Name: ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Detta arbete stöddes av avdelningen för intramural forskning, nationalhjärta, lungor och blodinstitut, nationella hälsoinstitut. S.H. stöddes av Japan Public-Private Partnership Student Study Abroad Program, och H.N. och K.Y. var av Valor och V Drug Overseas Training Scholarship.

1. SDS-PAGE och överföring till ett PVDF-membran
<ol><li>Utför SDS-PAGE för att separera proteiner baserat på relativ storlek. OBS: Alla kommersiella eller hemgjorda gelsystem är bra. Följ tillverkarens protokoll.</li>
	<li>Överför separerade proteiner från en gel till ett PVDF-membran. OBS: Vanliga överföringsmetoder (halvtorr eller våt överföring) är lämpliga. Följ tillverkarens protokoll.</li>
</ol>2. Blockering av PVDF-membran
<ol><li>Inkubera membranen i lämpliga ...

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting.">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li><li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing.">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li><li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes.">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+but+not+Obsolete:+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot.">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays.">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li><li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses.">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852 (2016).</li><li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

Western blot är en allmänt använd analytisk teknik för att upptäcka specifika proteiner som utvecklades ~ 40 år sedan7,8. Sedan dess har tekniken fortsatt att utvecklas, med efterföljande innovationer som förbättrar känsligheten, hastigheten och kvantifieringen av tekniken2,9,10,11,12,</...

En western blot (även känd som en immunoblot) är en kraftfull och grundläggande teknik inom ett brett spektrum av vetenskapliga och kliniska discipliner. Denna teknik används för att undersöka förekomsten, relativa överflöd, relativ molekylär massa och post-translationella modifieringar av proteiner1. I kombination med digital bildanalys kan denna metod på ett tillförlitligt sätt analysera överflöd av proteiner och proteinmodifieringar2. Även om western blot utförs rutinmässigt, är det en tidskrävande och arbetsintensiv metod. Långa inkubationer av antikroppen med membran krävs. Här beskriver vi en ändring av inkubationsmetoden som övervinner denna begränsning utan att offra känsligheten.
Under inkubation av membranet flyter antikroppar i lösning medan antigener immobiliseras på membranet. På grund av deras höga affinitet är antikroppsbindningshastigheten till antigenet snabbare än diffusionen av antikroppar från bulklösningen till membranet. Detta skapar ett lågkoncentrationslager för utarmning (figur 1). Det kan ta timmar för mer avlägsna antikroppar att nå membranet via passiv diffusion, vilket är den viktigaste faktorn som är ansvarig för långa inkubationstider i denna teknik. Denna effekt kallas masstransportbegränsningen (MTL)3. Det har föreslagits att repetitiv tömning och påfyllning av den antikroppsinnehållande lösningen kan störa utarmningsskiktet och övervinna MTL4. Här har vi utarbetat en unik teknik som implementerar detta cykliska dränerings- och påfyllningskoncept (CDR) för att minska effekten av MTL i ett traditionellt västra blotting-protokoll och avsevärt förkorta den nödvändiga inkubationstiden.
För att bibehålla detektionskänsligheten med kort inkubationstid använde vi oss av en immunoreactionförbättrande teknik som accelererar antigenantikroppsreaktionen och därigenom förbättrar signal-till-brusförhållandet5. Många kommersiellt tillgängliga immunreaction förbättra medel (IRE) består av 2 komponenter (lösning 1 och 2, se tabell över material). IRE:s proprietära sammansättning eller verkningsmekanism har inte offentliggjorts, men vi har tidigare funnit att IRE minskade dissociationskonstanten mellan antigenet och antikroppen i solidfasbindningsanalyser, vilket indikerar att ökad affinitet åtminstone delvis är ansvarig för den ökande effekten av IRE6. Kombinationen av CDR med IRE ger ett ultrahöghastighetsprotokoll för västra blotting som minskar hela procedurtiden utan att offra känsligheten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure Imaging System 600</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure 600</td>
			<td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>NKB-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9310V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9340V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYBAID Micro-4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>seracare</td>
			<td>5430-0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#223; actin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>927-40100</td>
			<td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OXO Salad Spinner</td>
			<td>OXO</td>
			<td>32480V2B</td>
			<td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Sealing Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M PM996</td>
			<td>semi-transparent flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared in a machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

En västerländsk fläck (även känd som en immunoblot) är en kanonisk metod för biomedicinsk forskning. Det används ofta för att bestämma den relativa storleken och överflöd av specifika proteiner samt post-translationella proteinmodifieringar. Denna teknik har en rik historia och är fortfarande i utbredd användning på grund av dess enkelhet. Men det västerländska blotting-förfarandet tar berömt timmar, till och med dagar, att slutföra, med en kritisk flaskhals som är de långa inkubationstiderna som begränsar dess genomströmning. Dessa inkubationssteg krävs på grund av långsam diffusion av antikroppar från bulklösningen till de immobiliserade antigenerna på membranet: antikroppskoncentrationen nära membranet är mycket lägre än bulkkoncentrationen. Här presenterar vi en innovation som dramatiskt minskar dessa inkubationsintervaller genom att förbättra antigenbindningen via cyklisk tömning och påfyllning (CDR) av antikroppslösningen. Vi använde också en immunoreaction förbättra teknik för att bevara känsligheten hos analysen. En kombination av CDR-metoden med ett kommersiellt immunoreaction förbättra agent ökade utgångssignalen och avsevärt minskade antikropp inkubationstiden. Den resulterande ultrahöga västra fläcken kan åstadkommas på 20 minuter utan någon förlust i känslighet. Denna metod kan tillämpas på västerländska blots med både chemiluminescent och fluorescerande detektion. Detta enkla protokoll gör det möjligt för forskare att bättre utforska analysen av proteinuttryck i många prover.

Detta exempel illustrerar effektiviteten av CDR-metoden tillsammans med immunoenhancing teknik på western blot. Statisk inkubation utfördes på en halvtransparent flexibel film där PVDF-membran inkuberades med antikroppslösningen, medan CDR-inkubation var i en hybridiseringsugn genom roterande rör som innehöll membranen och antikroppslösningen (Film). Figur 2 visade mängder av antigen respektive antikroppar som är nödvändiga för chemiluminescent upptäckt på västra blots. I bå...

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

En ultrahög hastighet western blotting teknik utvecklas genom att förbättra kinetiken av antigen-antikropp bindning genom cyklisk dränering och påfyllning (CDR) teknik i samband med en immunoreaction förbättra agent.

Ultrahög hastighet Western Blot med hjälp av immunoreaction förbättra teknik

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifiering av inositol fosfat eller fosfoinositid samverkande proteiner genom affinitetskromatografi kopplad till Western blot eller masspektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot Analys för detektion och kvantifiering av Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Utforska biomolekylär interaktion mellan molekylär chaperon Hsp90 och dess klientproteinkinas Cdc37 med hjälp av fälteffektbiosensingteknik

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-blot-tekniken: en kryo-EM-provberedningsmetod för att separera enstaka lager från flerskiktiga eller koncentrerade biologiska prover

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Studie av funktioner och aktiviteter av neuronala K-Cl Co-Transporter KCC2 med hjälp av Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...