Name: a two-step strategy that combines epigenetic modification and biomechanical cues to generate mammalian pluripotent cells
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كاراريسي و MiND FoodS Hub ID: 1176436. جميع المؤلفين هم أعضاء في COST Action CA16119 في المختبر 3-D إجمالي توجيه الخلايا واللياقة البدنية (CellFit).

تمت مراجعة جميع الدراسات والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة ميلانو. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، الذي نشرته المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH). تمت الموافقة على عزل الخلايا البشرية عن الأفراد البالغين الأصحاء من قبل اللجنة الأخلاق?...

<ol>
	<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine.">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li><li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation.">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li><li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells.">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li><li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation.">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333 (2015).</li><li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li><li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells.">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li><li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts.">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017 (2016).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate.">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts.">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li><li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment.">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine,+DNA+methylation,+and+differentiation.">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li><li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-azacytidine+and+its+2'-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation.">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li><li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2'-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B.">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li><li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration.">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).</li><li>Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+influences+of+mechanical+forces+on+cell+competition.">Multiple influences of mechanical forces on cell competition.</a> Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).</li><li>Yim, E. K., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+cell+signaling+in+stem+cell+differentiation.">Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 3 (5), 41 (2012).</li><li>Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+extracellular+forces+that+determine+cell+fate+and+maintenance.">Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance.</a> Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).</li><li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture:+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function.">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).</li><li>Streuli, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+mediates+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelia.">Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia.</a> The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).</li><li>Christman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine+and+5-aza-2[prime]-deoxycytidine+as+inhibitors+of+DNA+methylation:+mechanistic+studies+and+their+implications+for+cancer+therapy.">5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy.</a> Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).</li><li>Stresemann, C., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+of+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+azacytidine+and+decitabine.">Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine.</a> International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).</li><li>Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+in+vitro+maturation+of+sheep+oocytes+in+a+liquid+marble+microbioreactor.">A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).</li><li>Vadivelu, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+multiple+spheroid+model+of+olfactory+ensheathing+cells+using+floating+liquid+marbles.">Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles.</a> Scientific Reports. 5, 15083 (2015).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues.">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions.">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).</li><li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal.">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li><li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+signaling-directed+YAP/TAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells.">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li></ol>

خلال العقود الماضية ، ركزت العديد من الدراسات على تطوير استراتيجيات لإعادة خلية متمايزة بشكل نهائي نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتوليد الخلايا متعددة القدرات وصيانتها على المدى الطويل بدءا من الخلايا البالغة الناضجة المتمايزة نهائيا. تجمع هذه الطريقة ب...

خلال العقود الماضية ، تم تنقيح المفهوم المقبول على نطاق واسع للتقدم أحادي الاتجاه نحو التزام الخلايا والتمايز بالكامل. وقد ثبت أنه يمكن عكس مواصفات الخلية ، ويمكن دفع خلية متمايزة نهائيا نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا ، باستخدام طرق مختلفة.
من بين الطرق العديدة المقترحة ، تتضمن إحدى الطرق الواعدة استخدام المركبات الكيميائية لحث الخلايا على ما يسمى بتعدد القدرات المستحث كيميائيا. الجزيئات الصغيرة المستخدمة في هذا النهج قادرة على التفاعل وتعديل التوقيع اللاجيني لخلية ناضجة بالغة ، وتجنب الحاجة إلى أي ناقل معدل وراثيا و / أو فيروسي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . أظهرت العديد من الدراسات مؤخرا أنه من الممكن تحويل الخلايا من نمط ظاهري إلى آخر من خلال توفير محفزات كيميائية حيوية وبيولوجية محددة تحفز على إعادة تنشيط الجينات مفرطة الميثيل 11،12،13،14،15. تسمح أحداث إزالة الميثيل هذه بتحويل الخلايا المتمايزة نهائيا إلى سلف بدائي أو خلية متعددة القدرات أو عالية اللدونة / متعددة القدرات 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
في موازاة ذلك ، ركزت العديد من الدراسات مؤخرا على فهم الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، وبشكل أكثر تحديدا ، على إمكانية استخدام القوى الميكانيكية للتأثير بشكل مباشر على مرونة الخلايا و / أو التمايز16،17،18،19. في الواقع ، لقد ثبت بوضوح أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) تلعب دورا رئيسيا في التحكم في مصير الخلية. على وجه الخصوص ، فإن الإشارات الميكانيكية الحيوية والفيزيائية الحيوية التي تنتجها ECM تنظم مباشرة الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات ، مما يؤثر على سلوك الخلية ووظائفها20,21. وقد مهدت هذه البيانات الحديثة الطريق لتطوير أنظمة جديدة للثقافة ثلاثية الأبعاد تحاكي بشكل أوثق البيئة الدقيقة للخلايا في الجسم الحي ، وتكرر المحفزات الميكانيكية والفيزيائية التي تقود سلوك الخلية.
نحن هنا نصف بروتوكولا من خطوتين يجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. في الخطوة الأولى ، يتم احتضان الخلايا بجزيء إزالة الميثيل 5-aza-cytidine (5-aza-CR). هذا العامل قادر على الحث على إزالة ميثيل الحمض النووي العالمية الهامة من خلال التأثير المشترك للنقل المباشر من عشرة إلى أحد عشر (TET2) بوساطةالإجراء 8,10 والتثبيط غير المباشر لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMT)22,23. تحفز هذه الخطوة على إزالة الكتل اللاجينية مع إعادة تنشيط لاحقة للتعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات ، وبالتالي توليد خلايا عالية اللدونة1،2،3،8،10 ، يشار إليها فيما يلي باسم "الخلايا التي تم محوها فوق وراثيا". في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا في نظام ثقافة 3D. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم استخدام المركب الاصطناعي غير التفاعلي الكارهة للماء polytetrafluoroethylene (PTFE ؛ مع حجم الجسيمات 1 ميكرومتر) كمفاعل حيوي دقيق ، والذي يسمح بإنشاء بيئة دقيقة خلوية لا يمكن تحقيقها من خلال استخدام أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد التقليدية10. تلتصق جزيئات مسحوق PTFE بسطح قطرة السائل التي يتم فيها إعادة تعليق الخلايا وتعزل قلب السائل عن السطح الداعم ، مع السماح بتبادل الغاز بين السائل الداخلي والبيئة المحيطة24. يشجع "المفاعل الحيوي الدقيق PTFE" الذي تم الحصول عليه ، والمعروف أيضا باسم "الرخام السائل" ، الخلايا على التفاعل بحرية مع بعضها البعض ، مما يعزز إعادة ترتيب الخلايا ثلاثية الأبعاد25،26،27 ، ويمتد ويحافظ بثبات على حالة اللدونة العالية المكتسبة من خلال الإشارات المتعلقة بالميكانيكا الحيوية10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Azacytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2385</td>
			<td>5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4036</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4654</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966052</td>
			<td>For fibroblast isolation and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31885023</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61021</td>
			<td>mRNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td>For dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 2700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Global DNA Methylation ELISA Kit</td>
			<td>CELL BIOLABS</td>
			<td>STA-380</td>
			<td>Methylation study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7801</td>
			<td>Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6264</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31550031</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVA glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor Biomedical</td>
			<td>87144</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ APO Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>For organoid observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS 0.22 &#181;m pore filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>For solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3681</td>
			<td>mRNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51119000</td>
			<td>For ELISA plate reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>For cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Thermal Cycler 480</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(tetrafluoroethylene) 1 &#956;m particle size</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>430935</td>
			<td>For generating micro-bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>Genomic DNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1728</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833902</td>
			<td>For fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td>For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900500</td>
			<td>Bacteriology petri dish for liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924005</td>
			<td>For liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>For fibroblast dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PS</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62553041</td>
			<td>For cell suspension centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a two-step strategy that combines epigenetic modification and biomechanical cues to generate mammalian pluripotent cells

يمكن عكس النمط الظاهري للخلية أو تعديله بطرق مختلفة ، مع مزايا وقيود خاصة بكل تقنية. هنا نصف استراتيجية جديدة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. هناك خطوتان رئيسيتان مطلوبتان. في الخطوة الأولى ، تتعرض الخلايا البالغة الناضجة (المتمايزة نهائيا) للممحاة اللاجينية 5-aza-cytidine لدفعها إلى حالة متعددة القدرات. تم تطوير هذا الجزء من البروتوكول ، استنادا إلى الفهم المتزايد للآليات اللاجينية التي تتحكم في مصير الخلية والتمايز ، ويتضمن استخدام المعدل اللاجيني لمحو الحالة المتمايزة للخلية ثم القيادة إلى نافذة عابرة عالية اللدونة.
في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا المحذوفة في مفاعلات حيوية دقيقة متعددة التترافلورو إيثيلين (PTFE) ، والمعروفة أيضا باسم الرخام السائل ، لتعزيز إعادة ترتيب الخلايا 3D لتوسيع والحفاظ على اللدونة العالية المكتسبة والحفاظ عليها بشكل ثابت. PTFE هو مركب اصطناعي غير تفاعلي مسعور ويسمح استخدامه بإنشاء بيئة دقيقة خلوية ، والتي لا يمكن تحقيقها في أنظمة الثقافة التقليدية 2D. يشجع هذا النظام ويعزز الحفاظ على تعدد القدرات من خلال الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي الحيوي.
الإجراءات التقنية الموضحة هنا هي استراتيجيات بسيطة للسماح بتحريض وصيانة حالة عالية اللدونة في الخلايا الجسدية البالغة. سمح البروتوكول باشتقاق خلايا عالية اللدونة في جميع أنواع الثدييات التي تم اختبارها. وبما أنه لا ينطوي على استخدام نقل الجينات وخال من النواقل الفيروسية، فقد يمثل تقدما تكنولوجيا ملحوظا لتطبيقات الطب الانتقالي. علاوة على ذلك ، يوفر نظام المفاعل الحيوي الدقيق تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية للخلايا الجذعية من خلال إعادة إنشاء بيئة دقيقة محددة في المختبر تسمح بزراعة طويلة الأجل للخلايا عالية اللدونة ، أي مثل ESCs و iPSCs والخلايا التي تم محوها فوق جيني و MSCs.

يصف هذا البروتوكول جميع الخطوات التي يتعين القيام بها لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات والحفاظ عليها بشكل مستقر من الخلايا الجسدية البالغة. وقد نجحت هذه الطريقة مع الخلايا الليفية المعزولة من أنواع الثدييات المختلفة ، وهي الفأر والخنزير والإنسان. يتم الحصول على النتائج التمثيلية ال...

Watch this Scientific Journal Video about A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells at JoVE.com

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

نقدم هنا طريقة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات بكفاءة ، دون الحاجة إلى نقل الجينات أو ناقلات الفيروسات القهقرية. وبالتالي ، فإن هذه الاستراتيجية واعدة للطب الانتقالي وتمثل تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية الجذعية.

استراتيجية من خطوتين تجمع بين التعديل اللاجيني والإشارات الميكانيكية الحيوية لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

عكس الخميرة نظام هجين اثنين من التعرف على الثدييات مستقبلات النووية التي تتفاعل مع بقايا تقوم الليجندات و / أو الخصوم

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

أتمتة التجارب رقاقة وما يليها لتوليد الملامح جينية على خلايا هيلا 10،000

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...