Name: a two-step strategy that combines epigenetic modification and biomechanical cues to generate mammalian pluripotent cells
Uploaded: 2020-08-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells at JoVE.com

이 작품은 Carraresi Foundation과 MiND FoodS Hub ID : 1176436가 자금을 지원했습니다. 모든 저자는 COST Action CA16119 시험관내 3-D 총 세포 안내 및 적합성 (CellFit)의 회원입니다.

모든 연구는 밀라노 대학의 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 모든 동물 실험은 미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 출판 된 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드에 따라 수행되었습니다. 건강한 성인 개인으로부터의 인간 세포 분리는 밀라노의 Ospedale Maggiore Policlinico의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 우리 연구의 모든 방법은 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다.
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	<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pig+dermal+fibroblast+into+insulin+secreting+cells+by+a+brief+exposure+to+5-aza-cytidine.">Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).</li><li>Brevini, T. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+molecular+changes+of+human+granulosa+cells+exposed+to+5-azacytidine+and+addressed+toward+muscular+differentiation.">Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).</li><li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells.">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).</li><li>Tan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+tissue+engineering+and+regeneration+through+epigenetic+reprogramming+and+scaffold+manipulation.">Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation.</a> Scientific Reports. 5, 16333 (2015).</li><li>Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+conversion+of+adult+dog+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).</li><li>Chandrakanthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-AB+and+5-Azacytidine+induce+conversion+of+somatic+cells+into+tissue-regenerative+multipotent+stem+cells.">PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).</li><li>Manzoni, E. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-azacytidine+affects+TET2+and+histone+transcription+and+reshapes+morphology+of+human+skin+fibroblasts.">5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts.</a> Scientific Reports. 6, 37017 (2016).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+erasing+and+pancreatic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+into+insulin-producing+cells+are+boosted+by+the+use+of+low-stiffness+substrate.">Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate.</a> Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+PTFE+micro-bioreactor+to+promote+3D+cell+rearrangement+and+maintain+high+plasticity+in+epigenetically+erased+fibroblasts.">Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).</li><li>Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+striated+muscle+cells+from+non-myoblast+precursors+following+5-azacytidine+treatment.">Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment.</a> Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine,+DNA+methylation,+and+differentiation.">5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).</li><li>Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-azacytidine+and+its+2'-deoxyderivative+on+cell+differentiation+and+DNA+methylation.">Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).</li><li>Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+inhibitor+5-Aza-2'-deoxycytidine+induces+reversible+genome-wide+DNA+damage+that+is+distinctly+influenced+by+DNA+methyltransferases+1+and+3B.">DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).</li><li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+direct+stem+cell+behaviour+in+development+and+regeneration.">Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728 (2017).</li><li>Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+influences+of+mechanical+forces+on+cell+competition.">Multiple influences of mechanical forces on cell competition.</a> Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).</li><li>Yim, E. K., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+cell+signaling+in+stem+cell+differentiation.">Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 3 (5), 41 (2012).</li><li>Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+extracellular+forces+that+determine+cell+fate+and+maintenance.">Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance.</a> Development. 144 (23), 4261-4270 (2017).</li><li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+architecture:+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function.">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).</li><li>Streuli, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+mediates+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelia.">Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia.</a> The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).</li><li>Christman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Azacytidine+and+5-aza-2[prime]-deoxycytidine+as+inhibitors+of+DNA+methylation:+mechanistic+studies+and+their+implications+for+cancer+therapy.">5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy.</a> Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).</li><li>Stresemann, C., Lyko, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+of+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+azacytidine+and+decitabine.">Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine.</a> International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).</li><li>Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+in+vitro+maturation+of+sheep+oocytes+in+a+liquid+marble+microbioreactor.">A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).</li><li>Vadivelu, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+three-dimensional+multiple+spheroid+model+of+olfactory+ensheathing+cells+using+floating+liquid+marbles.">Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles.</a> Scientific Reports. 5, 15083 (2015).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marble+as+bioreactor+for+engineering+three-dimensional+toroid+tissues.">Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12388 (2017).</li><li>Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Marbles+as+bioreactors+for+the+study+of+three-dimensional+cell+interactions.">Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions.</a> Biomedical Microdevices. 19 (2), 31 (2017).</li><li>Varelas, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAZ+controls+Smad+nucleocytoplasmic+shuttling+and+regulates+human+embryonic+stem-cell+self-renewal.">TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).</li><li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+signaling-directed+YAP/TAZ+regulation+encourages+3D+spheroid+colony+formation+and+boosts+plasticity+of+parthenogenetic+stem+cells.">Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).</li></ol>

지난 수십 년 동안 여러 연구는 말기 분화 된 세포를 덜 헌신적이고 더 높은 허용 상태로 되돌리기위한 전략 개발에 중점을 두었습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 성숙한 성숙 말단 분화된 세포로부터 출발하는 다능성 세포의 생성 및 장기 유지를 허용한다. 이 방법은 화학적 후성 유전 적 소거를 통해 달성되는 높은 허용 상태의 유도와 3D 배양 시스템을 사용하여 보장 된 후속 유지 보수를 포함?...

지난 수십 년 동안, 세포 투입 및 분화를 향한 단방향 진행에 대한 널리 받아 들여지는 개념이 완전히 개정되었습니다. 세포 사양을 되돌릴 수 있고, 말단으로 분화된 세포는 다른 방법을 사용하여 덜 헌신적이고 더 높은 허용 상태로 밀릴 수 있다는 것이 입증되었다.
제안 된 몇 가지 방법 중 가장 유망한 방법 중 하나는 세포를 소위 화학적으로 유도 된 다능성으로 유도하기 위해 화학 화합물을 사용하는 것입니다. 이 접근법에 사용 된 소분자는 성인 성숙 세포의 후성 유전 학적 서명과 상호 작용하고 수정할 수있어 트랜스제닉 및 / 또는 바이러스 벡터1,2,3,4,5,6,7,8,9,10의 필요성을 피할 수 있습니다. . 최근 수많은 연구에 따르면 하이퍼메틸화 유전자 11,12,13,14,15의 재활성화를 유도하는 특정 생화학적 및 생물학적 자극을 제공함으로써 세포를 한 표현형에서 다른 표현형으로 전환시킬 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 탈메틸화 사건은 말단으로 분화된 세포를 원시적 선조, 다능성 또는 높은 가소성/다능성 세포 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10으로 전환시키는 것을 허용한다.
동시에, 많은 연구들이 최근 메카노센싱 관련 단서에 대한 이해, 더 구체적으로는 기계적 힘을 사용하여 세포 가소성 및/또는 분화에 직접적으로 영향을 미칠 가능성에 초점을 맞추고 있다16,17,18,19. 실제로, 세포외 기질 (ECM)이 세포 운명의 조절에 중요한 역할을한다는 것이 명확하게 입증되었습니다. 특히, ECM에 의해 생성된 생체역학적 및 생물물리학적 신호는 분자 메커니즘 및 신호전달 경로를 직접 조절하여 세포 거동 및 기능(20,21)에 영향을 미친다. 이러한 최근의 데이터는 생체 내 세포 미세 환경을보다 밀접하게 모방하고 세포 행동을 유도하는 기계적 및 물리적 자극을 복제하는 새로운 3D 배양 시스템의 개발로 향하는 길을 열었습니다.
여기서는 화학적 후성유전학적 지우기와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 단계에서, 세포는 탈메틸화 분자 5-아자-시티딘 (5-aza-CR)과 함께 인큐베이션된다. 이 작용제는 직접 10-열한 전좌 2 (TET2)-매개 작용8,10 및 DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT)22,23의 간접적 억제의 조합 효과를 통해 상당한 글로벌 DNA 탈메틸화를 유도할 수 있다. 이 단계는 다능성 관련 유전자 발현의 후속 재활성화와 함께 후성유전학적 블록의 제거를 유도하고, 따라서, 높은 가소성 세포 1,2,3,8,10, 이하 "후성유전학적으로 소거된 세포"로 지칭된다. 두 번째 단계에서, 세포는 3D 배양 시스템에 캡슐화된다. 이를 위해, 비반응성 소수성 합성 화합물 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; 입자 크기가 1 μm)을 마이크로생물반응기로 사용하며, 이는 전통적인 2D 배양 시스템(10)의 사용을 통해 달성할 수 없는 세포 미세환경의 생성을 허용한다. PTFE 분말 입자는 세포가 다시 현탁되는 액체 방울의 표면에 부착되고, 내부 액체와 주변 환경(24) 사이의 가스 교환을 허용하면서 지지 표면으로부터 액체 코어를 분리한다. 이렇게 얻어진 "PTFE 마이크로바이오리액터"는, "리퀴드 마블"로도 알려져 있으며, 세포들이 서로 자유롭게 상호작용하도록 장려하여, 3D 세포 재배열(25,26,27)을 촉진하고, 바이오메카노센싱-관련 단서들(10)에도 불구하고 획득된 높은 가소성 상태를 연장하고 안정적으로 유지한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Azacytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2385</td>
			<td>5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4036</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4654</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>41966052</td>
			<td>For fibroblast isolation and culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31885023</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5652</td>
			<td>PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61021</td>
			<td>mRNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td>For dish coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 2700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Global DNA Methylation ELISA Kit</td>
			<td>CELL BIOLABS</td>
			<td>STA-380</td>
			<td>Methylation study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7801</td>
			<td>Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6264</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31550031</td>
			<td>For ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOVA glasstic slide 10 with grids</td>
			<td>Hycor Biomedical</td>
			<td>87144</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ APO Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td>For organoid observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>Component of fibroblast and ESC media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Component of ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS 0.22 &#181;m pore filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>For solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M3681</td>
			<td>mRNA reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51119000</td>
			<td>For ELISA plate reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>For cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Thermal Cycler 480</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Thermal cycler for reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(tetrafluoroethylene) 1 &#956;m particle size</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>430935</td>
			<td>For generating micro-bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K182001</td>
			<td>Genomic DNA estraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1728</td>
			<td>Quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1895</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833902</td>
			<td>For fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900</td>
			<td>For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833900500</td>
			<td>Bacteriology petri dish for liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833924005</td>
			<td>For liquid marble culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td>For fibroblast dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15ml, 120x17mm, PS</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62553041</td>
			<td>For cell suspension centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td>Component of nucleoside mix for ESC medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a two-step strategy that combines epigenetic modification and biomechanical cues to generate mammalian pluripotent cells

세포 표현형은 다른 방법으로 역전되거나 변형될 수 있으며, 각 기술에 특정한 장점과 한계가 있다. 여기서 우리는 화학적 후성 유전 적 지우기와 메카노 센싱 관련 단서의 사용을 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 새로운 전략을 설명합니다. 두 가지 주요 단계가 필요합니다. 첫 번째 단계에서, 성숙한(말단 분화된) 세포는 후성유전학적 지우개 5-아자-시티딘에 노출되어 다능성 상태로 그들을 구동시킨다. 프로토콜의 이 부분은 세포 운명 및 분화를 조절하는 후성유전학적 메커니즘에 대한 이해의 증가에 기초하여 개발되었으며, 후성유전학적 개질제를 사용하여 세포 분화 상태를 지운 다음 일시적인 높은 가소성 창으로 구동하는 것을 포함한다.
두 번째 단계에서, 지워진 세포는 액체 대리석으로도 알려진 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 마이크로 생물반응기에 캡슐화되어 획득한 높은 소성을 연장하고 안정적으로 유지하기 위해 3D 세포 재배열을 촉진합니다. PTFE는 비 반응성 소수성 합성 화합물이며 그 사용은 전통적인 2D 배양 시스템에서 달성 될 수없는 세포 미세 환경의 생성을 허용합니다. 이 시스템은 바이오 메카노센싱 관련 단서에도 불구하고 다능성의 유지를 장려하고 강화합니다.
여기에 설명 된 기술 절차는 성인 체세포에서 높은 가소성 상태의 유도 및 유지를 허용하는 간단한 전략입니다. 이 프로토콜은 시험된 모든 포유동물 종에서 높은 가소성 세포의 유도를 허용하였다. 유전자 형질감염의 사용을 수반하지 않으며 바이러스 벡터가 없기 때문에, 번역 의학 응용을 위한 주목할 만한 기술적 진보를 나타낼 수 있다. 더욱이, 마이크로바이오리액터 시스템은 높은 가소성 세포, 즉 ESC, iPSCs, 후성유전학적으로 소거된 세포 및 MSCs의 장기 배양을 허용하는 특정 마이크로환경을 시험관내 재생성함으로써 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 제공한다.

본 프로토콜은 성체 체세포로부터 포유동물 다능성 세포를 생성하고 안정적으로 유지하기 위해 수행되는 모든 단계를 기술한다. 이 방법은 상이한 포유동물 종, 즉 마우스, 돼지 및 인간으로부터 분리된 섬유아세포로 성공적이었다. 여기에 보고된 대표적인 결과는 기원의 종에 관계없이 모든 세포주로부터 얻어진다.
형태학적 분석은, 탈메틸화제 5-aza-CR과 함께 18시간 인큐베...

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A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

포유 동물 세포를 Trypsinizing 및 Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

연구

생물학

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...