Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

MBS erkent de steun van de MI / CNRS in het kader van het contract Instrumentation at the limits 2014-2015. NJ erkent CEA's International Doctoral Research Program (Irtelis) voor de PhD Fellowship. MBS en SJ erkennen de financiering uit het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nummer 722687. MBS, SJ en NJ bedanken LIPhy (UGA) voor de cleanroom vestiging voor microfabrication experimenten. IBS erkent integratie in het Interdisciplinair Onderzoeksinstituut van Grenoble (IRIG, CEA).

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er is een microfluïdisch apparaat ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de microdialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. NOA 81-chips die RC-dialysemembranen van elke MWCO integreren om microdialyse te gebruiken voor on-chip eiwitkristallisatie, kunnen worden vervaardigd. Fabricagematerialen met een relatief hoge röntgentransparantie werden gebruikt, waardoor de chips compatibel werden voor in situ eiwitkristallografie. De fabricagematerialen die het compartiment samenstellen voor eiwitkristallisatie van het apparaat (PMMA, Kapton, RC dialysemembraan) werden geëvalueerd om weinig achtergrondgeluid te genereren. Met name het achtergrondgeluid dat door de dialysechip wordt gegenereerd, wordt voornamelijk waargenomen bij een lage resolutie (> 6 Å) en heeft geen invloed op de behandeling van diffractiegegevens met hoge resolutie van de grote lysozymekristallen die nodig zijn voor de bepaling van de eiwitstructuur. De automatisering van de gegevensverzameling wordt versterkt met behulp van een 3D-geprinte ondersteuning die direct in macromoleculaire kristallografiestraallijnen kan worden gemonteerd en tot drie microchips tegelijkertijd kan dragen. Op deze manier wordt handmatig oogsten en manipuleren van de fragiele eiwitkristallen vermeden. Bovendien vindt de gegevensverzameling plaats bij kamertemperatuur, waarbij de noodzaak van cryoprotectie wordt vermeden die verband kan houden met conformatieveranderingen van de inheemse eiwitstructuur2,3.
Het gebruik van microdialyse als methode om kristallen on-chip te laten groeien, maakt het mogelijk om het kristallisatieproces nauwkeurig te monitoren en te controleren. Zoals besproken in de inleiding, zijn de meeste conventionele eiwitkristallisatiemethoden geïmplementeerd met behulp van microfluïdische apparaten11,14. De voordelen van dialyse voor eiwitkristallisatie waren echter nog niet volledig benut op microschaal. On-chip microdialyse biedt de mogelijkheid om fasediagrammen te bestuderen en screening en optimalisatie van kristallisatieomstandigheden uit te voeren met hetzelfde eiwitmonster19. Voor de prototypes die in dit werk worden gepresenteerd, is het eiwitverbruik per chip beperkt tot 0,1 of 0,3 μL. Op basis van het experimentele werk tot nu toe zijn de meest kritieke stappen van het protocol niet afkomstig van de fabricageprocedure van de chips, maar van het kristallisatieproces. Het fabricageprotocol bevat veel stappen, maar het is eenvoudig en maakt de fabricage van tal van apparaten (20 tot 30 chips) op één dag in de cleanroom mogelijk, met relatief goedkope materialen. De on-chip kristallisatie van eiwitten kan echter een delicate procedure zijn vanwege de intrinsieke stochastische aard van nucleatie en kristalgroei, vooral in de microschaal. Er is een case study beschreven, waarbij gevestigde omstandigheden werden gebruikt voor de kristallisatie van lysozym die robuuste, goed gedefinieerde kristallen opleverde die geschikt waren voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens in situ. Niettemin kunnen er problemen ontstaan door het gebruik van uitdagendere eiwitdoelen, zoals membraaneiwitten, waarbij het kristallisatiemedium veel ingewikkelder is, fasediagrammen niet bekend zijn en de goed werkende kristallisatieomstandigheden nog niet goed zijn vastgesteld. De dialysechip biedt de mogelijkheid om deze moeilijkheden te overtreffen en fasediagrammen op de chip te bestuderen, zonder het waardevolle en vaak kostbare eiwitmonster te verwijderen, door alleen de kristallisatieoplossing in het microfluïdische kanaal uit te wisselen.
De veelzijdigheid van de microfluïdische apparaten komt voort uit het gebruik van microdialyse voor on-chip eiwitkristallisatie om kristallisatieomstandigheden omkeerbaar te regelen en concentratie- en temperatuurvariatiefasediagrammen in kaart te brengen met een laag eiwitvolume. Bovendien is het apparaat compatibel met in situ röntgendiffractie-experimenten en is de prototyping van de apparaten goedkoop en snel. Talrijke, isomorfe kristallen van oplosbare en membraaneiwitten (in voorbereiding) kunnen on-chip worden gekweekt en de verwachting is dat al deze kenmerken kunnen worden gebruikt voor seriële röntgenkristallografiestudies van uitdagende eiwitdoelen in synchrotron- en XFEL-faciliteiten. Ten slotte is het uitvoeren van on-chip en in situ time-resolved studies een toekomstige mogelijkheid die van aanzienlijk belang kan zijn voor de kristallografische gemeenschap. Daarom zullen toekomstige inspanningen, door kristallen op de dialysechip te kweken en de reagentia in het microfluïdische kanaal te introduceren, hetzij handmatig (met behulp van een spuit) of automatisch (met een drukregelvloeistofsysteem of een spuitpomp), zich richten op het bewijzen dat de microfluïdische chips met succes kunnen worden gebruikt om tijdgeopgeleerde experimenten op synchrotronstraallijnen te activeren.

Het ophelderen van de driedimensionale (3D) structuur van biologische macromoleculen is een onophoudelijke bezigheid in de structurele biologie waar röntgenkristallografie de belangrijkste onderzoekstechniek blijft. Toegepast voor het ontrafelen van de structurele details van complexe macromoleculen, zoals eiwitten, is het gericht op het vergemakkelijken van het begrip van hun mechanismen van acties en hun betrokkenheid bij verschillende biologische functies. Krachtige röntgenbronnen bij synchrotrons en röntgenvrije elektronenlasers (XFELs) bieden alle hulpmiddelen die nodig zijn voor een dieper inzicht in de structuur van de eiwitten bij bijna atoomresolutie. Ondanks de voordelen die gepaard gaan met het gebruik van röntgenstralen voor structurele studies, zijn er intrinsieke beperkingen aan röntgenstraling en het kristallisatieproces zelf. Stralingsschade veroorzaakt door hoge röntgenflux en lange belichtingstijden van het eiwitkristal voor de röntgenstraal zijn beperkende parameters die kristallografen moeten overtreffen met behulp van cryogene koeling1. Het vinden van de optimale cryocoolingsomstandigheden kan echter bewerkelijk zijn, omdat conformatieveranderingen van de inheemse eiwitstructuur of artefacten kunnen worden verborgen2,3. Bovendien blijkt uit recente studies dat het uitvoeren van diffractie-experimenten bij kamertemperatuur leidt tot lagere specifieke stralingsschade4. Een ander knelpunt in de structurele biologie is de verwerving van goed diffracerende kristallen met een voldoende grootte5. Kleine kristallen zijn gemakkelijker te produceren, vooral in het geval van membraaneiwitten, maar zijn vatbaarder voor stralingsschade, zelfs onder cryocoolingsomstandigheden, omdat een hoge stralingsdosis in een kleiner volume moet worden gericht in vergelijking met het geval van grotere eiwitkristallen6. De nieuwe benadering van seriële kristallografie7,8 bij synchrotrons en XFELs kan de inperkingen van stralingsschade omzeilen en tegelijkertijd kleinere kristallen (200 nm tot 2 μm)7 benutten door datasets uit meerdere, isomorfe en willekeurig georiënteerde eiwitkristallen en profiterend van de bijbehorende technologische vooruitgang zoals femtosecondepulsen, kortere belichtingstijden en micro-gerichte röntgenstralen5,7,9,10.
Microfluïdische technologie is waardevol voor röntgenkristallografie en vertoont talloze voordelen voor de kristallisatie van biologische macromoleculen en hun structureel onderzoek. Het uitvoeren van kristallisatie-experimenten in microfluïdische apparaten vereist kleine hoeveelheden eiwitmonsters, waardoor de productiekosten van deze hooggewaardeerde biomacromoleculen worden beperkt en screening en optimalisatie van talrijke kristallisatieomstandigheden met hoge doorvoer wordt vergemakkelijkt. Bovendien maken de inherente verhouding tussen groot oppervlak en volume op microfluïdische schaal en diffusieberegelde transportverschijnselen een fijne controle mogelijk over stromen en temperatuur - of concentratiegradiënten11,12,13,14, waardoor microfluïdische apparaten geschikt zijn voor het kweken van kristal van uniforme grootte en het verkennen van fasediagrammen15,16,17,18,19. Bovendien vertonen microfluïdische hulpmiddelen een onderscheidend potentieel om een andere hindernis in eiwitkristallografie aan te pakken, namelijk de levering van monsters, en de noodzaak om eiwitkristallen te hanteren en te oogsten voordat ze worden gebruikt voor röntgendiffractie-experimenten. De methode van on-chip en in situ röntgenkristallografie elimineert de kristalmanipulatie en de mogelijke verslechtering van de kristalkwaliteit voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Een breed scala aan microfluïdische chips die compatibel zijn voor in situ röntgeneiwitkristallografie zijn ontworpen, ontwikkeld en getest door vele onderzoeksgroepen die geconfronteerd worden met de gerelateerde beperkingen die voortvloeien uit de aard van de microfabricatiematerialen en hun interacties met röntgenstralen14,19,20,21,22,23. De fabricagematerialen moeten optisch transparant, biologisch inert zijn en een hoge transparantie ten voordele van röntgenstraling en een optimale signaal-ruisverhouding tijdens het verzamelen van gegevens aantonen.
De meeste kristallisatiemethoden die worden toegepast in conventionele eiwitkristallografie24,25 zijn ook geïmplementeerd op microfluïdische schaal11,14 voor op chipkristallisatie en in situ röntgendiffractieanalyse. Eenvoudige, hybride of meerlagige microfluïdische apparaten met dampdiffusie26,verdamping27,vrije interfacediffusie (FID)28,microbaat26of zelfs zaaien29 zijn gebruikt om oplosbare en membraaneiwitten te kristalliseren. Hoge doorvoer screening en optimalisatie van kristallisatie voorwaarden kan worden bereikt30,31 in goed gebaseerde32,druppel-gebaseerde33,of klep-aangedreven34 apparaten. Ter plaatse Röntgendiffractie-experimenten van uitdagende eiwitdoelen bij kamertemperatuur zijn uitgevoerd in microchips die zijn vervaardigd uit verschillende materialen zoals PDMS (polydimethylsiloxaan), COC (cyclisch olefinecopolymeer), PMMA (poly(methylmethacrylaat))21,22,26,28,29, grafeenfilms23, Kapton35, epoxylijm6, of NOA (Norland Optical Adhesive)19 en de transparantie van de materialen voor röntgenstraling en hun bijdrage aan achtergrondgeluid zijn geëvalueerd. Bovendien zijn microchips ontworpen om de strategieën voor het verzamelen van seriële gegevens en de seriële gegevensverzameling te koppelen in één hulpmiddel voor experimenten met röntgeneiwitkristallografie bij synchrotronbronnen23,35,36 en XFELs7.
Kamertemperatuur in situ dataverzameling is ook geïmplementeerd in verschillende leveringsmethoden en apparaten. Nogly et al.54 gebruikten bijvoorbeeld een lipide kubieke fase (LCP) injector om de structuur van de lichtaangedreven fotonpompbacteriorhodopine (bR) te bestuderen door seriële femtoseconde kristallografie (SFX) met behulp van een XFEL-bron. De kristalstructuur van bR werd opgelost tot 2,3 Å-resolutie, wat de compatibiliteit van een LCP-injector met time-resolved seriële femtoseconde kristallografie (TR-SFX) aantoont. Baxter et al.55 ontwierpen een multikristalraster met hoge dichtheid, vervaardigd door een 100 of 200 μm dik polycarbonaatplastic met lasergesneden gaten van verschillende grootte. Een extra 5 μm dikke polycarbonaatfilm kan aan één kant van het rooster worden bevestigd wanneer het apparaat wordt gebruikt voor zit- of ophangdruppelkristallisatie-experimenten. Dit raster met hoge dichtheid kan op meerdere manieren worden gebruikt, omdat kristallen rechtstreeks op de poorten van het apparaat kunnen worden geladen of kristallen op het apparaat kunnen worden gekweekt door dampdiffusie of de LCP-methode. Bovendien kan het raster worden aangepast in een standaard magnetische basis en worden gebruikt voor het verzamelen van röntgengegevens in situ bij cryogene of kamertemperatuuromstandigheden. Meer recent ontwikkelden Feiler et al.56 een monsterhouder voor macromoleculaire in situ röntgenkristallografie bij cryogene en omgevingstemperatuur met minimale bijdrage aan achtergrondgeluid. Concreet bestaat de houder uit een kunststof steun, een transparante COC folie en een microporeuze gestructureerde polyimide folie. Het werd ontworpen om de veelgebruikte afdekglaasjes te vervangen voor het instellen van kristallisatiedruppels, terwijl manipulatie op zijn plaats mogelijk was, zoals ligand soaking, complexe vorming en cryogene bescherming zonder de kristallisatiedruppel te openen of de kristallen handmatig te hanteren. Bovendien kan de monsterhouder van de kristallisatieplaat worden verwijderd en op een magnetische basis worden geplaatst voor het verzamelen van in situ-gegevens bij standaard op goniometer gebaseerde bundellijnen. Voor het verzamelen van omgevingstemperatuurgegevens wordt de COC-folie vóór het experiment verwijderd en draagt alleen de 21 μm dikke polyimidefolie bij aan achtergrondverstrooiing, wat in dit geval minimaal is. Deze voorbeelden vormen slechts een klein deel van het lopende onderzoek en de veelheid aan veelzijdige microchips die zijn ontwikkeld voor röntgeneiwitkristallografie.
De methode voor kristallisatie van dialyse-eiwitten is echter niet op grote schaal opgenomen in microfluïdica. Dialyse is een op diffusie gebaseerde methode die gericht is op het evenwicht van de neerslagconcentratie door een semipermeabel membraan om de nominale concentratie voor eiwitkristallisatie te benaderen en nauwkeurige en omkeerbare controle over de kristallisatieomstandigheden mogelijk maakt24. De Molecular Weight Cut-Off (MWCO) van het semi-permeabele dialysemembraan kan worden gekozen afhankelijk van het molecuulgewicht van het macromolecule en de neerslagmiddelen om de diffusie van kleine neerslagmoleculen mogelijk te maken met behoud van het macromolecule van belang. Vanwege de omkeerbaarheid van het dialyseproces kan het worden gebruikt in combinatie met temperatuurregeling om nucleatie en kristalgroei onafhankelijk te ontkoppelen en te optimaliseren37 voor het onderzoeken van fasediagrammen door de neerslagconcentratie te wijzigen terwijl hetzelfde eiwitmonster wordt gebruikt. De integratie van membranen in microfluïdica wordt beoordeeld door de Jong et al.38 en de casestudy's in de biologie die dialyse in microchips implanteren, kunnen voornamelijk worden vermeld in monstervoorbereidings -, concentratie - of filtratietoepassingen39,40,41,42 of celgerelateerde studies43,44. Pervaporatie via PDMS werd gebruikt door Shim et al.37 om de nucleatie en groei van xylanase in verschillende omstandigheden te bestuderen. Water doordrong door het 15 μm dikke PDMS-membraan in het eiwitreservoir van het microfluïdische apparaat en veranderde vervolgens de eiwit- en neerslagconcentratie.
Het protocol ontwikkeld door Junius et al.19,45 voor de fabricage van een microfluïdische chip compatibel voor zowel on-chip eiwit kristallisatie via microdialyse en in situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur wordt gepresenteerd. Het protocol voor de fabricage van het apparaat is direct geïnspireerd op het baanbrekende werk van Studer en collega's12,46 voor micro-patroonstickers van foto-uithardende hars op basis van thiolene NOA 81 die commercieel verkrijgbare membranen insluit, met behulp van zachte opdruklithografie. Een innovatieve wijziging van de methode resulteerde in microchips die het gebruik van microdialyse mogelijk maakten om de experimentele parameters voor de on-chip groei van eiwitkristallen nauwkeurig te monitoren en te controleren en tegelijkertijd de voordelen van microfluïdica te benutten, zoals verminderde consumptie van eiwitmonsters per experiment (<1 μL). In een eerder werk werden de principes van dialyse toegepast op een macroschaalsysteem (typisch volume >20 μL) voor het screenen en optimaliseren van kristallisatieomstandigheden door temperatuurprecipitante concentratiefasediagrammen in kaart te brengen47. In dit werk wordt een protocol beschreven voor de productie van dialysemicrochips met geregenereerde cellulose (RC) dialysemembranen van verschillende MWCO om kristallisatietests uit te voeren op chip en in situ x-ray diffractiegegevensverzameling. De materialen bestaande uit de microchips zijn beoordeeld op hun transparantie tot röntgenstralen19 en de apparaten kunnen direct voor de röntgenstraal worden ingesteld voor experimenten met kamertemperatuur in situ diffractie, met uitzondering van de handmatige hantering en het minimaliseren van de afbraak van kwetsbare eiwitkristallen. In een case study werden kippeneiwitte lysozymekristallen on-chip gekweekt via microdialyse die een uniforme populatie genereerde. De microchip werd vervolgens voor de röntgenstraal gemonteerd met een 3D-geprinte ondersteuning19 en complete in situ diffractiegegevenssets werden verzameld bij kamertemperatuur uit meerdere, isomorfe kristallen, wat het hoge potentieel en de relevantie van de chips aantoonde voor synchrotron seriële kristallografiestudies van uitdagende macromoleculaire doelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Dit protocol beschrijft de productie van reproduceerbare en goedkope microfluïdische apparaten die de hele pijpleiding bedekken voor het kristalliseren van eiwitten on-chip met de dialysemethode en het toestaan van in situ experimenten met enkelkristal of seriële kristallografie bij kamertemperatuur. Het protocol beschrijft het fabricageproces van de microchips, de manipulatie van de on-chip kristallisatie-experimenten en de behandeling van de ter plaatse verzamelde röntgendiffractiegegevens voor de structurele opheldering van het eiwitmonster. Het belangrijkste kenmerk van deze microfabrication procedure ligt op de integratie van een commercieel beschikbaar, semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan tussen twee lagen van de chip. De moleculaire gewichtsafsnul van het ingebedde membraan varieert afhankelijk van het molecuulgewicht van het macromolecule en de neerslagmiddelen. Het apparaat maakt gebruik van de voordelen van microfluïdische technologie, zoals het gebruik van minieme volumes monsters (<1 μL) en finetuning ten opzichte van transportverschijnselen. De chip koppelde ze aan de dialysemethode, die nauwkeurige en omkeerbare controle over het kristallisatieproces biedt en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van fasediagrammen van eiwitten op de microliterschaal. Het apparaat is gemodelleerd met behulp van een fotocurable hars op basis van thiolene met zachte opdruklithografie op een optisch transparant polymeersubstraat. Bovendien werd de achtergrondverstrooiing van de materialen die de microchips vormen en achtergrondgeluid genereren geëvalueerd, waardoor de chip compatibel werd voor in situ röntgendiffractie-experimenten. Zodra eiwitkristallen op de chip zijn gekweekt tot een voldoende grootte en bevolkingsuniformiteit, kunnen de microchips direct voor de röntgenstraal worden gemonteerd met behulp van een 3D-geprinte houder. Deze aanpak pakt de uitdagingen aan die voortkomen uit het gebruik van cryoprotectanten en handmatige oogst in conventionele eiwitkristallografie-experimenten op een eenvoudige en goedkope manier. Complete röntgendiffractiegegevenssets van meerdere, isomorfe lysozymekristallen die op de chip werden gekweekt, werden verzameld bij kamertemperatuur voor structuurbepaling.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten. Het microfabricatieproces maakt het mogelijk om een semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan te integreren met elke moleculaire gewichtsafsnijd, tussen twee lagen van de chip.

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. Een van de belangrijkste voordelen van deze microchips is de keuze van fabricagematerialen, waardoor de chips compatibel zijn voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens in situ bij kamertemperatuur. De on-chip kristallisatie-experimenten vereisen kleine volumes van het eiwitmonster, waardoor de totale kosten van het werken met deze hoogwaardige macromoleculen worden verminderd.On-chip kristallisatie elimineert ook het handmatig oogsten van de fragiele eiwitkristallen, vaak toegepast in combinatie met cryokoeling tijdens conventionele kristallografie-experimenten. Bovendien gebruiken onze microchips microdialyse voor eiwitkristallisatie, een op diffusie gebaseerde methode die gericht is op het equilibreren van de precipitantconcentratie via een semi-permeabel membraan, om de cromulente concentratie voor eiwitkristallisatie te benaderen en nauwkeurige en omkeerbare controle over de kristallisatieomstandigheden mogelijk te maken. Microdialyse in combinatie met temperatuurregeling kan worden gebruikt om nucleatie van kristalgroei los te koppelen voor het onderzoeken van fasediagrammen, door de precipitantconcentratie te veranderen terwijl hetzelfde eiwitmonster wordt gebruikt.Bereid eerst 50 gram PDMS siliconenbasis en het is uithardingsmiddel in een verhouding van 10 tot 1 massa. Meng de twee ingrediënten in een bekerglas met een spatel. Plaats het mengsel na het mengen in een vacuümkamer om alle luchtbellen te verwijderen.Doe 25 gram van het voorgemengde PDMS in de eerste SU8 om de patronen van het microfluïdische kanaal en de pilaren onder de knie te krijgen, tot een hoogte van ongeveer vijf millimeter. Giet vervolgens de resterende 25 gram van het PDMS in de tweede SU8-master, die alleen de patronen van de pilaren bevat. Hard de twee PDMS-lagen een uur uit in een oven van 338 kelvin.Snijd de uitgeharde PDMS-lagen rond de patronen van de SU8-meesters met een scalpel en pel de PDMS-mallen voorzichtig af van de siliconenmasters. Plaats de PDMS-mal, met zowel de kanalen als de pilaren, op een stijve microscoopglasschuif met de patronen naar boven gericht. Snijd een klein stukje geregenereerd cellulosedialysemembraan om de centrale pijler van de PDMS-mal te bedekken, die is ontworpen om de eiwitkamer te zijn.De moleculaire gewichtsafsnijding van het dialysemembraan wordt dienovereenkomstig gekozen op het molecuulgewicht van het eiwitmonster en de precipitanten van de kristallisatieoplossing. Scheid vervolgens voorzichtig het droge stuk van het geregenereerde cellulosedialysemembraan. Snijd een klein stukje van het gescheiden dialysemembraan.De grootte van dit stuk membraan hangt af van het ontwerp van de chip. En in het bijzonder hangt het af van de afmetingen van de centrale pijler. Deponeer het stuk van het dialysemembraan op de centrale pijler van de PDMS-mal, die wordt ondersteund op de glazen glijbaan, met zijn pilaar en kanalen naar boven gericht.Plaats vervolgens de tweede PDMS-mal met alleen de pilaren naar beneden gericht, bovenop de PDMS-mal die al op de glazen schuif wordt ondersteund. Lijn alle pilaren van de twee PDMS-mallen uit. Het stuk van het geregenereerde cellulosedialysemembraan is ingeklemd tussen de twee centrale pijlers van de PDMS-mallen.Deze stap van de fabricageprocedure kan worden uitgevoerd onder een optische microscoop of gewoon door de uitlijning van alle pilaren visueel zorgvuldig te inspecteren. Plaats de montage in een vacuümkamer en droog gedurende 30 minuten om de gevangen luchtbellen in de PDMS-mallen te verwijderen en om het inbrengen van de fotocurable NOA-hars te verbeteren, die in de volgende stap van dit protocol zal worden beschreven. Verwijder de montage uit de vacuümkamer en vul de lege ruimte tussen de twee PDMS-mallen met de fotocurable hars op basis van thiolin, NOA 81, door capillaire imbibition.Breng de hars aan op drie van de vier zijden van de montage. Plaats de montage in een kruis-linker en hard de NOA-hars uit door acht seconden bloot te stellen aan UV-licht, met behulp van een gebotste UV-lamp van 35 milliwatt per vierkante centimeter. Snijd een 175 micrometer dik PMMA-stuk in de standaardafmetingen van een microscoopglasschuif en verwijder de plastic bescherming van elke kant van het PMMA-stuk.Zodra de eerste UV-belichting is voltooid, verwijdert u de bovenste PDMS-mal met een gedeeltelijk gekruiste NOA-hars erop geplakt uit de onderste PDMS-mal en de glazen glijbaan. Druk zachtjes op de montage van de bovenste PDMS-mal en de gedeeltelijk uitgeharde NOA-hars op het PMMA-stuk. Plaats de nieuwe montage in de cross-linker en hard de NOA-hars opnieuw uit door 60 seconden aan UV-licht te worden blootgesteld.Verwijder voorzichtig de bovenste PDMS-mal. De dialysechip gemaakt van de volledig cross-link NOA-hars die een geregenereerd cellulosedialysemembraan insluit en wordt ondersteund op een PMMA-stuk is klaar. Verlijm in de handel verkrijgde connectoren op de inlaat- en uitlaatpunten van het microfluïdische kanaal met snelle epoxylijm.Kies voor de vloeistofbehandeling de diameter van de PTFE-buizen op basis van de grootte van de connectoren. De buizen worden gebruikt voor de introductie van de kristallisatieoplossing in het vloeistofkanaal van de dialysechip. Pipetteer handmatig een druppel van het eiwitmonster in het eiwitreservoir direct op het dialysemembraan.Het volume van de eiwitdruppel hangt af van het ontwerp van de microchip die wordt gebruikt. En specifiek hangt het af van het volume van de centrale pilaar en het kan 0,1 of 0,3 microliter zijn. Breng voorzichtig een dun laagje hoogvacuüm siliconenvet aan rondom het eiwitreservoir.Snijd een klein stukje PMMA en plaats het voorzichtig boven de dunne laag van het siliconenvet. Snijd een stuk Kapton-tape, groot genoeg om het PMMA-stuk boven het eiwitreservoir te bedekken en om aan alle randen op de NOA-chip te plakken. Het eiwitmonster wordt ingekapseld in het reservoir en de chip kan worden gebruikt voor kristallisatie-experimenten.Bereid eerst ongeveer 500 microliter van de kristallisatieoplossing door de juiste volumes van de buffer en de precipitante oplossingen te mengen. Injecteer de kristallisatieoplossing in het punt van de dialysechip door de vloeistofconnectoren, handmatig met de spuit of met een geautomatiseerd drukaangedreven systeem. Zodra het vloeistofkanaal is gevuld met de kristallisatieoplossing en er geen lucht in is opgesloten, sluit u de inlaat- en uitlaatpoorten van de chip af met Parafilm-tape.Pipetteer het juiste volume van de eiwitoplossing in het eiwitreservoir en inkapsuleer het eiwitmonster zoals reeds beschreven. De eiwitkristalgroei kan worden gevisualiseerd en opgenomen met een digitale camera. Voor de fabricage van de dialysemicrochips hebben we gekozen voor optisch transparante en biologisch inerte materialen, wat een hoge compatibiliteit aantoont voor in situ röntgendiffractie-experimenten.Het achtergrondgeluid dat wordt gegenereerd door de materialen waaruit het eiwitcompartiment van de chip bestaat, dat zich in het directe pad van de röntgenstraal bevindt, is geëvalueerd. Het eiwitcompartiment bestaat uit het geregenereerde cellulosedialysemembraan, de Kapton-tape en twee PMMA-lagen, één gebruikt als substraat van de microchips en één gebruikt voor de inkapseling van het eiwitmonster. In deze afbeelding wordt het achtergrondgeluid geïllustreerd dat wordt gegenereerd door de Kapton-tape, het geregenereerde cellulosedialysemembraan, de PMMA-laag en hun assemblage.Hoewel de fotocurable hars NOA het hoofdlichaam van de microchips omvat, is niet opgenomen in deze metingen omdat het geen deel uitmaakt van de eiwitkamer. Diffuse ringen toegeschreven aan de interacties van röntgenstralen met de materialen zijn te zien voor de Kapton-tape bij de resolutie lager dan vier angstroms, de PMMA tussen vier en acht angstroms en het dialysemembraan tussen vier en vijf angstroms. Het totale achtergrondgeluid dat door de chip wordt gegenereerd, wordt voornamelijk waargenomen bij de resolutie lager dan zes angstrom, wat aangeeft dat de behandeling van diffractiegegevens met hoge resolutie van lysozyme niet wordt beïnvloed.De microchips werden voor de röntgenstraal gemonteerd met een 3D-geprinte ondersteuning die we hebben ontworpen voor in situ röntgendiffractie-experimenten en het kan tot drie chips tegelijkertijd bevatten. Experimenten werden uitgevoerd om de efficiëntie van de microchips voor on-chip kristallisatie van modeloplosbare eiwitten met de microdialysemethode te evalueren. lysozymkristallen werden gekweekt met 293 kelvin in twee verschillende omstandigheden.De eerste kristallisatieconditie bevatte 1,5 molair natriumchloride en 0,1 molair natriumacetaat. De tweede kristallisatievoorwaarde bevatte één molair natriumchloride, 0,1 molair natriumacetaat en 30% polyethyleenglycol 400, en werd gekozen om de compatibiliteit van de microchips en de microdialysemethode aan te tonen, met precipitanten met een hoog moleculair gewicht en viskeuze oplossingen. De kristallisatie-experimenten werden uitgevoerd onder statische omstandigheden.Zodra lysozymkristallen op de microchip werden gekweekt, werden ze gebruikt voor in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. De microchips werden met behulp van de 3D-geprinte ondersteuning aan de balklijn gemonteerd en complete röntgendiffractiegegevenssets werden verzameld uit twee lysozymkristallen. Na behandeling van de röntgendiffractiegegevens werd de elektronendichtheidskaart van een enkel lysozymekristal verkregen bij een resolutie van 1,95 angstrom, zoals weergegeven in figuur A.Figuur B toont de elektronendichtheidskaart verkregen bij een resolutie van 1,85 angstroms.Na het samenvoegen van twee datasets verkregen uit twee verschillende lysozymkristallen, tonen beide elektrodichtheidskaarten gedetailleerde structurele informatie die kan worden verkregen door in situ röntgendiffractie-experimenten die rechtstreeks op de dialysemicrochips bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, van enkele of meerdere eiwitkristallen. We demonstreerden de fabricageprocedure voor microfluïdische apparaten die zijn ontworpen voor on-chip eiwitkristallisatie met de microdialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur. We gebruikten fabricagematerialen met een hoge röntgentransparantie, compatibel voor in situ eiwitkristallografie.De diffractiegegevensverzameling wordt geautomatiseerd met behulp van een 3D-geprinte ondersteuning voor de chips, die direct in macromoleculaire kristallografiestraallijnen kan worden gemonteerd. De veelzijdigheid van deze microchip komt voort uit het gebruik van microdialyse om kristallisatieomstandigheden omkeerbaar te regelen en fasediagrammen in kaart te brengen met behulp van een klein eiwitvolume. De prototyping van het apparaat is eenvoudig, waardoor de fabricage van maximaal 30 microchips op één dag in een schone kamer mogelijk is, met relatief goedkope materialen.We verwachten dat deze kenmerken van de chips kunnen worden gebruikt voor seriële röntgenkristallografiestudies van meer uitdagende eiwitdoelen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Dynamische elektrochemische meting van chloride-ionen

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ karakterisering van gehydrateerde Eiwitten in Water door SALVI en ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray poederdiffractie in Conservation Science: Towards Routine kristalstructuurbepaling van Corrosie Producten over Heritage Kunstobjecten

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kwantificeren van Röntgen fluorescentie gegevens met behulp van MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Metingen van luchtverontreiniging over lange afstand elektronische correlaties tijdens femtoseconde diffractie experimenten uitgevoerd op nanokristallen van Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Essentieel metalen opname bij gram-negatieve bacteriën: Röntgen fluorescentie, radio-isotopen, en cel fractionering

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-gevoelige detectie van de chemie in batterijen door zachte X-ray Absorptie spectroscopie en Resonant inelastisch X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Biologische monsters voorbereiding voor soortvorming bij cryogene temperatuur met behulp van hoge-resolutie röntgenabsorptiespectroscopie

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...