e sul ruolo del TME in entrambi.

Utilizzando questa tecnica, abbiamo analizzato i tipi di cellule etichettati con diverse proteine fluorescenti o coloranti. Dimostriamo l'uso di questo approccio con un chip mBBN formulato con astrociti hCMEC/D3-DsRed e non fluorescenti. Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali sono state seme su una membrana porosa (5 pori incisi) e collocate in un'incubatrice34 a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2. Dopo tre giorni la confluenza dello strato endoteliale è stata confermata t...

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Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

Qui, presentiamo un protocollo per preparare e cultare una barriera ematica del micro-ambiente tumorale metastatico e quindi quantificare il suo stato utilizzando l'imaging confocale e l'intelligenza artificiale (apprendimento automatico).

Quantificare il micro-ambiente del tumore metastatico del cervello utilizzando un modello 3D a chip Organ-On-A, apprendimento automatico e tomografia confocale

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

La tomografia confocale è stata sviluppata per ottenere l'intera gamma di comportamenti delle cellule tumorali, poiché interagiscono con la barriera cellulare e la nicchia. Questo metodo fornisce una base per lo studio delle metastasi man mano che si verificano. Questo approccio è utile per quantificare il comportamento delle cellule vive.La tomografia confocale, se combinata con l'apprendimento automatico, è utile per una varietà di piattaforme organ-on-a-chip. L'analisi del tumore primario o ricorrente o delle cellule tumorali circolanti può costituire un importante strumento diagnostico per prevedere le metastasi cerebrali e discernere il cervello metastatico dalle cellule metastatiche non cerebrali. Per assemblare il dispositivo BBN microfluidico, trasferire un dispositivo dall'essiccatore del vuoto su una superficie appropriata con le insenature rivolte verso il basso e posizionare l'intera configurazione in una camera al plasma.Posizionare l'intera configurazione in una camera al plasma e tirare un vuoto prima di trattare il dispositivo con plasma per 30 secondi a 80 Watt. Al termine del trattamento, utilizzare una guida per posizionare rapidamente il dispositivo, inserire il lato verso l'alto sullo scivolo di vetro sul banco da laboratorio per creare un legame permanente tra i PDM del dispositivo e la diapositiva. Successivamente, inserire 200 punte di pipetta in microliter, tagliare due millimetri dalla punta in tutte le entrate e uscite e posizionare il dispositivo nella camera al plasma per un trattamento al plasma di otto minuti e 200 watt.Dopo che il dispositivo si è raffreddato, posizionare il dispositivo in un contenitore secondario sterile ed entro 15 minuti dal trattamento plasmide, trasferire 120 microlitri di una soluzione di astrocita di collagene nel dispositivo attraverso la punta della pipetta per la camera inferiore. Lasciare che la soluzione si assorba attraverso la camera nella punta della pipetta opposta e riempire il canale successivo del dispositivo. Quando tutti e quattro i canali del dispositivo sono stati riempiti, posizionare il chip nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora.Quando il collagene si è impostato, fatturare tutte le punte della pipetta alimentando la camera inferiore con l'appropriato mezzo di coltura cellulare completo e rivestire la camera superiore con un fattore di crescita ridotto del 2%, in mezzo endoteliale completo. Quando entrambe le camere sono state codificate, posizionare il dispositivo nell'incubatore per un'ora prima di risciacquare la camera superiore con il mezzo appropriato. Alternando le punte, vedere 30 microlitri da una per 10 alla sesta cellule endoteliali per millilitro di mezzo appropriato, attraverso le punte nella camera superiore ogni 15 minuti, per un totale di quattro aliquote di cellule per punta.Incubare il dispositivo tra una semina e l'altro. Quando tutte le cellule endoteliali sono state sementi, riempire tutte le punte con il mezzo e riportare il dispositivo all'incubatore di coltura cellulare per 48 ore. Quando lo strato endoteliale è maturato, sostituire il mezzo nel chip per reintegrare il mezzo di coltura cellulare e seminare ogni canale della camera superiore con 30 microlitri di uno per 10 alle sei cellule tumorali per millilitro di mezzo appropriato.Dopo che ogni aliquota di 30 microliter di cellule è stata seminata, riportare il dispositivo nell'incubatrice per 15 minuti, quindi riempire tutte le punte con il mezzo appropriato restituire il dispositivo all'incubatore di coltura cellulare per 24-48 ore. Dopo che il dispositivo è stato coltivato e immaginato, per misurare il fenotipo delle cellule tumorali, aprire il software fornito e leggere l'immagine confocale in memoria. Il software salverà ogni canale di colore dall'immagine confocale 3D in un file TIFF separato.Selezionare Modifica valori di opacità per ogni canale del microscopio'e regolare il valore alfa del canale per i canali di colore presenti nell'immagine, in modo che lo sfondo venga rimosso e rimangano solo le fluorescenti all'interno delle celle. Per visualizzare l'effetto, selezionate Visualizza rendering 3D per verificare che la soglia sia impostata correttamente e, se l'immagine appare corretta, salvate i valori di opacità nel foglio di calcolo del tracker degli esperimenti. Quindi, usate i cubi di marcia per convertire l'immagine del volume in singoli oggetti mesh triangolari 3D salvati nel formato dati VTK.Per adattare un piano alla barriera endoteliale, individuare prima i baricentri cellulari. Utilizzare il filtro di connettività polydata per scorrere l'elenco delle mesh nel file VTK per estrarre le aree non connesse. Calcola il baricentro di ogni mesh e aggiungi la misurazione a un elenco di baricentri che filtrano per mesh troppo grandi o troppo piccole.Per adattare un piano all'elenco dei baricentri per le celle endoteliali, utilizzare un metodo di minimizzazione dell'errore, eseguire i baricentri RFP di visualizzazione e l'adattamento del piano per generare e tracciare l'adattamento del piano e ispezionare l'adattamento del piano, regolando manualmente l'adattamento in base alle esigenze. Quando il piano è stato montato correttamente, salvare la normale del piano nel file di localizzazione dell'esperimento. Per misurare ogni fenotipo delle cellule tumorali dopo aver caratterizzato lo strato endoteliale con un piano, caricare la funzione di analisi cellulare ed eseguire Leggi nelle informazioni del tracker dell'esperimento e analizzare i canali esistenti"per scorrere e analizzare ogni regione nel file VTK.Per ogni regione, la funzione ritaglierà ogni cella in modo che la mesh sotto la membrana sia calcolata. Per misurare il fenotipo cellulare, calcolare la forma, il volume e la posizione di ogni cellula tumorale. Quindi misurare il volume e la posizione di ogni cellula tumorale ritagliata per calcolare la percentuale di cellule che si sono estravase attraverso la barriera endoteliale.Dopo aver eseguito questa procedura per diversi esperimenti, eseguire Esporta i dati come un singolo file xlsx'per salvare i dati in un foglio di calcolo. Un chip BBN microfluidico con una barriera endoteliale confluente è accettabile per la sperimentazione, mentre un chip BBN microfluidico con una copertura endoteliale particolarmente scarsa, non lo è. In questa analisi rappresentativa il cervello in cerca di linea cellulare tumorale, mostra una sottopopolazione di cellule che estravasa attraverso la barriera endoteliale e migra in profondità nello spazio di nicchia cerebrale del chip BBN microfluidico A due e nove giorni dall'esposizione, le cellule tumorali parentali hanno mantenuto una proporzione sostanziale di cellule in cima alla barriera lontano dallo spazio di nicchia cerebrale , mentre la popolazione di cellule tumorali metastatiche cerebrali ha mantenuto una percentuale di cellule superiori al 100% extravasate.La quantificazione morfologica della forma delle cellule tumorali ha indicato che le cellule parentali hanno dimostrato meno cellule di forma sferica il primo giorno dopo la semina, mentre dopo due e nove giorni di interazione entrambe le linee cellulari tumorali tendevano a diminuire la loro sfericità. Inoltre, le sottopopolazioni delle cellule tumorali che si sono estravase nella nicchia astricia erano di dimensioni più piccole, rispetto alle cellule tumorali che sono rimaste in interazione con la barriera endoteliale senza estravasare nel cervello. Il cervello alla ricerca di linee cellulari tumorali e xenoinnesti derivati dal paziente, mostra un modello fenotipico nel chip BBN microfluidico che potrebbe essere sfruttato per distinguere tra le cellule tumorali metastatiche cerebrali e non cerebrali mediante machine learning.L'autoselezione è importante. Le cellule endoteliali con un numero di passaggio più alto e basso mostravano comportamenti di barriera variabile. Inoltre, le cellule tumorali e la loro espressione fluorescente possono cambiare nel tempo.Dopo questa procedura, i ricercatori possono impiegare il profilo molecolare della casa o delle cellule del segreto nel dispositivo al fine di studiare i meccanismi molecolari delle metastasi. Questa tecnica consente l'esplorazione di interazioni complesse tra le cellule tumorali e i loro microambientati, combinando un microambiente ingegnerizzato con un imaging quantitativo di componenti di nicchia nel tempo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avanzato modello animale di colorettale Metastasi nel fegato: tecniche di imaging e di proprietà di metastatici cloni

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Immunoprecipitazione della cromatina nativo utilizzando neurosfere tumore del cervello murino

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

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Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

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L'applicazione clinica del tumore trattamento della terapia di campi nel Glioblastoma

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Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morfologiche e fisiologiche monitoraggio di sferoidi tridimensionale del tumore usando la tomografia a coerenza ottica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...