Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
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MBS reconnaît le soutien du MI/CNRS dans le cadre du contrat Instrumentation aux limites 2014-2015. NJ reconnaît le Programme international de recherche doctorale (Irtelis) du CEA pour la bourse de doctorat. MBS et SJ reconnaissent le financement du Programme horizon 2020 de recherche et d'innovation de l'Union européenne dans le cadre de l'accord de subvention Marie Skłodowska-Curie numéro 722687. MBS, SJ et NJ remercient LIPhy (UGA) pour l'établissement de chambres propres pour les expériences de microfabrication. IBS reconnaît son intégration à l'Institut interdisciplinaire de recherche de Grenoble (IRIG, CEA).

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Un dispositif microfluidique a été développé pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de microdialyse et des expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. Les puces NOA 81 intégrant des membranes de dialyse RC de n'importe quel MWCO afin d'utiliser la microdialyse pour la cristallisation des protéines sur puce peuvent être fabriquées. Des matériaux de fabrication avec une transparence relativement élevée des rayons X ont été utilisés, rendant les puces compatibles pour la cristallographie in situ des protéines. Les matériaux de fabrication qui composent le compartiment pour la cristallisation protéique de l'appareil (PMMA, Kapton, membrane de dialyse RC) ont été évalués pour générer un faible bruit de fond. Plus précisément, le bruit de fond généré par la puce de dialyse est principalement observé à basse résolution (> 6 Å) et n'affecte pas le traitement des données de diffraction à haute résolution des gros cristaux de lysozyme nécessaires à la détermination de la structure protéique. L'automatisation de la collecte de données est amplifiée à l'aide d'un support imprimé 3D qui peut être monté directement dans des faisceaux de cristallographie macromoléculaire et transporter jusqu'à trois puces simultanément. De cette façon, la récolte manuelle et la manipulation des cristaux de protéines fragiles sont évitées. En outre, la collecte de données a lieu à température ambiante, en évitant le besoin de cryoprotection qui peut être liée à des changements conformationnels de la structure des protéinesindigènes 2,3.
L'utilisation de la microdialyse comme méthode de croissance des cristaux sur puce permet de surveiller et de contrôler avec précision le processus de cristallisation. Comme nous l'avons vu dans l'introduction, la plupart des méthodes conventionnelles de cristallisation des protéines ont été mises en œuvre à l'aide de dispositifs microfluidiques11,14. Cependant, les avantages de la dialyse pour la cristallisation des protéines n'avaient pas encore été pleinement exploités à l'échelle microscale. La microdialyse sur puce permet d'étudier les diagrammes de phase et d'effectuer le criblage et l'optimisation des conditions de cristallisation avec le même échantillon deprotéines 19. Pour les prototypes présentés dans ce travail, la consommation de protéines par puce est limitée à 0,1 ou 0,3 μL. D'après les travaux expérimentaux jusqu'à présent, les étapes les plus critiques du protocole ne proviennent pas de la procédure de fabrication des puces, mais du processus de cristallisation. Le protocole de fabrication comprend de nombreuses étapes, mais il est simple et permet la fabrication de nombreux appareils (20 à 30 puces) en une seule journée dans la salle propre, avec des matériaux relativement peu coûteux. Cependant, la cristallisation sur puce des protéines peut être une procédure délicate en raison de la nature stochastique intrinsèque de la nucléation et de la croissance du cristal, en particulier dans le micro-échelle. Une étude de cas a été décrite, où des conditions bien établies ont été employées pour la cristallisation du lysozyme qui a donné des cristaux robustes et bien définis appropriés pour la collecte in situ de données de diffraction de rayon X. Néanmoins, des difficultés peuvent survenir en utilisant des cibles protéiques plus difficiles, telles que les protéines membranaires, où le milieu de cristallisation est beaucoup plus compliqué, les diagrammes de phase ne sont pas connus et les conditions de cristallisation qui fonctionnent bien ne sont pas encore bien établies. La puce de dialyse offre la possibilité de dépasser ces difficultés et d'étudier les diagrammes de phase sur puce, sans disposer de l'échantillon de protéines précieux et souvent coûteux, en échangeant simplement la solution de cristallisation dans le canal microfluidique.
La polyvalence des dispositifs microfluidiques provient de l'exploitation de la microdialyse pour la cristallisation des protéines sur puce afin de contrôler de manière réversible les conditions de cristallisation et de cartographier la concentration et la température des diagrammes de phase variés à l'aide d'un faible volume de protéines. En outre, l'appareil est compatible avec les expériences in situ de diffraction des rayons X et le prototypage des appareils est peu coûteux et rapide. De nombreux cristaux isomorphes de protéines solubles et membranaires (en préparation) peuvent être cultivés sur puce et on s'attend à ce que toutes ces caractéristiques puissent être utilisées pour des études en série de cristallographie aux rayons X sur des cibles protéiques difficiles dans les installations synchrotron et XFEL. Enfin, l'exécution d'études sur puce et in situ résolues dans le temps est une possibilité future qui pourrait intéresser particulièrement la communauté cristallographique. Par conséquent, en cultivant des cristaux sur la puce de dialyse et en introduisant les réachemins dans le canal microfluidique, soit manuellement (à l'aide d'une seringue) ou automatiquement (avec un système de fluide de contrôle de la pression ou une seringue-pompe), les efforts futurs se concentreront sur la preuve que les puces microfluidiques peuvent être utilisées avec succès pour déclencher des expériences résolues dans le temps sur les faisceaux synchrotron.

L'élucidation de la structure tridimensionnelle (3D) des macromolécules biologiques est une poursuite incessante en biologie structurale où la cristallographie aux rayons X demeure la principale technique d'investigation. Appliqué pour démêler les détails structurels des macromolécules complexes, telles que les protéines, il vise à faciliter la compréhension de leurs mécanismes d'actions et leur implication dans diverses fonctions biologiques. De puissantes sources de rayons X aux synchrotrons et aux lasers à électrons libres à rayons X (XFELs) fournissent tous les outils nécessaires pour mieux comprendre la structure des protéines à une résolution presque atomique. Malgré les avantages qui viennent avec l'utilisation des rayons X pour les études structurelles, il ya des limites intrinsèques au rayonnement radiographique et le processus de cristallisation lui-même. Les dommages causés par les radiations provoquées par un flux de rayons X élevé et de longs temps d'exposition du cristal protéique devant le faisceau de rayons X sont des paramètres restrictifs que les cristallographes doivent surpasser à l'aide du refroidissement cryogénique1. Cependant, trouver les conditions cryocooling optimales peut être laborieux puisque les changements conformationnels de la structure ou des artefacts indigènes de protéine peuvent être cachés2,3. En outre, des études récentes indiquent que l'exécution d'expériences de diffraction à température ambiante entraîne des dommages spécifiques plus faibles auxradiations 4. Un autre goulot d'étranglement en biologie structurale est l'acquisition de cristaux bien diffracting avec une taille suffisante5. Les petits cristaux sont plus faciles à produire, surtout dans le cas des protéines membranaires, mais sont plus sensibles aux dommages causés par les radiations, même dans des conditions cryocoolantes, car une dose élevée de rayonnement doit être dirigée dans un volume plus faible par rapport au cas des cristaux de protéines plusgros 6. La nouvelle approche de la cristallographieen série 7,8 chez les synchrotrons et les XFELs peut contourner les limites des dommages causés par les radiations tout en exploitant les cristaux plus petits (200 nm à 2 μm)7 en fusionnant des ensembles de données à partir de multiples, cristaux de protéines isomorphes et orientés au hasard et profitant des progrès technologiques associés tels que les impulsions femtosecondes, des temps d'exposition plus courts et des faisceaux de rayons X micro-focalisés5,7,9,10.
La technologie microfluidique est précieuse pour la cristallographie aux rayons X, présentant de multiples avantages pour la cristallisation des macromolécules biologiques et leur étude structurelle. La réalisation d'expériences de cristallisation dans des dispositifs microfluidiques nécessite de petits volumes d'échantillons de protéines, limitant ainsi le coût de production de ces macromolécules bio de grande valeur et facilitant le criblage et l'optimisation à haut débit de nombreuses conditions de cristallisation. En outre, le rapport surface-volume inhérent à l'échelle microfluidique et les phénomènes de transport limités par diffusion permettent un contrôle fin des débits et des gradients de température ou de concentration11,12,13,14, rendant les dispositifs microfluidiques adaptés à la croissance de cristaux de taille uniforme et à l'exploration des diagrammes de phase15,16,17,18,19. De plus, les outils microfluidiques présentent un potentiel distinctif pour surmonter un autre obstacle à la cristallographie des protéines, c'est-à-dire la livraison d'échantillons, et la nécessité de manipuler et de récolter des cristaux de protéines avant leur utilisation pour des expériences de diffraction aux rayons X. La méthode de cristallographie aux rayons X sur puce et in situ élimine la manipulation des cristaux et la détérioration potentielle de la qualité des cristaux avant la collecte de données. Un large éventail de puces microfluidiques compatibles pour la cristallographie in situ des protéines aux rayons X ont été conçus, développés et testés par de nombreux groupes de recherche confrontés aux restrictions connexes découlant de la nature des matériaux de microfabrication et de leurs interactions avec les rayons X14,19,20,21,22,23. Les matériaux de fabrication doivent être optiquement transparents, biologiquement inertes et démontrer une grande transparence par rapport au rayonnement radiographique et un rapport signal-bruit optimal lors de la collecte des données.
La plupart des méthodes de cristallisation appliquées dans la cristallographie conventionnelledes protéines 24,25 ont également été mises en œuvre à l'échelle microfluidique11,14 pour la cristallisation des copeaux et l'analyse in situ de la diffraction des rayons X. Des appareils microfluidiques simples, hybrides ou multicou couches intégrant la diffusion de vapeur26,l'évaporation27,la diffusion libre de l'interface (FID)28,le microbatch26,ou même l'ensemencement29 ont été utilisés pour cristalliser les protéines solubles et membranaires. Le criblage et l'optimisation à haut débit des conditions de cristallisation peuventêtre atteints 30,31 dans32,droplet-based33,ou valve-actionné34 dispositifs. In situ (in situ) Des expériences de diffraction aux rayons X de cibles protéiques difficiles à température ambiante ont été menées dans des micropuces fabriquées à partir de divers matériaux tels que pdms (polydimethylsiloxane), COC (copolymère olefin cyclique), PMMA (poly(méthacrylate méthyle))2 1,22,26,28,29, graphène films23, Kapton35, colle époxy6, ou NOA (Adhésif optique Norland)19 et la transparence des matériaux aux rayonnements radiographiques et leur contribution au bruit de fond ont été évalués. En outre, les puces ont été conçues pour coupler les stratégies in situ et les stratégies de collecte de données en série dans un seul outil pour les expériences de cristallographie des protéines aux rayons X aux sources synchrotron23,35,36 et XFELs7.
La collecte de données in situ sur la température ambiante a également été mise en œuvre dans diverses méthodes et dispositifs de livraison. Par exemple, Nogly et coll.54 ont utilisé un injecteur de phase cubique lipidique (LCP) afin d'étudier la structure de la bactériorophodopsine de pompe à photons à commande lumineuse (bR) par cristallographie femtoseconde en série (SFX) à l'aide d'une source XFEL. La structure cristalline de bR a été résolue à la résolution de 2.3 Å, démontrant la compatibilité d'un injecteur de LCP avec la cristallographie en série de femtoseconde de temps-résolue (TR-SFX). Baxter et coll.55 ont conçu une grille multi cristalline haute densité, fabriquée par un plastique polycarbonate de 100 ou 200 μm d'épaisseur avec des trous découpés au laser de différentes tailles. Un film supplémentaire en polycarbonate de 5 μm d'épaisseur peut être fixé d'un côté de la grille lors de l'utilisation de l'appareil pour des expériences de cristallisation assis ou suspendus. Cette grille à haute densité peut être utilisée de multiples façons car les cristaux peuvent être chargés directement sur les ports de l'appareil ou des cristaux peuvent être cultivés sur l'appareil par diffusion de vapeur ou la méthode LCP. En outre, la grille peut être ajustée dans une base magnétique standard et utilisée pour la collecte in situ de données aux rayons X dans des conditions cryogéniques ou de température ambiante. Plus récemment, Feiler et coll.56 ont mis au point un porte-échantillon pour la cristallographie aux rayons X in situ macromoléculaire à température cryogénique et ambiante avec une contribution minimale au bruit de fond. Plus précisément, le support comprend un support en plastique, une feuille COC transparente et une feuille de polyimide structuré microporeuse. Il a été conçu pour remplacer les glissières de couverture couramment utilisées pour la mise en place de gouttes de cristallisation, tout en permettant une manipulation en place comme le trempage des ligands, la formation complexe et la protection cryogénique sans ouvrir la chute de cristallisation ou manipuler manuellement les cristaux. De plus, le porte-échantillon peut être retiré de la plaque de cristallisation et placé sur une base magnétique pour la collecte de données in situ aux faisceaux standard s'appuyant sur le goniomètre. Pour la collecte de données sur la température ambiante, le papier d'aluminium COC est retiré avant l'expérience et seule la feuille de polyimide de 21 μm d'épaisseur contribue à la diffusion en arrière-plan, ce qui dans ce cas est minime. Ces exemples ne représentent qu'une petite fraction de la recherche en cours et la multitude de puces polyvalentes développées pour la cristallographie des protéines aux rayons X.
Cependant, la méthode de cristallisation des protéines de dialyse n'a pas été largement incorporée dans les microfluidiques. La dialyse est une méthode basée sur la diffusion visant l'équilibrage de la concentration des précipités à travers une membrane semi-perméable afin d'approcher la concentration nominale pour la cristallisation des protéines et permet un contrôle précis et réversible sur les conditions de cristallisation24. Le cut-off du poids moléculaire (MWCO) de la membrane de dialyse semi-perméable peut être choisi en fonction du poids moléculaire de la macromolécule et des précipités pour permettre la diffusion de petites molécules précipitantes tout en conservant la macromolécule d'intérêt. En raison de la réversibilité du processus de dialyse, il peut être utilisé en combinaison avec le contrôle de la température pour découpler et optimiser la nucléation et la croissance descristaux indépendamment 37 pour étudier les diagrammes de phase en modifiant la concentration de précipitation tout en utilisant le même échantillon de protéines. L'intégration des membranes en microfluidique est examinée par de Jong et coll.38 et les études de cas en biologie implantant la dialyse dans les micropuces peuvent être principalement énumérées dans les applications de préparation, de concentration ou de filtrationde l'échantillon 39,40,41,42 ou les études liées aux cellules43,44. La pervaporation par PDMS a été employée par Shim et autres37 pour étudier la nucléation et la croissance de la xylanase dans diverses conditions. L'eau a imprégné la membrane PDMS de 15 μm d'épaisseur dans le réservoir protéique du dispositif microfluidique, modifiant par la suite la concentration en protéines et en précipités.
Le protocole développé par Junius et coll.19,45 pour la fabrication d'une puce microfluidique compatible à la fois pour la cristallisation des protéines sur puce par microdialyse et des expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante est présenté. Le protocole pour la fabrication de l'appareil est directement inspiré par le travail pionnier accompli par Studer et ses collègues12,46 pourles autocollants à micro-motifs de résine photo-curable à base de thiolene NOA 81 intégrant des membranes disponibles dans le commerce, en utilisant la lithographie à empreinte douce. Une modification novatrice de la méthode a permis aux micropuces permettant l'utilisation de la microdialyse pour surveiller et contrôler avec précision les paramètres expérimentaux de la croissance sur puce des cristaux protéiques et exploiter simultanément les avantages des microfluidiques, tels que la réduction de la consommation d'échantillons de protéines par expérience (<1 μL). Dans un travail précédent, les principes de dialyse appliqués à un système à macro-échelle (volume typique >20 μL) pour le criblage et l'optimisation des conditions de cristallisation en cartographiant les diagrammes de phase de concentration de température-précipitant ont étédémontrés 47. Dans le cadre de ces travaux, un protocole est décrit pour la production de micropuces de dialyse incorporant des membranes de dialyse régénérées de cellulose (RC) de différents MWCO afin d'effectuer des analyses de cristallisation sur puce et la collecte in situ de données de diffraction aux rayons X. Les matériaux comprenant les puces ont été évalués pour leur transparence aux rayons X19 et les dispositifs peuvent être réglés directement devant le faisceau de rayons X pour des expériences de diffraction in situ à température ambiante, excluant la manipulation manuelle et minimisant la dégradation des cristaux de protéines fragiles. Dans une étude de cas, les cristaux de lysozyme blanc d'œuf de poule ont été cultivés sur puce par microdialyse générant une population uniformément dimensionnée. La puce a ensuite été montée devant le faisceau de rayons X avec un support imprimé en 3D19 et des ensembles complets de données de diffraction in situ ont été recueillis à température ambiante à partir de cristaux multiples et isomorphes, démontrant le potentiel élevé et la pertinence des puces pour les études de cristallographie en série synchrotron de cibles macromoléculaires difficiles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Ce protocole décrit la fabrication d'appareils microfluidiques reproductibles et peu coûteux couvrant l'ensemble du pipeline pour cristalliser les protéines sur puce avec la méthode de dialyse et permettre des expériences de cristallographie in situ à cristaux simples ou en série à température ambiante. Le protocole détaille le processus de fabrication des puces, la manipulation des expériences de cristallisation sur puce et le traitement des données in situ recueillies sur la diffraction des rayons X pour l'élucidation structurelle de l'échantillon protéique. La principale caractéristique de cette procédure de microfabrication réside dans l'intégration d'une membrane de dialyse à cellulose régénérée semi-perméable disponible dans le commerce entre deux couches de la puce. La coupure de poids moléculaire de la membrane intégrée varie en fonction du poids moléculaire de la macromolécule et des précipités. L'appareil exploite les avantages de la technologie microfluidique, comme l'utilisation de volumes infimes d'échantillons (<1 μL) et l'accordage fin sur les phénomènes de transport. La puce les a couplés avec la méthode de dialyse, fournissant un contrôle précis et réversible sur le processus de cristallisation et peut être utilisé pour étudier les diagrammes de phase des protéines à l'échelle du microlitre. L'appareil est modelé à l'aide d'une résine à base de thiolene photocurable avec lithographie à empreinte douce sur un substrat polymérique optiquement transparent. En outre, la diffusion en arrière-plan des matériaux composant les puces et générant du bruit de fond a été évaluée rendant la puce compatible pour les expériences in situ de diffraction des rayons X. Une fois que les cristaux protéiques sont cultivés sur puce jusqu'à une taille adéquate et l'uniformité de la population, les puces peuvent être directement montés en face du faisceau de rayons X à l'aide d'un support imprimé en 3D. Cette approche répond aux défis qui se lèvent de l'utilisation de cryoprotecteurs et de la récolte manuelle dans les expériences conventionnelles de cristallographie protéique d'une manière facile et peu coûteuse. Des ensembles complets de données de diffraction des rayons X provenant de cristaux de lysozyme multiples et isomorphes cultivés sur puce ont été recueillis à température ambiante pour la détermination de la structure.

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Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Cet article détaille le protocole de fabrication des puces microfluidiques développées pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de dialyse et les expériences in situ de diffraction des rayons X. Le processus de microfabrication permet d'intégrer une membrane de dialyse à cellulose régénérée semi-perméable avec n'importe quel coupure de poids moléculaire, entre deux couches de la puce.

Cristallisation des protéines sur puce par microdialyse pour les études in situ sur la diffraction des rayons X

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Cet article décrit le protocole de fabrication des puces microfluidiques développées pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de dialyse et les expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. L’un des principaux avantages de ces puces est le choix des matériaux de fabrication, rendant les puces compatibles pour la collecte in situ de données de diffraction des rayons X à température ambiante. Les expériences de cristallisation sur puce nécessitent de petits volumes de l’échantillon de protéines, ce qui réduit le coût global de travail avec ces macromolécules de grande valeur.La cristallisation sur puce élimine également la récolte manuelle des cristaux de protéines fragiles, fréquemment appliqués en combinaison avec le refroidissement cryo lors d’expériences de cristallographie conventionnelles. En outre, nos micropuces utilisent la microdialyse pour la cristallisation des protéines, qui est une méthode basée sur la diffusion visant à équilibrer la concentration de précipitation à travers une membrane semi-perméable, afin d’approcher la concentration cromulente pour la cristallisation des protéines, et permet un contrôle précis et réversible sur les conditions de cristallisation. La microdialyse combinée au contrôle de la température peut être utilisée pour dissocier la nucléation de la croissance du cristal pour étudier les diagrammes de phase, en modifiant la concentration de précipitation tout en utilisant le même échantillon de protéines.Préparez d’abord 50 grammes de base en silicone PDMS et c’est un agent curatif dans un rapport de masse de 10 pour un. Mélanger les deux ingrédients dans un bécher à l’aide d’une spatule. Après le mélange, placer le mélange dans une chambre à vide afin d’enlever toutes les bulles d’air.Mettez 25 grammes de PDMS préméxé dans le premier SU8 à maîtriser contenant les modèles du canal microfluidique et des piliers, jusqu’à une hauteur d’environ cinq millimètres. Verser ensuite les 25 grammes restants du PDMS dans le deuxième maître SU8, ne contenant que les motifs des piliers. Guérir les deux couches PDMS dans un four à 338 kelvin pendant une heure.Coupez les couches PDMS durcies autour des motifs des maîtres SU8 avec un scalpel, et décollez doucement les moules PDMS des maîtres en silicone. Placez le moule PDMS, avec les canaux et les piliers sur une lame de verre microscope rigide avec les motifs orientés vers le haut. Couper un petit morceau de membrane de dialyse à la cellulose régénérée afin de couvrir le pilier central du moule PDMS, qui est conçu pour être la chambre protéique.Le seuil de poids moléculaire de la membrane de dialyse est choisi en conséquence en fonction du poids moléculaire de l’échantillon de protéine, et des précipités de la solution de cristallisation. Ensuite, séparez soigneusement le morceau sec de la membrane de dialyse à cellulose régénérée. Couper un petit morceau de la membrane de dialyse séparée.La taille de ce morceau de membrane dépend de la conception de la puce. Et plus précisément, cela dépend des dimensions du pilier central. Déposez le morceau de la membrane de dialyse sur le pilier central du moule PDMS, qui est soutenu sur la glissière de verre, avec son pilier et les canaux orientés vers le haut.Ensuite, placez le deuxième moule PDMS avec seulement les piliers orientés vers le bas, sur le dessus du moule PDMS qui est déjà pris en charge sur la glissière en verre. Alignez tous les piliers des deux moules PDMS. Le morceau de la membrane régénérée de dialyse de cellulose est pris en sandwich entre les deux piliers centraux des moules de PDMS.Cette étape de la procédure de fabrication peut être effectuée au microscope optique ou simplement en inspectant visuellement soigneusement l’alignement de tous les piliers. Placez l’assemblage dans une chambre à vide et dessiccate pendant 30 minutes afin d’enlever les bulles d’air emprisonnées dans les moules PDMS, et d’améliorer l’insertion de la résine photocurable NOA, qui sera décrite dans la prochaine étape de ce protocole. Retirez l’assemblage de la chambre à vide et remplissez l’espace vide entre les deux moules PDMS avec la résine photocurable à base de thiolin, NOA 81, par imbibition capillaire.Appliquer la résine sur trois des quatre côtés de l’assemblage. Placez l’assemblage dans un lien croisé et guérissent la résine NOA en l’exposant à la lumière UV pendant huit secondes, à l’aide d’une lampe UV collimée de 35 milliwatt par centimètre carré. Coupez une pièce PMMA de 175 micromètres d’épaisseur dans les dimensions standard d’une lame de verre au microscope et détachez la protection en plastique de chaque côté de la pièce PMMA.Une fois la première exposition aux UV terminée, retirez le moule PDMS supérieur avec une résine NOA partiellement croisée collée dessus à partir du moule PDMS inférieur et de la glissière en verre. Appuyez doucement sur l’assemblage du moule PDMS supérieur et de la résine NOA partiellement durcie sur la pièce PMMA. Placez le nouvel assemblage dans le lien croisé et guérissez à nouveau la résine NOA par exposition à la lumière UV pendant 60 secondes.Retirez soigneusement le moule PDMS supérieur. La puce de dialyse faite de la résine noa entièrement croisée intégrant une membrane régénérée de dialyse de cellulose et étant soutenue sur une pièce de PMMA est prête. Collage de connecteurs disponibles dans le commerce sur l’entrée et les points de sortie du canal microfluidique avec de la colle époxy rapide.Pour la manipulation des fluides, choisissez le diamètre des tubes PTFE en fonction de la taille des connecteurs. Les tubes sont utilisés pour l’introduction de la solution de cristallisation dans le canal fluidique de la puce de dialyse. Pipette manuellement une gouttelette de l’échantillon de protéines à l’intérieur du réservoir de protéines situé juste sur la membrane de dialyse.Le volume de la gouttelette protéique dépend de la conception de la puce qui est utilisée. Et plus précisément, cela dépend du volume du pilier central, et il peut être de 0,1 ou 0,3 microlitres. Appliquez soigneusement une fine couche de graisse de silicone sous vide tout autour du réservoir de protéines.Couper un petit morceau de PMMA et le placer délicatement au-dessus de la fine couche de graisse de silicone. Coupez un morceau de ruban Kapton, assez grand pour couvrir la pièce PMMA placée au-dessus du réservoir de protéines et pour coller sur la puce NDA sur tous les bords. L’échantillon de protéines est encapsulé dans le réservoir et la puce peut être utilisée pour des expériences de cristallisation.Préparez d’abord environ 500 microlitres de la solution de cristallisation en mélangeant les volumes appropriés du tampon et les solutions précipitées. Injectez la solution de cristallisation au point de la puce de dialyse à travers les connecteurs fluidiques, soit manuellement avec la seringue ou avec un système automatisé à pression. Une fois que le canal fluidique est rempli de la solution de cristallisation et qu’aucun air n’est emprisonné à l’intérieur, scellez les ports d’entrée et de sortie de la puce avec du ruban Parafilm.Pipette le volume approprié de la solution protéique dans le réservoir de protéines et encapsuler l’échantillon de protéines comme cela a déjà été décrit. La croissance du cristal protéique peut être visualisée et enregistrée à l’aide d’un appareil photo numérique. Pour la fabrication des puces de dialyse, nous avons choisi des matériaux optiquement transparents et biologiquement inertes, démontrant une compatibilité élevée pour les expériences in situ de diffraction des rayons X.Le bruit de fond généré par les matériaux composant le compartiment protéique de la puce, qui est dans la trajectoire directe du faisceau de rayons X, a été évalué. Le compartiment protéique se compose de la membrane régénérée de dialyse de cellulose, du ruban de Kapton, et de deux couches de PMMA, une employée comme substrat des puces, et une employée pour l’encapsulation de l’échantillon de protéine. Dans cette image, est illustré le bruit de fond généré par la bande Kapton, la membrane de dialyse de cellulose régénérée, la couche PMMA, et leur assemblage.Même si la résine photocurable NOA comprend le corps principal des micropuces, n’est pas inclus dans ces mesures car il ne fait pas partie de la chambre protéique. Des anneaux diffus attribués aux interactions des rayons X avec les matériaux peuvent être vus pour la bande de Kapton à la résolution inférieure à quatre angstroms, le PMMA entre quatre à huit angstroms, et la membrane de dialyse entre quatre à cinq angstroms. Le bruit de fond total généré par la puce est principalement observé à la résolution inférieure à six angstrom, ce qui indique que le traitement des données de diffraction à haute résolution lysozyme n’est pas affecté.Les puces ont été montées devant le faisceau de rayons X avec un support imprimé 3D que nous avons conçu pour les expériences in situ de diffraction des rayons X, et il peut contenir jusqu’à trois puces simultanément. Des expériences ont été menées afin d’évaluer l’efficacité des micropuces pour la cristallisation sur puce des protéines solubles dans le modèle avec la méthode de microdialyse. les cristaux de lysozyme ont été cultivés à 293 kelvin dans deux conditions différentes.La première condition de cristallisation contenait 1,5 chlorure de sodium molaire et 0,1 acétate de sodium molaire. La deuxième condition de cristallisation contenait un chlorure de sodium molaire, 0,1 acétate de sodium molaire et 30 % de polyéthylène glycol 400, et a été choisie pour montrer la compatibilité des puces et de la méthode de microdialyse, avec des précipités de poids moléculaire élevé et des solutions visqueuses. Les expériences de cristallisation ont été menées dans des conditions statiques.Une fois que les cristaux de lysozyme ont été cultivés sur la puce, ils ont été utilisés pour des expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. Les puces ont été montées à la ligne de faisceau à l’aide du support imprimé 3D et des ensembles complets de données de diffraction des rayons X ont été recueillis à partir de deux cristaux de lysozyme. Après traitement des données de diffraction des rayons X, la carte de densité électronique d’un seul cristal de lysozyme a été obtenue à une résolution d’angstrom de 1,95, comme le montre la figure A.Figure B montre la carte de densité électronique obtenue à 1,85 résolution d’angstroms.Après la fusion de deux ensembles de données obtenus à partir de deux cristaux de lysozyme différents, les deux cartes de densité électro montrent des informations structurelles détaillées qui peuvent être obtenues par des expériences in situ de diffraction des rayons X menées directement sur les puces de dialyse à température ambiante, à partir de cristaux de protéines simples ou multiples. Nous avons démontré la procédure de fabrication pour les dispositifs microfluidiques conçus pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de microdialyse, et les expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. Nous avons utilisé des matériaux de fabrication avec une grande transparence des rayons X, compatibles pour la cristallographie des protéines in situ.La collecte de données de diffraction est automatisée à l’aide d’un support imprimé 3D pour les puces, qui peut être monté directement dans les lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire. La polyvalence de cette puce provient de l’utilisation de la microdialyse pour contrôler de façon réversible les conditions de cristallisation et cartographier les diagrammes de phase à l’aide d’un petit volume de protéines. Le prototypage de l’appareil est simple, permettant la fabrication de jusqu’à 30 micropuces en une seule journée dans une pièce propre, avec des matériaux relativement peu coûteux.Nous nous attendons à ce que ces caractéristiques des puces puissent être utilisées pour des études en série de cristallographie aux rayons X sur des cibles protéiques plus difficiles.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Recherche

Chimie

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