Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

MBS anerkender støtten fra MI / CNRS i henhold til kontrakten Instrumentation på grænserne 2014-2015. NJ anerkender CEA's International Ph.d.-forskningsprogram (Irtelis) for ph.d.-stipendiet. MBS og SJ anerkender finansieringen fra EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 722687. MBS, SJ, og NJ takke LIPhy (UGA) for det rene rum etablering for mikrofabrikation eksperimenter. IBS anerkender integration i Grenobles tværfaglige forskningsinstitut (IRIG, CEA).

Forfatterne har intet at afsløre.

En mikrofluidisk enhed er udviklet til on-chip protein krystallisering med mikrodialyse metode og in situ X-ray diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur. NOA 81-chips, der integrerer RC-dialysemembraner i enhver MWCO for at bruge mikrodialyse til on-chip proteinkrystallisering, kan fremstilles. Der blev anvendt fremstillingsmaterialer med en relativt høj røntgengennemsigtighed, hvilket gjorde chipsene kompatible for in situ-proteinkrystallografi. De fremstillingsmaterialer, der udgør rummet til proteinkrystallisering af enheden (PMMA, Kapton, RC-dialysemembran) blev evalueret for at generere lav baggrundsstøj. Specifikt observeres baggrundsstøjen fra dialysechippen hovedsageligt ved lav opløsning (> 6 Å) og påvirker ikke behandlingen af diffraktionsdata med høj opløsning af de store lysozymkrystaller, der kræves til bestemmelse af proteinstruktur. Automatiseringen af dataindsamlingen forstærkes ved hjælp af en 3D-printet understøttelse, der kan monteres direkte i makromolekylære krystallografistrålelinjer og bære op til tre mikrochips samtidigt. På denne måde undgås manuel høst og manipulation af de skrøbelige proteinkrystaller. Desuden finder dataindsamlingen sted ved stuetemperatur og undgår behovet for kryoprotektion, som kan relateres til kropsbygningsændringer fra den oprindelige proteinstruktur2,3.
Brugen af mikrodialyse som en metode til at dyrke krystaller på chippen gør det muligt at nøjagtigt overvåge og kontrollere krystalliseringsprocessen. Som diskuteret i indledningen er de fleste af de konventionelle proteinkrystalliseringsmetoder blevet implementeret ved hjælp af mikrofluidiske enheder11,14. Fordelene ved dialyse for proteinkrystallisering var imidlertid endnu ikke blevet udnyttet fuldt ud på mikroskala. Mikrodialyse på chippen giver mulighed for at studere fasediagrammer og udføre screening og optimering af krystalliseringsforhold med samme proteinprøve19. For de prototyper, der præsenteres i dette arbejde, er proteinforbruget pr. chip begrænset til 0,1 eller 0,3 μL. Baseret på det eksperimentelle arbejde indtil videre stammer de mest kritiske trin i protokollen ikke fra chipsenes fremstillingsprocedure, men fra krystalliseringsprocessen. Fabrikationsprotokollen indeholder mange trin, men den er ligetil og gør det muligt at fremstille adskillige enheder (20 til 30 chips) på en enkelt dag i det rene rum med relativt billige materialer. Men on-chip krystallisering af proteiner kan være en delikat procedure på grund af den iboende stokastiske karakter af kernedannelse og krystalvækst, især i mikroskalaen. Et casestudie er blevet beskrevet, hvor veletablerede forhold blev brugt til krystallisering af lysozym, der gav robuste, veldefinerede krystaller egnet til in situ X-ray diffraktion dataindsamling. Ikke desto mindre kan der opstå vanskeligheder ved brug af mere udfordrende proteinmål, såsom membranproteiner, hvor krystalliseringsmediet er meget mere kompliceret, fasediagrammer er ikke kendt, og velarbejdende krystalliseringsforhold er endnu ikke veletablerede. Dialysechippen giver mulighed for at overgå disse vanskeligheder og undersøgelsesfasediagrammer på chippen uden at bortskaffe den værdifulde og ofte dyre proteinprøve ved blot at udskifte krystalliseringsopløsningen inden for den mikrofluidiske kanal.
Alsidigheden af de mikrofluidiske enheder stammer fra at udnytte mikrodialyse til on-chip protein krystallisering for at reversibilt kontrollere krystalliseringsforhold og kortlægge koncentration og temperatur varierede fasediagrammer ved hjælp af lavt proteinvolumen. Desuden er enheden kompatibel med in situ X-ray diffraktionseksperimenter, og prototyping af enhederne er billig og hurtig. Talrige, isomorfe krystaller af opløselige og membranproteiner (under forberedelse) kan dyrkes på chippen, og det forventes, at alle disse funktioner kan bruges til serielle røntgenkrystallografiundersøgelser af udfordrende proteinmål på synkrotron- og XFEL-faciliteter. Endelig er det at udføre time-resolved-studier på chippen og in situ en fremtidig mulighed, der kan være af væsentlig interesse for det krystallografiske samfund. Derfor vil fremtidige bestræbelser ved at dyrke krystaller på dialysechippen og indføre reagenserne i den mikrofluidiske kanal, enten manuelt (ved hjælp af en sprøjte) eller automatisk (med et trykkontrolvæskesystem eller en sprøjtepumpe), fokusere på at bevise, at de mikrofluidiske chips med succes kan bruges til at udløse tidsløste eksperimenter på synkrotronstrålelinjer.

At belyse den tredimensionelle (3D) struktur af biologiske makromolekyler er en uophørlig forfølgelse i strukturel biologi, hvor røntgenkrystallografi fortsat er den vigtigste undersøgelsesteknik. Den anvendes til at optrævle de strukturelle detaljer i komplekse makromolekyler, såsom proteiner, og har til formål at lette forståelsen af deres virkningsmekanismer og deres involvering i forskellige biologiske funktioner. Kraftige røntgenkilder ved synkrotroner og røntgenfri elektronlasere (XFELs) giver alle de værktøjer, der kræves for en dybere indsigt i proteinernes struktur ved næsten atomopløsning. På trods af de fordele, der følger med brugen af røntgenstråler til strukturelle undersøgelser, er der iboende begrænsninger for røntgenstråling og selve krystalliseringsprocessen. Strålingsskader fremkaldt af høj røntgenflux og lange eksponeringstider for proteinkrystallen foran røntgenstrålen er restriktive parametre, som krystallografer skal overgå ved hjælp af kryogen køling1. Det kan dog være besværligt at finde de optimale kryotypeforhold, da kropsbygningsændringer fra den oprindelige proteinstruktur eller artefakter kan skjules2,3. Desuden viser nylige undersøgelser, at udførelse af diffraktionseksperimenter ved stuetemperatur fører til lavere specifikke strålingsskader4. En anden flaskehals i strukturel biologi er erhvervelsen af godt spredende krystaller med en tilstrækkelig størrelse5. Små krystaller er lettere at producere, især i tilfælde af membranproteiner, men er mere modtagelige for strålingsskader selv under kryocoolingforhold, fordi en høj strålingsdosis skal rettes i et mindre volumen sammenlignet med tilfældet med større proteinkrystaller6. Den nye tilgang til seriel krystallografi7,8 ved synkrotroner og XFELs kan omgå fastholdelsesbegrænsende af strålingsskader og samtidig udnytte mindre krystaller (200 nm til 2 μm)7 ved at fusionere datasæt fra flere, isomorfe og tilfældigt orienterede proteinkrystaller og drage fordel af de tilknyttede teknologiske fremskridt såsom femtosekundsimpulser, kortere eksponeringstider og mikrofokuserede røntgenstråler5,7,9,10.
Mikrofluidisk teknologi er værdifuld for røntgenkrystallografi og udviser mangfoldige fordele for krystalliseringen af biologiske makromolekyler og deres strukturelle undersøgelse. Udførelse af krystalliseringseksperimenter i mikrofluidiske enheder kræver små mængder proteinprøve, hvilket begrænser produktionsomkostningerne for disse højt værdsatte biobiobiomolekyler og letter screening og optimering af mange krystalliseringsbetingelser. Desuden muliggør det iboende store forhold mellem overflade og volumen ved den mikrofluidiske skala og diffusionsbegrænsede transportfænomener fin kontrol over strømme og temperatur- eller koncentrationsgradienter11,12,13,14, hvilket gør mikrofluidiske anordninger egnede til dyrkning af krystaller i ensartet størrelse og udforskning af fasediagrammer15,16,17,18,19. Desuden udviser mikrofluidiske værktøjer et særligt potentiale til at tackle en anden forhindring i proteinkrystallografi, som er prøvelevering, og nødvendigheden af at håndtere og høste proteinkrystaller, før de anvendes til røntgendiffraktionseksperimenter. Metoden til on-chip og in situ røntgenkrystallografi eliminerer krystalmanipulationen og den potentielle forringelse af krystalkvaliteten inden dataindsamlingen. En bred vifte af mikrofluidic chips kompatibel for in situ X-ray protein krystallografi er blevet designet, udviklet og testet af mange forskergrupper konfrontere de relaterede begrænsninger som følge af arten af mikrofabrikation materialer og deres interaktioner med X-stråler14,19,20,21,22,23. Fremstillingsmaterialerne skal være optisk gennemsigtige, biologisk inerte og udvise stor gennemsigtighed over for røntgenstråling og et optimalt signal-til-støj-forhold under dataindsamlingen.
De fleste af de krystalliseringsmetoder, der anvendes i konventionel proteinkrystallografi24,25 er også blevet implementeret på den mikrofluidiske skala11,14 for på chipkrystallisering og in situ X-ray diffraktionsanalyse. Simpelt, hybrid- eller flerlags mikrofluidisk apparat, der indeholder dampdiffusion26, fordampning27, gratis grænsefladediffusion (FID)28, mikrobatch26eller endda såning29 er blevet brugt til at krystallisere opløselige og membranproteiner. Høj gennemløbsscreening og optimering af krystalliseringsforhold kan opnås30,31 i velbaserede32, dråbebaserede33eller ventilaktiverede34 enheder. På stedet X-ray diffraktionseksperimenter af udfordrende proteinmål ved stuetemperatur er blevet udført i mikrochips fremstillet af forskellige materialer såsom PDMS (polydimethylsiloxan), COC (cyklisk olefin copolymer), PMMA (poly(methyl methacrylat))21,22,26,28,29, grafenfilm23, Kapton35, epoxylim6eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 og materialernes gennemsigtighed i røntgenstrålingen og deres bidrag til baggrundsstøj er blevet evalueret. Desuden er mikrochips designet til at parre in situ og de serielle dataindsamlingsstrategier i et enkelt værktøj til røntgenproteinkrystallografieksperimenter ved synkrotronkilder23,35,36 og XFELs7.
Rumtemperatur in situ dataindsamling er også blevet implementeret i forskellige leveringsmetoder og enheder. For eksempel brugte Nogly et al.54 en lipidisk kubikfase (LCP) injektor til at studere strukturen af den lysdrevne fotonpumpe bacteriorhodopsin (bR) ved seriel femtosekund krystallografi (SFX) ved hjælp af en XFEL-kilde. Krystalstrukturen i bR blev løst til 2,3 Å-opløsning, hvilket viser kompatibiliteten af en LCP-injektor med tidsløst seriel femtosekund krystallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 designede et flerkrystalgitter med høj densitet, fremstillet af en 100 eller 200 μm tyk polycarbonatplast med laserskårne huller i forskellige størrelser. En yderligere 5 μm tyk polycarbonatfilm kan fastgøres til den ene side af gitteret, når enheden bruges til siddende eller hængende drop krystalliseringseksperimenter. Dette net med høj densitet kan bruges på flere måder, da krystaller kan indlæses direkte på enhedens porte, eller krystaller kan dyrkes på enheden ved dampspredning eller LCP-metoden. Desuden kan nettet justeres i en standard magnetisk base og bruges til in situ røntgen dataindsamling ved kryogene eller stuetemperatur betingelser. For nylig udviklede Feiler et al.56 en prøveholder til makromolekylær in situ røntgenkrystallografi ved kryogen og omgivelsestemperatur med minimal baggrundsstøjbidrag. Specifikt består holderen af en plaststøtte, en gennemsigtig COC-folie og en mikroporous struktureret polyimidfolie. Det var designet til at erstatte de almindeligt anvendte dækslet dias til opsætning af krystallisering dråber, samtidig med at in-place manipulation såsom ligand iblødsætning, komplekse dannelse, og kryogene beskyttelse uden at åbne krystallisering drop eller manuelt håndtering af krystaller. Desuden kan prøveholderen fjernes fra krystalliseringspladen og placeres på en magnetisk base til in situ-dataindsamling ved standard goniometerbaserede strålelinjer. Til dataindsamling ved omgivelsestemperatur fjernes COC-folien før forsøget, og kun den 21 μm tykke polyimidfolie bidrager til baggrundsspredning, som i dette tilfælde er minimal. Disse eksempler udgør kun en lille brøkdel af den igangværende forskning og de mange alsidige mikrochips udviklet til røntgenprotein krystallografi.
Dialyseproteinkrystalliseringsmetoden er imidlertid ikke i vid udstrækning blevet indarbejdet i mikrofluidics. Dialyse er en diffusionsbaseret metode, der sigter mod ekvilibrering af præcipitantkoncentrationen gennem en halvgennemtrængelig membran for at nærme sig den nominelle koncentration for proteinkrystallisering og muliggør præcis og reversibel kontrol over krystalliseringsbetingelserne24. Den molekylære vægtskæring (MWCO) af den semi-gennemtrængelige dialysemembran kan vælges afhængigt af makromolekylets og præcipitanternes molekylvægt for at muliggøre spredning af små afgrundsmolekyler, samtidig med at makromolekylet bevares af interesse. På grund af dialyseprocessens reversibilitet kan den bruges i kombination med temperaturkontrol til at afkoble og optimere kerne- og krystalvækst uafhængigt37 til at undersøge fasediagrammer ved at ændre præcipitantkoncentrationen, mens du bruger den samme proteinprøve. Integreringen af membraner i mikrofluidics gennemgås af de Jong et al.38, og casestudierne i biologi, der implanterer dialyse i mikrochips, kan hovedsagelig nævnes i prøvepræparater, koncentrations- eller filtreringsapplikationer39,40,41,42 eller cellerelaterede undersøgelser43,44. Pervaporation gennem PDMS blev brugt af Shim et al.37 til at studere nukleation og vækst af xylanase under forskellige forhold. Vand gennemtrænges gennem den 15 μm tykke PDMS-membran ind i proteinbeholderen på den mikrofluidiske enhed og ændrer efterfølgende protein- og præcipitantkoncentrationen.
Protokollen udviklet af Junius et al.19,45 til fremstilling af en mikrofluidic chip kompatibel for både on-chip protein krystallisering via mikrodialyse og in situ X-ray diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur præsenteres. Protokollen for enheden fabrikation er direkte inspireret af det banebrydende arbejde udført af Studer og kolleger12,46 for mikro-mønstrede klistermærker af foto-helbredes thiolene-baserede harpiks NOA 81 indlejring kommercielt tilgængelige membraner, ved hjælp af bløde aftryk litografi. En innovativ ændring af metoden resulterede i mikrochips, der gjorde det muligt at anvende mikroanalyse til nøjagtigt at overvåge og kontrollere forsøgsparametrene for on-chip vækst af proteinkrystaller og samtidig udnytte fordelene ved mikrofluidics, såsom reduceret forbrug af proteinprøver pr. forsøg (<1 μL). I et tidligere værk blev de dialyseprincipper, der blev anvendt på et makroskalasystem (typisk volumen >20 μL) til screening og optimering af krystalliseringsforhold ved kortlægning af temperatur-præcipitantkoncentrationsfasediagrammer, påvist47. I dette arbejde beskrives en protokol til fremstilling af dialysemikrochips, der indeholder regenererede cellulose (RC) dialysemembraner af forskellige MWCO for at udføre krystalliseringsanalyseanalyser på chippen og in situ X-ray diffraktion dataindsamling. De materialer, der består af mikrochips er blevet evalueret for deres gennemsigtighed tilX-stråler 19 og enhederne kan indstilles direkte foran røntgenstrålen for stuetemperatur in situ diffraktion eksperimenter, bortset fra manuel håndtering og minimere nedbrydningen af skrøbelige proteinkrystaller. I et casestudie blev høneæghvide lysozymkrystaller dyrket på chippen via mikrodialyse, der genererede en ensartet størrelse befolkning. Mikrochippen blev derefter monteret foran røntgenstrålen med en 3D-printet understøttelse19, og komplette in situ diffraktionsdatasæt blev indsamlet ved stuetemperatur fra flere, isomorfe krystaller, hvilket demonstrerede det store potentiale og relevansen af chipsene til synkrotron serielle krystallografiundersøgelser af udfordrende makromolekylære mål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Denne protokol beskriver fremstillingen af reproducerbare og billige mikrofluidiske anordninger, der dækker hele rørledningen til krystallisering af proteiner på chippen med dialysemetoden og tillader in situ enkeltkrystal- eller serielle krystallografieksperimenter ved stuetemperatur. Protokollen beskriver mikrochips fabrikationsprocessen, manipulationen af on-chip krystalliseringsforsøgene og behandlingen af in situ indsamlede røntgendiffraktionsdata til strukturel belysning af proteinprøven. Hovedtræk ved denne mikrofabrikationsprocedure ligger i integrationen af en kommercielt tilgængelig, semipermeable regenereret cellulosedialysemembran mellem to lag af chippen. Den molekylære vægtskæring af den indlejrede membran varierer afhængigt af makromolekylets og præcipitanternes molekylvægt. Enheden udnytter fordelene ved mikrofluidisk teknologi, såsom brugen af små mængder prøver (<1 μL) og finjustering over transportfænomener. Chippen koblede dem med dialysemetoden, hvilket giver præcis og reversibel kontrol over krystalliseringsprocessen og kan bruges til at undersøge fasediagrammer af proteiner på mikroliterskalaen. Enheden er mønstret ved hjælp af en fotocurable thiolene-baseret harpiks med blød aftryk litografi på et optisk gennemsigtigt polymer substrat. Desuden blev baggrundsspredningen af de materialer, der udgør mikrochips og genererer baggrundsstøj, evalueret, hvilket gjorde chippen kompatibel for in situ X-ray diffraktionseksperimenter. Når proteinkrystallerne er vokset på chippen op til en passende størrelse og befolkning ensartethed, kan mikrochips monteres direkte foran røntgenstrålen ved hjælp af en 3D-printet holder. Denne tilgang tager fat på de udfordringer, der stiger fra brugen af kryoprotectiva og manuel høst i konventionelle proteinkrystallografieksperimenter gennem en nem og billig måde. Komplet X-ray diffraktion datasæt fra flere, isomorfe lysozym krystaller dyrket on-chip blev indsamlet ved stuetemperatur for struktur bestemmelse.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Dette papir beskriver fabrikationsprotokollen for mikrofluidiske chips udviklet til on-chip protein krystallisering med dialysemetoden og in situ X-ray diffraktionseksperimenter. Mikrofabrikationsprocessen gør det muligt at integrere en semipermeable regenereret cellulosedialysemembran med enhver molekylær vægtafskæring mellem to lag af chippen.

Krystallisering af proteiner på chip af mikrodialyse til In Situ X-ray Diffraktion Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Dette papir beskriver fabrikationsprotokollen for mikrofluidiske chips udviklet til on-chip protein krystallisering med dialysemetoden og in situ X-ray diffraktionseksperimenter ved stuetemperatur. En af de største fordele ved disse mikrochips er valget af fabrikationsmaterialer, hvilket gør chipsene kompatible til in situ X-ray diffraktion dataindsamling ved stuetemperatur. On-chip krystalliseringseksperimenter kræver små mængder proteinprøven, hvilket reducerer de samlede omkostninger ved at arbejde med disse makromolekyler af høj værdi.On-chip krystallisering eliminerer også den manuelle høst af de skrøbelige proteinkrystaller, der ofte anvendes i kombination med kryokøling under konventionelle krystallografiforsøg. Desuden bruger vores mikrochips mikrodialyse til proteinkrystallisering, som er en diffusionsbaseret metode, der sigter mod at afbalancere præcipitantkoncentrationen gennem en semipermeabel membran for at nærme sig den cromulentkoncentration til proteinkrystallisering og muliggør præcis og reversibel kontrol over krystalliseringsbetingelserne. Mikrodialyse kombineret med temperaturregulering kan bruges til at afkoble kerner fra krystalvækst til undersøgelse af fasediagrammer ved at ændre præcipitantkoncentrationen, mens der anvendes samme proteinprøve.Forbered først 50 gram PDMS silikonebase, og det er hærdningsmiddel i et 10 til et masseforhold. Bland de to ingredienser i et bægerglas med en spatel. Efter blanding skal blandingen placeres i et vakuumkammer for at fjerne alle luftbobler.Sæt 25 gram af det forblandet PDMS i den første SU8 for at mestre, der indeholder mønstrene i den mikrofluidiske kanal og søjlerne, op til en højde på ca. fem millimeter. Hæld derefter de resterende 25 gram PDMS i den anden SU8-mester, der kun indeholder søjlernes mønstre. Cure de to PDMS lag i en ovn på 338 kelvin i en time.Skær de hærdede PDMS-lag omkring SU8-mestrenes mønstre med en skalpel, og skræl forsigtigt PDMS-formene af silikonemestrene. Placer PDMS-formen med både kanaler og søjler på en stiv mikroskopglasrutsjebane med mønstrene opad. Skær et lille stykke regenereret cellulosedialysemembran for at dække den centrale søjle i PDMS-formen, som er designet til at være proteinkammeret.Dialysemembranens molekylære vægtafskæring vælges i overensstemmelse hermed til proteinprøvens molekylvægt og præcipitanterne i krystalliseringsopløsningen. Derefter adskilles forsigtigt det tørre stykke af den regenererede cellulosedialysemembran. Skær et lille stykke af den adskilte dialysemembran.Størrelsen af dette stykke membran afhænger af chippens design. Og specifikt afhænger det af dimensionerne af den centrale søjle. Aflejr delen af dialysemembranen på den centrale søjle i PDMS-formen, som understøttes på glasrutsjebanen, med sin søjle og kanaler opad.Placer derefter den anden PDMS-form med kun søjlerne nedad på toppen af PDMS-formen, der allerede understøttes på glasrutschebanen. Juster alle søjlerne i de to PDMS forme. Stykket af den regenererede cellulose dialysemembran er klemt inde mellem de to centrale søjler i PDMS forme.Dette trin i fremstillingsproceduren kan udføres under et optisk mikroskop eller blot ved visuelt at inspicere omhyggeligt tilpasningen af alle søjlerne. Placer samlingen i et vakuumkammer og udtørre i 30 minutter for at fjerne de fangede luftbobler i PDMS-formene og for at forbedre indsættelsen af den fotocurable NOA-harpiks, der vil blive beskrevet i næste trin i denne protokol. Fjern samlingen fra vakuumkammeret og fyld det tomme rum mellem de to PDMS-forme med den fotocurable thiolinbaserede harpiks, NOA 81, ved kapillær imbibition.Påfør harpiksen på tre af de fire sider af samlingen. Placer samlingen i en cross-linker og helbrede NOA harpiks ved at udsætte for UV-lys i otte sekunder, ved hjælp af en kollimeret UV-lampe på 35 milliwatt per kvadratcentimeter. Skær en 175 mikrometer tyk PMMA stykke i standard dimensioner af et mikroskop glas dias, og skræl plast beskyttelse fra hver side af PMMA stykke.Når den første UV-eksponering er afsluttet, skal du fjerne den øvre PDMS-form med en delvist krydsbundet NOA-harpiks, der sidder fast på den fra den nederste PDMS-form og glasrutschebanen. Tryk forsigtigt på samlingen af den øverste PDMS-form og den delvist hærdede NOA-harpiks på PMMA-stykket. Placer den nye samling i cross-linker og helbrede igen NOA harpiks ved udsættelse for UV-lys i 60 sekunder.Fjern forsigtigt den øverste PDMS skimmel. Dialysechip lavet af den fuldt cross-link NOA harpiks indlejring en regenereret cellulose dialyse membran og støttes på en PMMA stykke er klar. Bond kommercielt tilgængelige stik på indløbs- og udløbspunkterne på den mikrofluidiske kanal med hurtig epoxylim.Til væskehåndtering skal du vælge diameteren af PTFE-rørene baseret på stikkenes størrelse. Rørene bruges til indførelse af krystalliseringsopløsningen inden for dialysechippens fluidiske kanal. Pipette manuelt en dråbe af proteinprøven inde i proteinbeholderen placeret lige på dialysemembranen.Proteindråbens volumen afhænger af designet af den mikrochip, der bruges. Og specifikt afhænger det af volumenet af den centrale søjle, og det kan være 0,1 eller 0,3 mikroliter. Påfør forsigtigt et tyndt lag høj vakuum silikonefedt rundt omkring i proteinbeholderen.Skær et lille stykke PMMA og læg det forsigtigt over det tynde lag af silikonefedtet. Skær et stykke Kapton tape, stor nok til at dække PMMA stykke placeret over protein reservoiret og til at holde på NOA chip omkring alle kanter. Proteinprøven indkapsles i reservoiret, og chippen kan bruges til krystalliseringsforsøg.Forbered først ca. 500 mikroliter af krystalliseringsopløsningen ved at blande passende mængder af bufferen og de begyndende opløsninger. Krystalliseringsopløsningen injiceres i dialysechippens punkt gennem de flydende stik, enten manuelt med sprøjten eller med et automatiseret trykdrevet system. Når den flydende kanal er fyldt med krystalliseringsopløsningen, og der ikke er fanget luft i, forsegles chippens indløbs- og udløbsporte med Parafilm tape.Pipetter den relevante mængde proteinopløsning i proteinbeholderen og indkapsler proteinprøven, som det allerede er beskrevet. Proteinkrystalvæksten kan visualiseres og optages med et digitalt kamera. Til fremstilling af dialysemikrochips har vi valgt optisk gennemsigtige og biologisk inerte materialer, der viser høj kompatibilitet for in situ X-ray diffraktionseksperimenter.Baggrundsstøjen fra de materialer, der består af chippens proteinrum, som ligger i røntgenstrålens direkte vej, er blevet evalueret. Proteinrummet består af den regenererede cellulosedialysemembran, Kapton-båndet og to PMMA-lag, et, der bruges som et substrat af mikrochips, og et, der bruges til indkapsling af proteinprøven. I dette billede, er illustreret baggrundsstøj genereret af Kapton tape, den regenererede cellulose dialyse membran, PMMA lag, og deres samling.Selv om den fotokurerbare harpiks NOA omfatter mikrochips' hoveddel, er den ikke inkluderet i disse målinger, da den ikke er en del af proteinkammeret. Diffuse ringe tilskrives samspillet mellem røntgenstråler med materialerne kan ses for Kapton tape ved opløsningen lavere end fire angstroms, PMMA mellem fire til otte angstroms, og dialysemembranen mellem fire til fem angstroms. Den samlede baggrundsstøj, der genereres af chippen, observeres hovedsageligt ved opløsningen under seks angstrom, hvilket indikerer, at behandlingen af lysozym diffraktionsdata med høj opløsning ikke påvirkes.Mikrochips blev monteret foran røntgenstrålen med en 3D-printet støtte, som vi designede til in situ X-ray diffraktion eksperimenter, og det kan holde op til tre chips samtidigt. Der blev udført forsøg for at evaluere effektiviteten af mikrochips til on-chip krystallisering af modelopløselige proteiner med mikrodialysemetoden. lysozym krystaller blev dyrket på 293 kelvin i to forskellige forhold.Den første krystalliseringstilstand indeholdt 1,5 molarnatriumchlorid og 0,1 molarnatriumacetat. Den anden krystalliseringstilstand indeholdt en molarnatriumchlorid, 0,1 molarnatriumacetat og 30%polyethylenglycol 400, og blev valgt for at vise mikrochipsens og mikrodialysemetodens kompatibilitet med præcipitanter med høj molekylvægt og viskøse opløsninger. Krystalliseringsforsøgene blev udført under statiske forhold.Når lysozym krystaller blev dyrket på mikrochippen, blev de brugt til in situ X-ray diffraktion eksperimenter ved stuetemperatur. Mikrochips blev monteret på strålelinjen ved hjælp af 3D-trykt støtte og komplette X-ray diffraktion datasæt blev indsamlet fra to lysozym krystaller. Efter behandling af røntgendiffraktionsdata blev elektrontæthedskortet for en enkelt lysozymkrystal opnået ved 1,95 angstromopløsning, som vist i figur A.Figur B viser elektrontæthedskortet opnået ved 1,85 angstroms opløsning.Efter sammenlægning af to datasæt fra to forskellige lysozymkrystaller viser begge elektrotæthedskort detaljerede strukturelle oplysninger, der kan opnås ved in situ X-ray diffraktionseksperimenter udført direkte på dialysemikrochips ved stuetemperatur, fra enkelt- eller flere proteinkrystaller. Vi demonstrerede fabrikationsproceduren for mikrofluidiske enheder designet til on-chip protein krystallisering med mikrodialysemetoden og in situ X-ray diffraktionseksperimenter ved stuetemperatur. Vi brugte fabrikationsmaterialer med høj røntgengennemsigtighed, der er kompatible med in situ proteinkrystallografi.Diffraktion dataindsamlingen automatiseres ved hjælp af en 3D-printet understøttelse af chipsene, der kan monteres direkte i makromolekylære krystallografistrålelinjer. Alsidigheden af denne mikrochip stammer fra at bruge mikrodialyse til ærbødigt at kontrollere krystalliseringsforhold og kortlægge fasediagrammer ved hjælp af lille proteinvolumen. Prototyping af enheden er ligetil, hvilket gør det muligt at fremstille op til 30 mikrochips på en enkelt dag i et rent rum med relativt billige materialer.Vi forventer, at disse funktioner i chips kan bruges til seriel røntgen krystallografi undersøgelser af mere udfordrende protein mål.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Dynamisk Elektrokemisk Måling af chloridioner

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In situ karakterisering af Hydratformerne Proteiner i vand ved Salvi og ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray af pulver i Conservation Science: Mod Rutinemæssig Krystalstrukturbestemmelse af korrosionsprodukter på Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantificere X-Ray fluorescens Data ved hjælp af kort

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Målinger af langtrækkende elektroniske korrelationer under femtosekund diffraktion eksperimenter udført på nanokrystaller af Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrofluid Chips for In Situ Crystal røntgen diffraktion og In Situ dynamisk lysspredning for serielle krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Væsentlige Metal udbredelse i Gram-negative bakterier: X-ray fluorescens, radioisotoper, og celle fraktionering

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-følsomme påvisning af kemi i batterier gennem bløde X-ray Absorption spektroskopi og Resonant uelastisk X-ray spredning

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Biologiske prøver Forberedelse til speciering ved kryogen temperatur ved hjælp af røntgenabsorptionsspektroskopi med høj opløsning

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...