Name: ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla Divisione di Ricerca Intramurale, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. S.H. è stato supportato dal Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, e H.N. e K.Y. erano di Valor e V Drug Overseas Training Scholarship.

1. SDS-PAGE e trasferimento a una membrana PVDF
<ol><li>Eseguire SDS-PAGE per separare le proteine in base alle dimensioni relative. NOTA: Qualsiasi sistema di gel commerciale o fatto in casa va bene. Si prega di seguire il protocollo del produttore.</li>
	<li>Trasferire proteine separate da un gel su una membrana PVDF. NOTA: Sono adatti metodi di trasferimento comuni (trasferimento semi-secco o umido). Si prega di seguire il protocollo del produttore.</li>
</ol>2. Blocco delle membrane PVDF...

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. 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S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

Western blot è una tecnica analitica ampiamente utilizzata per rilevare proteine specifiche che è stata sviluppata ~ 40 annifa 7,8. Da allora, la tecnica ha continuato ad evolversi, con successive innovazioni che migliorano la sensibilità, la velocità e la quantificazionedella tecnica 2,9,10,11,12,...

Una macchia occidentale (nota anche come immunoblot) è una tecnica potente e fondamentale in un'ampia gamma di discipline scientifiche e cliniche. Questa tecnica è usata per esaminare la presenza, l'abbondanza relativa, la massa molecolare relativa e le modifiche post-tras traslizionali delle proteine1. Combinato con l'analisi digitale delle immagini, questo metodo può analizzare in modo affidabile l'abbondanza di proteine e modificheproteiche 2. Sebbene la macchia occidentale sia eseguita regolarmente, è un metodo dispendioso in termini di tempo e manodopera. Sono necessarie lunghe incubazioni dell'anticorpo con membrane. Qui descriviamo una modifica del metodo di incubazione che supera questa limitazione senza sacrificare la sensibilità.
Durante l'incubazione della membrana, gli anticorpi galleggiano in soluzione mentre gli antigeni vengono immobilizzati sulla membrana. A causa della loro elevata affinità, il tasso di legame degli anticorpi all'antigene è più veloce della diffusione degli anticorpi dalla soluzione sfusa alla membrana. In questo modo si crea un "livello di esaurimento" a bassa concentrazione (Figura 1). Potrebbero essere necessario ore prima che anticorpi più distanti raggiungano la membrana attraverso la diffusione passiva, che è il principale fattore responsabile dei lunghi tempi di incubazione in questa tecnica. Questo effetto è chiamato limitazione del trasporto di massa (MTL)3. È stato proposto che il drenaggio ripetitivo e il rifornimento della soluzione contenente anticorpi possano interrompere lo strato di esaurimento e superare l'MTL4. Qui, abbiamo ideato una tecnica unica che implementa questo concetto ciclico di drenaggio e rifornimento (CDR) per diminuire l'effetto dell'MTL in un tradizionale protocollo di soffiatura occidentale e ridurre notevolmente il periodo di incubazione richiesto.
Al fine di mantenere la sensibilità di rilevamento con un breve tempo di incubazione, abbiamo fatto uso di una tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione che accelera la reazione antigene-anticorpo, migliorando così il rapporto segnale-rumore5. Molti agenti di miglioramento dell'immunoreazione disponibili in commercio (IRE) sono costituiti da 2 componenti (soluzione 1 e 2, vedi Tabella dei materiali). La composizione proprietaria o il meccanismo d'azione dell'IRE non è stato divulgato, ma abbiamo precedentemente scoperto che IRE ha diminuito la costante di dissociazione tra l'antigene e l'anticorpo nei test di legame in fase solida, indicando che una maggiore affinità è, almeno in parte, responsabile dell'effetto di miglioramento dell'IRE6. La combinazione di CDR e IRE produce un protocollo western blotting ad altissima velocità che riduce l'intero tempo di procedura senza sacrificare la sensibilità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure Imaging System 600</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure 600</td>
			<td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>NKB-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9310V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9340V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYBAID Micro-4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>seracare</td>
			<td>5430-0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#223; actin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>927-40100</td>
			<td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OXO Salad Spinner</td>
			<td>OXO</td>
			<td>32480V2B</td>
			<td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Sealing Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M PM996</td>
			<td>semi-transparent flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared in a machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

Una macchia occidentale (nota anche come immunoblot) è un metodo canonico per la ricerca biomedica. È comunemente usato per determinare la dimensione relativa e l'abbondanza di proteine specifiche e le modifiche delle proteine post-traslazionali. Questa tecnica ha una ricca storia e rimane ampiamente utilizzata per la sua semplicità. Tuttavia, la procedura di gonfiore occidentale richiede notoriamente ore, anche giorni, per essere completata, con un collo di bottiglia critico che sono i lunghi tempi di incubazione che ne limitano la produttività. Questi passaggi di incubazione sono necessari a causa della lenta diffusione degli anticorpi dalla soluzione sfusa agli antigeni immobilizzati sulla membrana: la concentrazione di anticorpi vicino alla membrana è molto inferiore alla concentrazione di massa. Qui presentiamo un'innovazione che riduce drasticamente questi intervalli di incubazione migliorando il legame dell'antigene attraverso il drenaggio ciclico e il rifornimento (CDR) della soluzione anticorpale. Abbiamo anche utilizzato una tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione per preservare la sensibilità del saggio. Una combinazione del metodo CDR con un agente di miglioramento dell'immunoreazione commerciale ha aumentato il segnale di uscita e ridotto sostanzialmente il tempo di incubazione degli anticorpi. La macchia occidentale ad altissima velocità risultante può essere eseguita in 20 minuti senza alcuna perdita di sensibilità. Questo metodo può essere applicato alle macchie occidentali utilizzando sia il rilevamento chemiluminescente che fluorescente. Questo semplice protocollo consente ai ricercatori di esplorare meglio l'analisi dell'espressione proteica in molti campioni.

Questo esempio illustra l'efficacia del metodo CDR insieme alla tecnologia di immunoenhancing sulla macchia occidentale. L'incubazione statica è stata eseguita su un film flessibile semitrasparente in cui le membrane PVDF sono state incubate con la soluzione anticorpale, mentre l'incubazione CDR era in un forno di ibridazione da tubi rotanti che contenevano le membrane e la soluzione anticorpale (Movie). La figura 2 ha mostrato quantità di antigene e anticorpo, rispettivamente, necessarie ...

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Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Una tecnica di soffiatura occidentale ad altissima velocità viene sviluppata migliorando la cinetica del legame antigene-anticorpo attraverso la tecnologia di drenaggio e rifornimento ciclico (CDR) in combinazione con un agente che migliora l'immunoreazione.

Western Blot ad altissima velocità che utilizza la tecnologia di miglioramento dell'immunoreazione

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

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Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...