Name: ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Bu çalışma Intramural Araştırma Bölümü, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi. S.H., Japonya Kamu-Özel Ortaklığı Öğrenci Yurtdışında Eğitim Programı tarafından desteklendi ve H.N. ve K.Y. Valor ve V Drug Overseas Training Scholarship tarafından desteklendi.

1. SDS-PAGE ve bir PVDF membran aktarın
<ol><li>Proteinleri göreli boyuta göre ayırmak için SDS-PAGE gerçekleştirin. NOT: Herhangi bir ticari veya ev yapımı jel sistemi iyidir. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.</li>
	<li>Ayrılmış proteinleri bir jelden PVDF zarına aktarın. NOT: Yaygın transfer yöntemleri (yarı kuru veya ıslak transfer) uygundur. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.</li>
</ol>2. PVDF membranlarının engellenmesi
<ol><li>Membranları oda sıcaklı...

<ol>
	<li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis.">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li><li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting.">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li><li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing.">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li><li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes.">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li><li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+but+not+Obsolete:+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot.">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Western+blotting":+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays.">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li><li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses.">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852 (2016).</li><li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure.">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots.">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li><li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots.">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li></ol>

Batı blotu, ~40 yıl önce7,8. O zamandan beri, teknik gelişmeye devam etti, sonraki yenilikler tekniğin hassasiyetini, hızını ve niceliğini geliştirdi2, 9,10,11,12,13. Burada sunulan gelişmiş ultra yüksek hızlı batı şişkinlik protokolü, mevcut teknik...

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir), çok çeşitli bilimsel ve klinik disiplinlerde güçlü ve temel bir tekniktir. Bu teknik, proteinlerin varlığını, bağıl bolluğunu, bağıl moleküler kütlesini ve çeviri sonrası modifikasyonlarını incelemek için kullanılır1. Dijital görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem proteinlerin bolluğunu ve protein modifikasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz edebilir2. Batı lekesi rutin olarak yapılsa da zaman alan ve emek yoğun bir yöntemdir. Antikorun membranlarla uzun inkübasyonları gereklidir. Burada, duyarlılıktan ödün vermeden bu sınırlamanın üstesinden gelen kuluçka yönteminin bir değişikliğini açıklıyoruz.
Membran inkübasyonu sırasında, antikorlar çözelti içinde yüzerken, antijenler membran üzerinde hareketsiz hale getirilir. Yüksek benzeşimleri nedeniyle, antijene antikor bağlanma hızı, antikorların dökme çözeltiden zara yayılmasından daha hızlıdır. Bu, düşük konsantrasyonda bir "tükenme katmanı" oluşturur (Şekil 1). Bu teknikte uzun kuluçka sürelerinin ana faktörü olan pasif difüzyon yoluyla daha uzak antikorların zara ulaşması saatler alabilir. Bu etkiye toplu taşıma sınırlaması (MTL)3denir. Antikor içeren çözeltinin tekrar tekrar boşaltılması ve yenilenmesinin tükenme tabakasını bozabileceği ve MTL4'ünüstesinden gelebileceği önerilmiştir. Burada, geleneksel bir batı blotting protokolünde MTL'nin etkisini azaltmak ve gerekli kuluçka süresini kısaltmak için bu döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) kavramını uygulayan benzersiz bir teknik tasarladık.
Algılama hassasiyetini kısa bir kuluçka süresiyle korumak için, antijen-antikor reaksiyonunu hızlandıran ve böylece sinyal-gürültü oranını artıran bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık5. Piyasada bulunan birçok immünoreaksiyon arttırıcı madde (IRE) 2 bileşenden oluşur (Çözüm 1 ve 2, bkz. Malzeme Tablosu). IRE'nin tescilli bileşimi veya etki mekanizması açıklanmadı, ancak daha önce IRE'nin katı faz bağlama testlerinde antijen ve antikor arasındaki ayrışma sabitini azalttığını bulduk, bu da artan benzeşimin en azından kısmen IRE6'nınarttırıcı etkisinden sorumlu olduğunu gösteriyor. CDR'nin IRE ile kombinasyonu, hassasiyettan ödün vermeden tüm prosedür süresini azaltan ultra yüksek hızlı bir batı blotting protokolü verir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apollo Transparency Film for Laser Printers</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure Imaging System 600</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>Azure 600</td>
			<td>Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>NKB-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARNATION Instant Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from sheep</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9310V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab&#8217;)2 fragment from donkey</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA9340V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HYBAID Micro-4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>IPVH304F0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>seracare</td>
			<td>5430-0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#223; actin antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td>
			<td>LICOR</td>
			<td>927-40100</td>
			<td>Blocking Buffer for fluorescent detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OXO Salad Spinner</td>
			<td>OXO</td>
			<td>32480V2B</td>
			<td>Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Sealing Film</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>Parafilm M PM996</td>
			<td>semi-transparent flexible film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepared in a machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-6X His tag antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir) biyomedikal araştırmalar için kurallı bir yöntemdir. Genellikle belirli proteinlerin bağıl boyutunu ve bolluğunu ve çeviri sonrası protein modifikasyonlarını belirlemek için kullanılır. Bu teknik zengin bir geçmişe sahiptir ve sadeliği nedeniyle yaygın kullanımda kalır. Bununla birlikte, batı şişkinlik prosedürünün tamamlanması saatler, hatta günler alır ve kritik bir darboğaz, verimini sınırlayan uzun kuluçka süreleridir. Bu inkübasyon adımları, antikorların toplu çözeltiden membran üzerindeki hareketsiz antijenlere kadar yavaşça yayılması nedeniyle gereklidir: zarın yakınındaki antikor konsantrasyonu, toplu konsantrasyondan çok daha düşüktür. Burada, antikor çözeltisinin döngüsel drenajı ve yenilenmesi (CDR) yoluyla antijen bağlanmasını iyileştirerek bu kuluçka aralıklarını önemli ölçüde azaltan bir yenilik sunuyoruz. Ayrıca tahlil hassasiyetini korumak için bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık. CDR yönteminin ticari bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile kombinasyonu çıkış sinyalini artırdı ve antikor inkübasyon süresini önemli ölçüde azalttı. Elde edilen ultra yüksek hızlı batı lekesi, hassasiyet kaybı olmadan 20 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu yöntem hem chemiluminescent hem de floresan tespiti kullanılarak batı lekelerine uygulanabilir. Bu basit protokol, araştırmacıların birçok örnekte protein ekspresyonunun analizini daha iyi keşfetmelerini sağlar.

Bu örnek, CDR yönteminin batı blot üzerindeki immünoenhancing teknolojisi ile birlikte etkinliğini göstermektedir. Statik inkübasyon, PVDF membranlarının antikor çözeltisi ile inkübe edildiği yarı saydam esnek bir film üzerinde yapılırken, CDR inkübasyonu membranları ve antikor çözeltisini (Film) içeren tüpleri döndürerek hibridizasyon fırınında yapıldı. Şekil 2'de batı lekelerinde chemiluminescent tespiti için gerekli olan antijen ve antikor miktarları gö...

Watch this Scientific Journal Video about Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology at JoVE.com

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Moleküler Chaperone Hsp90 ve İstemci Protein Kinaz Cdc37 Arasındaki Biyomoleküler Etkileşimi Alan Etkili Biyosensing Teknolojisini Kullanarak Keşfetmek

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...