Name: ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل شعبة البحوث داخل الأمعاء، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم، والمعاهد الوطنية للصحة. وقد تم دعم S.H. من قبل اليابان الشراكة بين القطاعين العام والخاص طالب دراسة في الخارج، وH.N. وK.Y. كانت من قبل منحة التدريب ما وراء البحار والمخدرات V.

1. SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء PVDF
<ol><li>قم بإجراء SDS-PAGE لفصل البروتينات بناءً على الحجم النسبي. ملاحظة: أي نظام هلام التجاري أو منزلي الصنع على ما يرام. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.</li>
	<li>نقل البروتينات المنفصلة من هلام على غشاء PVDF. ملاحظة: طرق النقل الشائعة (شبه الجافة أو نقل الرطب) هي من?...

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting.">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li><li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing.">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li><li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes.">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+but+not+Obsolete:+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot.">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays.">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li><li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses.">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852 (2016).</li><li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

لطخة الغربية هي تقنية تحليلية تستخدم على نطاق واسع للكشف عن بروتينات محددة التي تم تطويرها ~ قبل 40 عاما7،8. ومنذ ذلك الحين، استمرت هذه التقنية في التطور، مع الابتكارات اللاحقة تحسين حساسية وسرعة، وكمية من تقنية2،9،<sup class=...

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي تقنية قوية وأساسية عبر مجموعة واسعة من التخصصات العلمية والسريرية. وتستخدم هذه التقنية لدراسة وجود, وفرة النسبية, كتلة جزيئية نسبية, والتعديلات بعد تحويل البروتينات1. جنبا إلى جنب مع تحليل الصور الرقمية، يمكن لهذه الطريقة تحليل موثوق وفرة من البروتينات والتعديلات البروتين2. على الرغم من أن يتم تنفيذ لطخة الغربية بشكل روتيني، بل هو وسيلة تستغرق وقتا طويلا والعمل المكثف. يتطلب حضانة طويلة من الأجسام المضادة مع الأغشية. هنا، نحن وصف تعديل طريقة الحضانة التي تتغلب على هذا القيد دون التضحية الحساسية.
أثناء حضانة الغشاء ، تطفو الأجسام المضادة في محلول بينما يتم تثبيت المستضدات على الغشاء. بسبب تقاربها عالية، ومعدل للجسم المضاد ملزمة المستضد هو أسرع من انتشار الأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى الغشاء. وهذا يخلق تركيز منخفض "طبقة استنزاف"(الشكل 1). قد يستغرق ساعات للأجسام المضادة أكثر بعدا للوصول إلى الغشاء عن طريق الانتشار السلبي، الذي هو العامل الرئيسي المسؤول عن أوقات الحضانة الطويلة في هذه التقنية. هذا التأثير يسمى قيود النقل الجماعي (MTL)3. وقد اقترح أن استنزاف المتكررة وتجديد حل الأجسام المضادة التي تحتوي على قد تعطل طبقة الاستنفاد والتغلب على MTL4. هنا ، قمنا بتصميم تقنية فريدة من نوعها تنفذ هذا المفهوم استنزاف وتجديد دوري (CDR) لتقليل تأثير MTL في بروتوكول النشاف الغربي التقليدي وتقصير فترة الحضانة المطلوبة بشكل ملاحظ.
من أجل الحفاظ على حساسية الكشف مع فترة حضانة قصيرة ، قمنا باستخدام تقنية تعزيز رد المناعة التي تسرع تفاعل مستضد الأجسام ، وبالتالي تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء5. العديد من العوامل المتاحة تجاريا تعزيز رد الفعل المناعي (IRE) تتكون من 2 مكونات (الحل 1 و 2، انظر جدول المواد). لم يتم الكشف عن تكوين الملكية أو آلية عمل IRE ، ولكننا وجدنا سابقا أن IRE انخفض ثابت الانفصام بين المستضد والأجسام المضادة في مرحلة صلبة ملزمة المستويات ، مما يدل على زيادة تقارب ، على الأقل جزئيا ، مسؤولة عن تعزيز تأثير IRE6. مزيج من CDR مع IRE ينتج بروتوكول النشاف الغربية فائقة السرعة التي تقلل من الوقت الإجراء بأكمله دون التضحية الحساسية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure Imaging System 600</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure 600</td>
			<td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>NKB-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9310V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9340V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYBAID Micro-4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>seracare</td>
			<td>5430-0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#223; actin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>927-40100</td>
			<td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OXO Salad Spinner</td>
			<td>OXO</td>
			<td>32480V2B</td>
			<td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Sealing Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M PM996</td>
			<td>semi-transparent flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared in a machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي طريقة متعارف عليها لأبحاث الطب الحيوي. ويستخدم عادة لتحديد الحجم النسبي ووفرة بروتينات محددة، فضلا عن تعديلات البروتين بعد الترجمة. هذه التقنية لها تاريخ غني وتبقى في الاستخدام على نطاق واسع بسبب بساطتها. ومع ذلك ، فإن إجراء النشاف الغربي يستغرق ساعات ، حتى أيام ، لإكمال ، مع اختناق حرج هو أوقات الحضانة الطويلة التي تحد من الإنتاجية. هذه الخطوات الحضانة مطلوبة بسبب الانتشار البطيء للأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى المستضدات المُشلّة على الغشاء: تركيز الأجسام المضادة بالقرب من الغشاء أقل بكثير من التركيز الأكبر. هنا، نقدم ابتكاراً يقلل بشكل كبير من فترات الحضانة هذه من خلال تحسين الربط المستضدي عن طريق استنزاف دوري وتجديد (CDR) من محلول الأجسام المضادة. كما استخدمنا تقنية تعزيز رد الفعل المناعي للحفاظ على حساسية الفحص. عزز مزيج من طريقة CDR مع عامل تحسين المناعة التجارية إشارة الإخراج وخفض بشكل كبير وقت حضانة الأجسام المضادة. يمكن إنجاز البقعة الغربية فائقة السرعة الناتجة في 20 دقيقة دون أي خسارة في الحساسية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على البقع الغربية باستخدام كل من chemiluminescent والكشف الفلورسنت. يسمح هذا البروتوكول البسيط للباحثين باستكشاف تحليل تعبير البروتين بشكل أفضل في العديد من العينات.

يوضح هذا المثال فعالية طريقة CDR مع تقنية المناعة على البقع الغربية. تم إجراء حضانة ثابتة على فيلم مرن شبه شفاف حيث تم احتضان أغشية PVDF مع محلول الأجسام المضادة ، في حين أن حضانة CDR كانت في فرن التهجين عن طريق تدوير الأنابيب التي تحتوي على الأغشية وحل الأجسام المضادة (Movie). ويبين الش?...

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

يتم تطوير تقنية النشاف الغربية فائقة السرعة من خلال تحسين حركية الأجسام المضادة المضادة المضادة الملزمة من خلال تقنية تجفيف الدوريات وتجديدها (CDR) بالاقتران مع عامل تعزيز رد المناعة.

فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

استكشاف التفاعل الجزيئي الحيوي بين Molecular Chaperone Hsp90 وبروتين العميل Kinase Cdc37 باستخدام تقنية الاستشعار الحيوي ذات التأثير الميداني

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

دراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2 باستخدام النشاف الغربي

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...