Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

تعترف MBS بدعم MI / CNRS بموجب العقد آلات في حدود 2014-2015. NJ يعترف CEA الدولي برنامج أبحاث الدكتوراه (Irtelis) للحصول على زمالة الدكتوراه. محمد بن سلمان و SJ تعترفان بالتمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 تحت اتفاقية منحة ماري سكودودوسكا كوري رقم 722687. MBS، SJ، وNJ أشكر LIPhy (UGA) لإنشاء غرفة نظيفة لتجارب microfabrication. يقر IBS بالاندماج في معهد أبحاث غرونوبل متعدد التخصصات (IRIG, CEA).

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وقد تم تطوير جهاز microfluidic لبلورة البروتين على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى المجهري وتجارب الحيود في الموقع الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن تكون ملفقة رقائق NOA 81 دمج أغشية غسيل الكلى RC من أي MWCO من أجل استخدام التحليل الدقيق لبلورة البروتين على رقاقة. واستخدمت مواد تصنيع ذات شفافية عالية نسبياً للأشعة السينية، مما يجعل الرقائق متوافقة مع علم البلورات البروتيني في الموقع. تم تقييم مواد التصنيع التي تؤلف المقصورة لبلورة البروتين من الجهاز (PMMA، Kapton، RC غشاء غسيل الكلى) لتوليد ضوضاء خلفية منخفضة. على وجه التحديد، ويلاحظ أساسا الضوضاء الخلفية الناتجة عن رقاقة غسيل الكلى في دقة منخفضة (> 6 Å) ولا يؤثر على علاج بيانات الحيود عالية الدقة من بلورات lysozyme كبيرة المطلوبة لتحديد بنية البروتين. يتم تضخيم أتمتة جمع البيانات باستخدام دعم مطبوع ثلاثي الأبعاد يمكن تركيبه مباشرة في خطوط شعاع البلورات الجزيئية الصغيرة وتحمل ما يصل إلى ثلاث رقائق في وقت واحد. وبهذه الطريقة، يتم تجنب الحصاد اليدوي والتلاعب ببلورات البروتين الهشة. وعلاوة على ذلك، جمع البيانات تجري في درجة حرارة الغرفة، وتجنب الحاجة إلى cryoprotection التي يمكن أن تكون ذات صلة للتغيرات التكون من بنية البروتين الأصلي2،3.
استخدام المجهر كوسيلة لزراعة البلورات على رقاقة يسمح بدقة رصد ومراقبة عملية التبلور. كما نوقش في المقدمة، وقد تم تنفيذ معظم أساليب تبلور البروتين التقليدية باستخدام الأجهزة microfluidic11،14. ومع ذلك، لم يتم بعد استغلال مزايا غسيل الكلى لبلورة البروتين بشكل كامل في النطاق الصغير. يوفر التحليل المجهري على رقاقة إمكانية لدراسة الرسوم البيانية المرحلة وإجراء الفرز والاستفادة المثلى من ظروف التبلور مع عينة البروتين نفسه19. بالنسبة للنماذج الأولية المعروضة في هذا العمل ، يقتصر استهلاك البروتين لكل شريحة إلى 0.1 أو 0.3 ميكرولتر . يتضمن بروتوكول التصنيع العديد من الخطوات ولكنه مباشر ويمكّن من تصنيع العديد من الأجهزة (20 إلى 30 رقائق) في يوم واحد في الغرفة النظيفة ، مع مواد غير مكلفة نسبيًا. ومع ذلك، يمكن أن يكون تبلور على رقاقة من البروتينات إجراء دقيق نظرا للطبيعة الذاتية العشوائية من التنو ونمو البلورات، وخاصة في النطاق الصغير. وقد وصفت دراسة حالة، حيث استخدمت ظروف راسخة لبلورة اللوزيم الذي أسفر عن بلورات قوية ومحددة جيدا مناسبة لجمع بيانات الحيود بالأشعة السينية في الموقع. ومع ذلك، قد تنشأ صعوبات من استخدام أهداف أكثر تحديا للبروتينات، مثل البروتينات الغشاء، حيث متوسط التبلور هو أكثر تعقيدا بكثير، والرسوم البيانية المرحلة غير معروفة وظروف تبلور العمل الجيد ليست بعد راسخة. تقدم شريحة غسيل الكلى إمكانية تجاوز هذه الصعوبات ودراسة الرسوم البيانية للمرحلة على الشريحة ، دون التخلص من عينة البروتين القيمة والمكلفة في كثير من الأحيان ، من خلال مجرد تبادل محلول التبلور داخل القناة الدقيقة.
براعة الأجهزة microfluidic تنبع من استغلال التحليل الدقيق لبلورة البروتين على رقاقة من أجل السيطرة عكسيا ظروف التبلور وتركيز الخريطة ودرجة الحرارة متنوعة الرسم البياني مرحلة باستخدام انخفاض حجم البروتين. وعلاوة على ذلك، فإن الجهاز متوافق مع تجارب الحيود في الموقع بالأشعة السينية وprototyping من الأجهزة غير مكلفة وسريعة. يمكن أن تزرع العديد من البلورات isomorphous من البروتينات القابلة للذوبان والأغشية (في التحضير) على رقاقة ومن المتوقع أن كل هذه الميزات يمكن استخدامها لدراسات البلورات الأشعة السينية المسلسل من أهداف البروتين الصعبة في المرافق السنكروترون وXFEL. وأخيراً، فإن إجراء دراسات على الشريحة وفي الموقع يتم تحديدها زمنياً هو احتمال مستقبلي يمكن أن يكون ذا أهمية كبيرة للمجتمع البلوري. لذلك ، من خلال زراعة البلورات على رقاقة غسيل الكلى وإدخال الكواشف في قناة microfluidic ، إما يدويًا (باستخدام حقنة) أو تلقائيًا (مع نظام السوائل للتحكم في الضغط أو مضخة الحقنة) ، ستركز الجهود المستقبلية على إثبات أن رقائق microfluidic يمكن استخدامها بنجاح لتحريك التجارب التي تم حلها زمنيًا على خطوط الشعاع السنكروترونية.

إن توضيح الهيكل الثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للجزيئات الحيوية البيولوجية هو سعي مستمر في علم الأحياء الهيكلي حيث تظل تقنية التصوير البلوري للأشعة السينية هي تقنية التحقيق الرئيسية. تطبيقها لكشف التفاصيل الهيكلية للجزيئات المعقدة، مثل البروتينات، ويهدف إلى تسهيل فهم آليات أعمالهم وإشراكهم في وظائف بيولوجية مختلفة. مصادر الأشعة السينية القوية في السنكروترونات وأشعة إكس ليزر الإلكترون الحر (XFELs) توفر جميع الأدوات اللازمة لنظر أعمق في بنية البروتينات في القرار الذري القريب. على الرغم من المزايا التي تأتي جنبا إلى جنب مع استخدام الأشعة السينية للدراسات الهيكلية، وهناك قيود جوهرية لاشعاع الأشعة السينية وعملية التبلور نفسها. الأضرار الإشعاعية التي تسببها ارتفاع تدفق الأشعة السينية وأوقات التعرض الطويل للبلورات البروتينية أمام شعاع الأشعة السينية هي معلمات تقييدية أن علماء البلورات يجب أن يتجاوزوا استخدام التبريد المبرد1. ومع ذلك، يمكن العثور على ظروف cryocooling الأمثل تكون شاقة منذ التغيرات التشكلية من بنية البروتين الأصلي أو القطع الأثرية يمكن إخفاؤها2،3. وعلاوة على ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن إجراء تجارب الحيود في درجة حرارة الغرفة يؤدي إلى انخفاض الضرر الإشعاعي المحدد4. وهناك اختناق آخر في علم الأحياء الهيكلية هو الحصول على بلورات جيدة diffracting مع حجم كاف5. بلورات صغيرة أسهل في الإنتاج، وخاصة في حالة البروتينات الغشاء، ولكن هي أكثر عرضة للتلف الإشعاعي حتى في ظل ظروف cryocooling لأن جرعة إشعاع عالية يجب أن توجه في حجم أصغر بالمقارنة مع حالة بلورات البروتين أكبر6. يمكن لنهج الرواية من البلورات المسلسل7،8 في السنكروترونات وXFELs التحايل على القيود من الأضرار الإشعاعية ، وفي الوقت نفسه استغلال بلورات أصغر (200 نانومتر إلى 2 ميكرومتر)7 عن طريق دمج مجموعات البيانات من متعددة ، بلورات البروتينات ذات الأيزومورف وتوجّه عشوائيًا والاستفادة من التقدم التكنولوجي المرتبط به مثل نبضات الفيمتو ثانية وأوقات التعرض الأقصر والأشعة السينية الدقيقة التركيز5،7،9،10.
تكنولوجيا Microfluidic قيمة للتصوير البلوري بالأشعة السينية، وتظهر مزايا متعددة لبلورة الجزيئات الحيوية البيولوجية والتحقيق الهيكلي. يتطلب إجراء تجارب التبلور في الأجهزة الدقيقة الفلورية كميات صغيرة من عينة البروتين ، وبالتالي تقييد تكلفة إنتاج هذه الجزيئات الحيوية عالية القيمة وتسهيل فحص عالي الإنتاجية وتعظيم ظروف التبلور العديدة. وعلاوة على ذلك، فإن نسبة المساحة السطحية الكبيرة إلى الحجم في النطاق microfluidic وظواهر النقل والانتشار المحدودة تمكن من التحكم الدقيق في التدفقات ودرجة الحرارة أو تركيز التدرجات11،12،13،14، تقديم الأجهزة microfluidic مناسبة لزراعة بلورات ذات حجم موحد واستكشاف الرسوم البيانية المرحلة15،16،17،18،19. وعلاوة على ذلك، فإن أدوات الفلورويديك المجهرية تعرض إمكانية مميزة لمعالجة عقبة أخرى في علم البلورات البروتينية، وهي تسليم العينات، وضرورة التعامل مع بلورات البروتين وجنيها قبل استخدامها في تجارب الحيود بالأشعة السينية. طريقة البلورات على رقاقة وأشعة سينية في الموقع يزيل التلاعب الكريستال والتدهور المحتمل للجودة وضوح الشمس قبل جمع البيانات. وقد تم تصميم مجموعة واسعة من رقائق microfluidic متوافقة في الموقع لبلورات البروتين الأشعة السينية في الموقع ، وضعت ، واختبارها من قبل العديد من المجموعات البحثية التي تواجه القيود ذات الصلة الناشئة عن طبيعة المواد microfabrication وتفاعلاتها مع الأشعة السينية14،19،20،21،22،23. ويجب أن تكون مواد التصنيع شفافة بصريا، خاملة بيولوجيا وأن تظهر شفافية عالية في إشعاع الأشعة السينية، وأن تكون النسبة المثلى للإشارة إلى الضوضاء أثناء جمع البيانات.
معظم طرق التبلور المطبقة في البلورات البروتين التقليدية24،25 كما تم تنفيذها على مقياس microfluidic11،14 لبلورة رقاقة وفي الموقع تحليل الحيود X-ray. بسيطة، هجين، أو متعددة الطبقات microfluidic جهاز دمج بخار نشر26، تبخر27، انتشار واجهة الحرة (FID)28، microbatch26، أو حتى البذر29 وقد استخدمت لبلورة البروتينات القابلة للذوبان والغشاء. يمكن تحقيق فحص الإنتاجية العالية والاستفادة المثلى من ظروف التبلور30،31 في32المستندة إلى جيد ، القائمة على قطرات33، أو صمام-34 الأجهزة. في الموقع وقد أجريت تجارب الحيود بالأشعة السينية لأهداف البروتين الصعبة في درجة حرارة الغرفة في رقائق دقيقة ملفقة من مواد مختلفة مثل PDMS (بوليديميثيلسيلوكسيان)، COC (دوري أوليفين copolymer)، PMMA (بولي (ميثيل ميثاكريلات))2 1,22,26,28,29, أفلام الجرافين23, Kapton35, الايبوكسي الغراء6, أو NOA (Norland لاصق البصري)19 و المواد ' الشفافية في الأشعة السينية وقد تم تقييم مساهمتها في الضوضاء الخلفية. وعلاوة على ذلك، وقد تم تصميم رقائق لزوجين في الموقع والبيانات استراتيجيات جمع المسلسل في أداة واحدة للأشعة السينية تجارب الكريستال البروتين في مصادر سينكروترون23و35و36 و XFELs7.
كما تم تنفيذ جمع البيانات عن درجة حرارة الغرفة في الموقع في مختلف طرق وأجهزة التوصيل. على سبيل المثال، استخدم Nogly etal. 54 حقن مرحلة مكعبة دهنية (LCP) من أجل دراسة بنية مضخة الفوتون الضوئية الضوئية (bR) بواسطة بلورات الفومتوة الثانية التسلسلية (SFX) باستخدام مصدر XFEL. تم حل الهيكل البلوري لـ bR إلى 2.3 Å القرار، مما يدل على توافق حاقن LCP مع التصوير البلوري التسلسلي الذي تم حله في الوقت (TR-SFX). باكستر وآخرون55 صممت شبكة متعددة البلورات عالية الكثافة، ملفقة بواسطة 100 أو 200 ميكرومتر سميكة بولي كربونات البلاستيك مع ثقوب الليزر قطع من مختلف الأحجام. يمكن إصلاح 5 ميكرومتر إضافي سميكة من البولي كربونات الفيلم إلى جانب واحد من الشبكة عند استخدام الجهاز للجلوس - أو شنقا - قطرة تبلور التجارب. ويمكن استخدام هذه الشبكة عالية الكثافة بطرق متعددة كما يمكن تحميل بلورات مباشرة على الموانئ من الجهاز أو يمكن أن تزرع بلورات على الجهاز عن طريق نشر بخار أو طريقة LCP. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل الشبكة في قاعدة مغناطيسية قياسية واستخدامها لجمع بيانات الأشعة السينية في الموقع في ظروف درجة حرارة الغرفة أو في ظروف التبريد. وفي الآونة الأخيرة، طور فيلر وآخرون56 حامل عينة لبلورات الأشعة السينية في الموقع في التصوير الشعاعي الضفي في درجة حرارة التبريد والمحيطة مع الحد الأدنى من مساهمة الضوضاء الخلفية. على وجه التحديد، حامل يتكون من دعم البلاستيك، ورقائق COC شفافة ورقائق البوليميد منظم microporous. تم تصميمه ليحل محل الشرائح غطاء شائعة الاستخدام لإعداد قطرات التبلور، مع السماح في مكان التلاعب مثل نقع ليغاند، تشكيل معقد، وحماية المبردة دون فتح قطرة التبلور أو التعامل مع بلورات يدويا. وعلاوة على ذلك، يمكن إزالة حامل العينة من لوحة التبلور ووضعها على قاعدة مغناطيسية لجمع البيانات في الموقع عند خطوط الشعاع القياسية القائمة على الخيوط القائمة على goniometer. لجمع بيانات درجة الحرارة المحيطة، يتم إزالة احباط COC قبل التجربة وفقط 21 ميكرومتر سميكة رقائق بوليميد يساهم في تشتت الخلفية، والتي في هذه الحالة هو الحد الأدنى. هذه الأمثلة لا تشكل سوى جزء صغير من البحوث الجارية والعديد من الرقائق الدقيقة تنوعا وضعت للتصوير البلوري البروتين الأشعة السينية.
ومع ذلك، لم يتم دمج طريقة تبلور بروتين غسيل الكلى على نطاق واسع داخل microfluidics. غسيل الكلى هو طريقة قائمة على الانتشار تهدف إلى توازن التركيز المشفّر من خلال غشاء شبه نفاذي من أجل الاقتراب من التركيز الاسمي لبلورة البروتين ويمكّن من التحكم الدقيق والواجب على ظروف التبلور24. يمكن اختيار قطع الوزن الجزيئي (MWCO) لغشاء غسيل الكلى شبه القابل للنفاذ اعتمادًا على الوزن الجزيئي للجزيئات الكبيرة والزواطع للسماح بانتشار الجزيئات الصغيرة المثبطة مع الاحتفاظ بالجزيئات الكبيرة من الاهتمام. نظرا لقابلية عكس عملية غسيل الكلى، ويمكن استخدامه في تركيبة مع التحكم في درجة الحرارة للفصل وتحسين النوى ونمو البلور بشكل مستقل37 للتحقيق في الرسوم البيانية المرحلة عن طريق تغيير تركيز حاد أثناء استخدام نفس عينة البروتين. يتم مراجعة دمج الأغشية في microfluidics من قبل دي جونغ وآخرون38 ودراسات الحالة في البيولوجيا زرع غسيل الكلى في رقائق يمكن سردها أساسا في إعداد العينات، تركيز أو تطبيقات الترشيح39،40،41،42 أو دراسات الخلية ذات الصلة43،44. وقد استخدم شيم وآخرون37 التغلغل من خلال نظام إدارة المباني (PDMS) لدراسة نوى ونمو الإكسيلاناز في ظروف مختلفة. تغلغل الماء من خلال غشاء PDMS السميك 15 ميكرومتر في خزان البروتين للجهاز microfluidic، ثم تغيير البروتين والتركيز المتدفع.
البروتوكول الذي وضعه Junius وآخرون19،45 لتصنيع رقاقة microfluidic متوافقة لكل من تبلور البروتين على رقاقة عن طريق التحليل الدقيق وفي الموقع تجارب الحيود الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة. بروتوكول لتصنيع الجهاز مستوحاة مباشرة من العمل الرائد الذي أنجزه Studer وزملاء العمل12،46 لملصقات منقوشة على شكل مصغر من الراتنج القائم على الثيرولين الصورة القائمة NOA 81 تضمين الأغشية المتاحة تجاريا ، وذلك باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة بصمة. وأدى تعديل مبتكر للطريقة إلى تمكين الرقائق الدقيقة من استخدام التحليل الدقيق لرصد ومراقبة المعلمات التجريبية لنمو بلورات البروتين على الشريحة واستغلال مزايا ميكروفليديس في وقت واحد، مثل انخفاض استهلاك عينات البروتين لكل تجربة (<1 ميكرولتر). في عمل سابق، مبادئ غسيل الكلى المطبقة على نظام على نطاق كلي (الحجم النموذجي >20 ميكرولتر) لفحص وتحسين ظروف التبلور عن طريق رسم خرائط درجة الحرارة- درجة الحرارة تركيز المرحلة المخططات أظهرت47. في هذا العمل، يتم وصف بروتوكول لإنتاج رقائق غسيل الكلى التي تتضمن أغشية غسيل الكلى السليلوز (RC) من مختلف MWCO من أجل إجراء تحليل التبلور على رقاقة وفي الموقع X-ray جمع البيانات. وقد تم تقييم المواد التي تتألف منها الرقائق الدقيقة من أجل شفافيتها إلى الأشعة السينية19 ويمكن تعيين الأجهزة مباشرة أمام شعاع الأشعة السينية لتجارب درجة حرارة الغرفة في الحيود الموقعي، باستثناء المناولة اليدوية وتقليل تدهور بلورات البروتين الهشة. في دراسة حالة، نمت بلورات البيض البيض lysozyme على رقاقة عن طريق غسيل المجهر توليد سكان موحد الحجم. ثم تم تركيب الشريحة الدقيقة أمام شعاع الأشعة السينية مع دعم مطبوع ثلاثي الأبعاد19 وتم جمع مجموعات كاملة من بيانات الحيود في الموقع في درجة حرارة الغرفة من بلورات متعددة متساوية الشكل ، مما يدل على الإمكانية العالية وأهمية الرقائق لدراسات البلورات التسلسلية السنكروترونية لأهداف الجزيئات الكبيرة الصعبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

يصف هذا البروتوكول تصنيع أجهزة microfluidic قابلة للاستنساخ وغير مكلفة تغطي خط الأنابيب بأكمله لبلورة البروتينات على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى والسماح في الموقع تجارب البلورات أحادية البلورة أو المسلسل في درجة حرارة الغرفة. البروتوكول تفاصيل عملية تصنيع الرقائق الدقيقة، والتلاعب في تجارب تبلور على رقاقة ومعالجة البيانات الحيود الأشعة السينية التي تم جمعها في الموقع لتوضيح الهيكلية لعينة البروتين. تكمن السمة الرئيسية لهذا الإجراء microfabrication على التكامل المتاحة تجاريا، شبه قابل للتجديد غشاء غسيل الكلى السليلوز في ما بين طبقتين من رقاقة. يختلف قطع الوزن الجزيئي للغشاء المضمن اعتمادًا على الوزن الجزيئي للجزيئات والذرية. يستغل الجهاز مزايا تكنولوجيا المايكرولويدي ، مثل استخدام كميات دقيقة من العينات (<1 ميكرولتر) وضبط دقيق على ظواهر النقل. الرقاقة تقترن بها مع طريقة غسيل الكلى، وتوفير التحكم الدقيق وعكسها على عملية التبلور ويمكن استخدامها للتحقيق في الرسوم البيانية المرحلة من البروتينات على مقياس microliter. ومنقوشة الجهاز باستخدام راتنج القائمة على ثيولين قابلة لللتصوير مع الطباعة الحجرية بصمة لينة على الركيزة البوليمرية شفافة بصريا. وعلاوة على ذلك، تم تقييم تشتت الخلفية للمواد التي تؤلف الرقائق الدقيقة وتوليد ضوضاء الخلفية مما يجعل الشريحة متوافقة مع تجارب الحيود في الموقع بالأشعة السينية. مرة واحدة تزرع بلورات البروتين على رقاقة تصل إلى حجم كاف وتوحيد السكان، يمكن تركيب رقائق مباشرة أمام شعاع الأشعة السينية بمساعدة حامل مطبوع 3D. ويعالج هذا النهج التحديات الناجمة عن استخدام مواد الحماية من المعادن والمحاصيل اليدوية في تجارب بلورات البروتين التقليدية من خلال طريقة سهلة وغير مكلفة. تم جمع مجموعات كاملة من بيانات الحيود بالأشعة السينية من بلورات lysozyme متعددة isomorphous نمت على رقاقة في درجة حرارة الغرفة لتحديد الهيكل.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

هذه الورقة تفاصيل بروتوكول تصنيع رقائق microfluidic وضعت لبلورة البروتين على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى والتجارب في الموقع حيود الأشعة السينية. عملية microfabrication يجعل من الممكن لدمج غشاء غسيل الكلى السليلوز التجديدي شبه قابل للنفاذ مع أي قطع الوزن الجزيئية، بين طبقتين من الرقاقة.

تبلور البروتينات على رقاقة عن طريق المجهر دراسات الحيود في الموقع بالأشعة السينية

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

تصف هذه الورقة بروتوكول تصنيع رقائق microfluidic التي تم تطويرها لتبلور البروتين على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى وتجارب الحيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الرقائق الدقيقة هي اختيار مواد التصنيع ، مما يجعل الرقائق متوافقة مع جمع بيانات حيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة. تتطلب تجارب التبلور على الشريحة كميات صغيرة من عينة البروتين ، مما يقلل من التكلفة الإجمالية للعمل مع هذه الجزيئات الكبيرة ذات القيمة العالية.تبلور على رقاقة يلغي أيضا الحصاد اليدوي من بلورات البروتين الهشة، وكثيرا ما تطبق في تركيبة مع التبريد بالتبريد خلال التجارب البلورية التقليدية. وعلاوة على ذلك، تستخدم رقاقاتنا الدقيقة الغسيل الدقيق لبلورة البروتين، وهي طريقة قائمة على الانتشار تهدف إلى توازن التركيز المتسرعة من خلال غشاء شبه نفاذية، من أجل الاقتراب من التركيز المتمائم لتبلور البروتين، وتمكن من التحكم الدقيق والعادي في ظروف التبلور. يمكن استخدام غسيل الكلى الدقيق جنبا إلى جنب مع التحكم في درجة الحرارة لفصل النوى عن نمو الكريستال للتحقيق في مخططات المرحلة ، عن طريق تغيير التركيز المتعجل أثناء استخدام عينة البروتين نفسها.أولا إعداد 50 غراما من قاعدة السيليكون PDMS وانها عامل علاج في نسبة كتلة 10 إلى واحد. اخلطي المكونين في كوب مع ملعقة. بعد خلط، وضع الخليط في غرفة فراغ من أجل إزالة جميع فقاعات الهواء.وضع 25 غراما من PDMS premixed في SU8 الأولى لإتقان تحتوي على أنماط القناة microfluidic والأعمدة، تصل إلى ارتفاع ما يقرب من خمسة ملليمترات. ثم صب 25 غراما المتبقية من PDMS في سيد SU8 الثاني، التي تحتوي فقط على أنماط من الأعمدة. علاج طبقتين PDMS في الفرن في 338 كلفن لمدة ساعة واحدة.قطع طبقات PDMS الشفاء حول أنماط الماجستير SU8 مع مشرط، وتقشير بلطف قبالة قوالب PDMS من سادة السيليكون. ضع قالب PDMS ، ويضم كل من القنوات والأعمدة على شريحة زجاجية مجهر جامدة مع الأنماط التي تواجه صعودا. قطع قطعة صغيرة من تجديد غشاء غسيل الكلى السليلوز من أجل تغطية الركيزة المركزية للقالب PDMS، والتي تم تصميمها لتكون غرفة البروتين.يتم اختيار قطع الوزن الجزيئي لغشاء غسيل الكلى وفقا للوزن الجزيئي لعينة البروتين ، ومثبطات محلول التبلور. ثم فصل بعناية قطعة جافة من غشاء غسيل الكلى السليلوز المجددة. قطع قطعة صغيرة من غشاء غسيل الكلى المنفصل.حجم هذه القطعة من الغشاء يعتمد على تصميم رقاقة. وعلى وجه التحديد، فإنه يعتمد على أبعاد الركيزة المركزية. إيداع قطعة من غشاء غسيل الكلى على الركيزة المركزية للقالب PDMS، الذي يدعم على الشريحة الزجاجية، مع عموده والقنوات التي تواجه صعودا.ثم ضع العفن PDMS الثاني يضم فقط الأعمدة التي تواجه إلى أسفل، على رأس العفن PDMS التي تدعمها بالفعل على الشريحة الزجاجية. محاذاة جميع أعمدة قوالب PDMS اثنين. تقع قطعة من غشاء غسيل الكلى السليلوز المجدد بين الركيزتين المركزيتين للقوالب PDMS.يمكن إجراء هذه الخطوة من إجراء التصنيع تحت المجهر البصري أو ببساطة عن طريق الفحص البصري بعناية لمحاذاة جميع الأعمدة. ضع التجميع في غرفة فراغ وجفف لمدة 30 دقيقة من أجل إزالة فقاعات الهواء المحاصرين داخل قوالب PDMS ، وتعزيز إدخال راتنج NOA القابل للشفاء الضوئي ، الذي سيتم وصفه في الخطوة التالية من هذا البروتوكول. إزالة الجمعية من غرفة فراغ وملء المساحة الفارغة بين قوالب PDMS اثنين مع الراتنج القائمة على ثيولين photocurable، NOA 81، عن طريق imbibition الشعرية.تطبيق الراتنج على ثلاثة من الجوانب الأربعة للجمعية. ضع التجميع في وصلة متقاطعة وعالج راتنج NOA عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ثماني ثوان ، باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المجمومة من 35 ملليواط لكل سنتيمتر مربع. قطع قطعة PMMA سميكة 175 ميكرومتر في الأبعاد القياسية للشريحة الزجاج المجهر، وقشر قبالة الحماية البلاستيكية من كل جانب من قطعة PMMA.بمجرد الانتهاء من التعرض للأشعة فوق البنفسجية الأولى ، قم بإزالة قالب PDMS العلوي مع راتنج NOA مرتبط جزئيا عالق عليه من قالب PDMS السفلي والشريحة الزجاجية. اضغط بلطف على تجميع قالب PDMS العلوي وراتنج NOA المعالج جزئيا على قطعة PMMA. وضع التجميع الجديد في الرابط عبر وعلاج مرة أخرى راتنج NOA عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية.إزالة بعناية القالب PDMS العليا. رقاقة غسيل الكلى المصنوعة من راتنج NOA عبر الارتباط بالكامل الذي يدمج غشاء غسيل الكلى السليلوز المجدد ويتم دعمه على قطعة PMMA جاهز. السندات الموصلات المتاحة تجاريا على مدخل ومنفذ نقاط القناة microfluidic مع الغراء الايبوكسي سريع.للتعامل مع السوائل، اختر قطر أنابيب PTFE استنادا إلى حجم الموصلات. يتم استخدام الأنابيب لإدخال محلول التبلور داخل القناة السائلة لشريحة غسيل الكلى. ماصة يدويا قطرة من عينة البروتين داخل خزان البروتين الموجود مباشرة على غشاء غسيل الكلى.يعتمد حجم قطرة البروتين على تصميم الرقاقة التي يتم استخدامها. وعلى وجه التحديد، فإنه يعتمد على حجم الدعامة المركزية، ويمكن أن يكون 0.1 أو 0.3 ميكرولتر. تطبيق بعناية طبقة رقيقة من الشحوم السيليكون فراغ عالية في جميع أنحاء خزان البروتين.قطع قطعة صغيرة من PMMA ووضعها بلطف فوق طبقة رقيقة من الشحوم السيليكون. قطع قطعة من الشريط Kapton، كبيرة بما يكفي لتغطية قطعة PMMA وضعت فوق خزان البروتين والعصا على رقاقة NOA حول جميع الحواف. يتم تغليف عينة البروتين داخل الخزان ويمكن استخدام الشريحة لتجارب التبلور.أولا إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر من الحل تبلور عن طريق خلط وحدات التخزين المناسبة من العازلة والحلول السريعة. حقن محلول التبلور في نقطة من رقاقة غسيل الكلى من خلال الموصلات السائلة، إما يدويا مع الحقنة أو مع نظام الضغط الآلي مدفوعة. بمجرد تعبئة القناة السائلة بمحلول التبلور ولا يوجد هواء محصور داخلها ، فقم بإغلاق منافذ مدخل ومنفذ الشريحة بشريط Parafilm.ماصة الحجم المناسب من محلول البروتين داخل خزان البروتين وتغليف عينة البروتين كما سبق وصفه. يمكن تصور نمو بلور البروتين وتسجيله بكاميرا رقمية. لتصنيع رقائق غسيل الكلى، اخترنا مواد شفافة بصريا وغير خاملة بيولوجيا، مما يدل على التوافق عالية لتجارب الحيود الأشعة السينية في الموقع.وقد تم تقييم الضوضاء الخلفية الناتجة عن المواد التي تتألف من مقصورة البروتين من رقاقة، والتي هي في المسار المباشر لشعاع الأشعة السينية. تتكون مقصورة البروتين من غشاء غسيل الكلى السليلوزي المجدد ، وشريط Kapton ، وطبقتين PMMA ، واحدة تستخدم كركيزة للرقائق الدقيقة ، وواحدة تستخدم لتغليف عينة البروتين. في هذه الصورة ، يتضح من الضوضاء الخلفية الناتجة عن الشريط Kapton ، وغشاء غسيل الكلى السليلوز المجددة ، وطبقة PMMA ، وتجميعها.على الرغم من أن PHOTOCURABLE الراتنج NOA يضم الجسم الرئيسي للرقائق الدقيقة، لا يتم تضمينها في هذه القياسات لأنها ليست جزءا من غرفة البروتين. يمكن رؤية الحلقات المنتشرة المنسوبة إلى تفاعلات الأشعة السينية مع المواد لشريط Kapton بدقة أقل من أربعة angstroms ، وPMMA بين أربعة إلى ثمانية angstroms ، وغشاء غسيل الكلى بين أربعة إلى خمسة angstroms. ويلاحظ أساسا الضوضاء الخلفية الإجمالية الناتجة عن رقاقة في القرار أقل من ستة angstrom، مما يدل على أن علاج بيانات الحيود عالية الدقة lysozyme لا يتأثر.تم تركيب الرقائق الدقيقة أمام شعاع الأشعة السينية مع دعم مطبوع ثلاثي الأبعاد قمنا بتصميمه لتجارب الحيود بالأشعة السينية في الموقع ، ويمكن أن يحمل ما يصل إلى ثلاث رقائق في وقت واحد. وأجريت تجارب من أجل تقييم كفاءة الرقائق الدقيقة لبلورة البروتينات القابلة للذوبان في النموذج باستخدام طريقة التحليل الدقيق. نمت بلورات lysozyme في 293 كلفن في حالتين مختلفتين.احتوت حالة التبلور الأولى على 1.5 كلوريد صوديوم مولار، و0.1 خلات صوديوم مولار. أما حالة التبلور الثانية فقد احتوت على كلوريد صوديوم مولار واحد، و0.1 خلات صوديوم مولار، و30٪ بولي إيثيلين جليكول 400، وتم اختيارها لإظهار توافق الرقائق الدقيقة وطريقة غسيل الكلى الدقيق، مع مثبطات ذات وزن جزيئي مرتفع وحلول لزجة. وقد أجريت تجارب التبلور في ظل ظروف ثابتة.وبمجرد أن نمت بلورات lysozyme على رقاقة، كانت تستخدم لتجارب الحيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة. تم تركيب الرقائق الدقيقة عند خط الحزمة بمساعدة الدعم المطبوع ثلاثي الأبعاد وتم جمع مجموعات بيانات حيود الأشعة السينية الكاملة من بلورتين lysozyme. بعد معالجة بيانات حيود الأشعة السينية، تم الحصول على خريطة كثافة الإلكترون لبلورة lysozyme واحدة بدقة 1.95 angstrom، كما هو موضح في الشكل A.Figure B تظهر خريطة كثافة الإلكترون التي تم الحصول عليها بدقة 1.85 angstroms.بعد دمج مجموعتي بيانات تم الحصول عليهما من بلورتين مختلفتين من الليسوزيم، تظهر كل من خرائط الكثافة الكهربائية معلومات هيكلية مفصلة يمكن الحصول عليها من خلال تجارب حيود الأشعة السينية الموقعية التي أجريت مباشرة على رقائق غسيل الكلى في درجة حرارة الغرفة، من بلورات بروتين واحدة أو متعددة. لقد أثبتنا إجراء التصنيع لأجهزة microfluidic المصممة لبلورة البروتين على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى الدقيق، وفي الموقع تجارب الحيود الأشعة السينية في درجة حرارة الغرفة. استخدمنا مواد التصنيع مع شفافية عالية الأشعة السينية، متوافقة مع البلورات البروتين في الموقع.جمع البيانات الحيود هو الآلي مع استخدام دعم المطبوعة 3D للرقائق، التي يمكن تركيبها مباشرة في خطوط شعاع البلورات الجزيئية الكلية. تنبع براعة هذه الشريحة الدقيقة من استخدام غسيل الكلى الدقيق للتحكم بشكل عكسي في ظروف التبلور ورسم مخططات مرحلة الخريطة باستخدام حجم البروتين الصغير. النماذج الأولية للجهاز واضحة ، مما يتيح تصنيع ما يصل إلى 30 رقاقة في يوم واحد في غرفة نظيفة ، مع مواد غير مكلفة نسبيا.ونتوقع أن هذه الميزات من رقائق يمكن استخدامها لدراسات الأشعة السينية المسلسل البلورات من أهداف البروتين أكثر تحديا.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

إعداد خلايا منتسب للتصوير الإسفار الأشعة السينية من قبل التثبيت الكيميائية

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

ديناميكية الكهروكيميائية قياس كلوريد الأيونات

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

في الموقع توصيف المطفأ البروتينات في المياه التي SALVI وTOF-سيمز

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

حيود الأشعة السينية مسحوق في علوم الحفظ: نحو روتيني البنية البلورية تحديد التآكل المنتجات على كائنات التراث الفن

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

التحديد الكمي للبيانات Fluorescence الأشعة السينية باستخدام خرائط

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

قياسات للارتباطات الإلكترونية البعيدة المدى خلال تجارب حيود Femtosecond على نانوكريستالس بوكمينستيرفوليريني

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

رقائق موائع جزيئية لنثر الخفيفة الديناميكية في الموقع حيود الأشعة السينية كريستال و في الموقع لعلم البلورات المسلسل

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

امتصاص المعادن الأساسية في البكتيريا سلبية الغرام: الأشعة السينية الأسفار، النظائر المشعة، والخلية تجزئة

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

الكشف عن عنصري المراعية لمادة الكيمياء في البطاريات عن طريق التحليل الطيفي امتصاص الأشعة السينية اللينة، وتبعثر الأشعة السينية غير مرن رنانة

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

تحضير العينات البيولوجية للانتواع في درجة حرارة التبريد باستخدام التحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...