Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
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MBS erkennt die Unterstützung des MI / CNRS im Rahmen des Vertrags Instrumentation an den Grenzen 2014-2015 an. NJ würdigt das International Doctoral Research Program (Irtelis) der CEA für das PhD Fellowship. MBS und SJ würdigen die Finanzierung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung mit der Nummer 722687. MBS, SJ und NJ danken LIPhy (UGA) für die Reinraumeinrichtung für Mikrofabrikationsexperimente. Die IBS erkennt die Integration in das Interdisziplinäre Forschungsinstitut von Grenoble (IRIG, CEA) an.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Mikrodialysemethode und in situ-Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur wurde ein mikrofluidisches Gerät entwickelt. NOA 81-Chips, die RC-Dialysemembranen aller MWCO integrieren, um Mikrodialyse für die On-Chip-Proteinkristallisation zu verwenden, können hergestellt werden. Es wurden Fertigungsmaterialien mit einer relativ hohen Röntgentransparenz verwendet, wodurch die Chips für die In-situ-Proteinkristallographie kompatibel gemacht wurden. Die Herstellungsmaterialien, aus denen das Fach für die Proteinkristallisation des Geräts besteht (PMMA, Kapton, RC-Dialysemembran), wurden ausgewertet, um geringe Hintergrundgeräusche zu erzeugen. Insbesondere wird das vom Dialysechip erzeugte Hintergrundrauschen hauptsächlich bei niedriger Auflösung (> 6 °C) beobachtet und beeinflusst nicht die Behandlung von hochauflösenden Beugungsdaten der großen Lysozymkristalle, die für die Bestimmung der Proteinstruktur erforderlich sind. Die Automatisierung der Datenerfassung wird durch eine 3D-gedruckte Stütze verstärkt, die direkt in makromolekularen Kristallographiestrahllinien montiert werden kann und bis zu drei Mikrochips gleichzeitig transportieren kann. Auf diese Weise wird die manuelle Ernte und Manipulation der empfindlichen Proteinkristalle vermieden. Darüber hinaus erfolgt die Datenerfassung bei Raumtemperatur, wodurch ein Kryoschutz vermieden wird, der mit konformen Veränderungen der nativen Proteinstruktur2,3zusammenhängt.
Die Verwendung der Mikrodialyse als Methode zum Anbau von Kristallen auf dem Chip ermöglicht eine genaue Überwachung und Steuerung des Kristallisationsprozesses. Wie in der Einleitung erläutert, wurden die meisten konventionellen Proteinkristallisationsmethoden mit mikrofluidischen Geräten11,14implementiert. Die Vorteile der Dialyse für die Proteinkristallisation waren jedoch im Mikromaßstab noch nicht voll ausgeschöpft. Die On-Chip-Mikrodialyse bietet die Möglichkeit, Phasendiagramme zu untersuchen und das Screening und die Optimierung der Kristallisationsbedingungen mit der gleichen Proteinprobe19durchzuführen. Bei den in dieser Arbeit vorgestellten Prototypen ist der Proteinverbrauch pro Chip auf 0,1 oder 0,3 l begrenzt. Basierend auf den bisherigen experimentellen Arbeiten ergeben sich die kritischsten Schritte des Protokolls nicht aus dem Herstellungsverfahren der Chips, sondern aus dem Kristallisationsprozess. Das Fertigungsprotokoll umfasst viele Schritte, ist aber einfach und ermöglicht die Herstellung zahlreicher Geräte (20 bis 30 Chips) an einem einzigen Tag im Reinraum mit relativ preiswerten Materialien. Die On-Chip-Kristallisation von Proteinen kann jedoch aufgrund der intrinsischen stochastischen Natur der Keimbildung und des Kristallwachstums, insbesondere im Mikromaßstab, ein heikles Verfahren sein. Es wurde eine Fallstudie beschrieben, in der gut etablierte Bedingungen für die Kristallisation von Lysozym verwendet wurden, die robuste, klar definierte Kristalle lieferten, die für die In-situ-Röntgenbeugungsdatenerhebung geeignet waren. Dennoch können Schwierigkeiten durch die Verwendung anspruchsvollerer Proteinziele auftreten, wie z. B. Membranproteine, bei denen das Kristallisationsmedium viel komplizierter ist, Phasendiagramme nicht bekannt sind und gut funktionierende Kristallisationsbedingungen noch nicht gut etabliert sind. Der Dialysechip bietet die Möglichkeit, diese Schwierigkeiten zu übertreffen und Phasendiagramme auf dem Chip zu untersuchen, ohne die wertvolle und häufig kostspielige Proteinprobe zu entsorgen, indem er lediglich die Kristallisationslösung innerhalb des mikrofluidischen Kanals austauscht.
Die Vielseitigkeit der mikrofluidischen Geräte ergibt sich aus der Nutzung der Mikrodialyse für die Proteinkristallisation auf dem Chip, um die Kristallisationsbedingungen reversibel zu steuern und Konzentrations- und Temperaturdiagramme mit geringem Proteinvolumen zu kartieren. Darüber hinaus ist das Gerät mit In-situ-Röntgenbeugungsexperimenten kompatibel und das Prototyping der Geräte ist kostengünstig und schnell. Zahlreiche isomorphe Kristalle von löslichen und Membranproteinen (in Vorbereitung) können auf Chip angebaut werden, und es wird erwartet, dass all diese Eigenschaften für serielle Röntgenkristallographiestudien an anspruchsvollen Proteinzielen in Synchrotron- und XFEL-Anlagen genutzt werden können. Schließlich ist die Durchführung von on-chip- und in-situ-zeitaufgelösten Studien eine zukünftige Möglichkeit, die für die kristallographische Gemeinschaft von erheblichem Interesse sein könnte. Durch den Anbau von Kristallen auf dem Dialysechip und die Einführung der Reagenzien in den mikrofluidischen Kanal, entweder manuell (mit einer Spritze) oder automatisch (mit einem Druckkontrollflüssigkeitssystem oder einer Spritzenpumpe), werden sich die zukünftigen Bemühungen darauf konzentrieren, zu beweisen, dass die mikrofluidischen Chips erfolgreich eingesetzt werden können, um zeitaufgelöste Experimente an Synchrotronstrahllinien auszulösen.

Die Aufklärerin der dreidimensionalen (3D) Struktur biologischer Makromoleküle ist ein unaufhörliches Streben in der Strukturbiologie, wo die Röntgenkristallographie nach wie vor die wichtigste Untersuchungstechnik ist. Es wird zur Entschlüsselung der strukturellen Details komplexer Makromoleküle wie Proteine eingesetzt und zielt darauf ab, das Verständnis ihrer Handlungsmechanismen und ihre Beteiligung an verschiedenen biologischen Funktionen zu erleichtern. Leistungsstarke Röntgenquellen bei Synchrotronen und Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern (XFELs) bieten alle Werkzeuge, die für einen tieferen Einblick in die Struktur der Proteine bei nahezu atomarer Auflösung erforderlich sind. Trotz der Vorteile, die mit der Verwendung von Röntgenstrahlen für Strukturstudien verbunden sind, gibt es intrinsische Einschränkungen für Röntgenstrahlung und den Kristallisationsprozess selbst. Strahlungsschäden, die durch einen hohen Röntgenfluss und lange Belichtungszeiten des Proteinkristalls vor dem Röntgenstrahl hervorgerufen werden, sind restriktive Parameter, die Kristallographen mit kryogener Kühlung übertreffen müssen1. Die Suche nach den optimalen Kryokühlbedingungen kann jedoch mühsam sein, da konforme Veränderungen aus der nativen Proteinstruktur oder Artefakte nen verborgen werden können2,3. Darüber hinaus deuten neuere Studien darauf hin, dass die Durchführung von Beugungsexperimenten bei Raumtemperatur zu geringeren spezifischen Strahlenschäden führt4. Ein weiterer Engpass in der Strukturbiologie ist der Erwerb gut diffrierender Kristalle mit einer ausreichenden Größe5. Kleine Kristalle sind einfacher zu produzieren, insbesondere bei Membranproteinen, sind aber auch unter Kryokühlbedingungen anfälliger für Strahlenschäden, da eine hohe Strahlendosis in einem kleineren Volumen gerichtet werden muss als bei größeren Proteinkristallen6. Der neuartige Ansatz der seriellen Kristallographie7,8 bei Synchrotronen und XFELs kann die Retrains von Strahlungsschäden umgehen und gleichzeitig kleinere Kristalle (200 nm bis 2 m)7 nutzen, indem Datensätze aus mehreren, isomorphen und zufällig orientierten Proteinkristallen zusammengeführt werden und von den damit verbundenen technologischen Fortschritten wie Femtosekundenpulse, kürzeren Belichtungszeiten und mikrofokussierten Röntgenstrahlen5,7,9,10, profitiert werden.
Die mikrofluidische Technologie ist wertvoll für die Röntgenkristallographie und weist vielfältige Vorteile für die Kristallisation biologischer Makromoleküle und deren Strukturuntersuchungen auf. Die Durchführung von Kristallisationsexperimenten in mikrofluidischen Geräten erfordert geringe Mengen an Proteinproben, wodurch die Produktionskosten dieser hochwertigen Biomakromoleküle eingeengt werden und ein Hochdurchsatz-Screening und die Optimierung zahlreicher Kristallisationsbedingungen ermöglicht werden. Darüber hinaus ermöglicht das inhärente große Flächen-Volumen-Verhältnis im mikrofluidischen Maßstab und diffusionsbegrenzte Transportphänomene eine feine Kontrolle über Ströme und Temperatur- oder Konzentrationsgradienten11,12,13,14, um mikrofluidische Vorrichtungen zu rendern, die für den Anbau von gleichgroßen Kristallen geeignet sind und Phasendiagramme15,16,17,18,19untersuchen. Darüber hinaus weisen mikrofluidische Werkzeuge ein ausgeprägtes Potenzial auf, um eine weitere Hürde in der Proteinkristallographie zu überwinden, die die Probenabgabe ist, und die Notwendigkeit, Proteinkristalle vor ihrer Verwendung für Röntgenbeugungsexperimente zu behandeln und zu ernten. Die Methode der On-Chip- und In-situ-Röntgenkristallographie eliminiert die Kristallmanipulation und die mögliche Verschlechterung der Kristallqualität vor der Datenerfassung. Eine breite Palette von mikrofluidischen Chips, die für die In-situ-Röntgenproteinkristallographie kompatibel sind, wurden von vielen Forschungsgruppen entwickelt, entwickelt und getestet, die sich den damit verbundenen Einschränkungen stellen, die sich aus der Natur der Mikrofabrikationsmaterialien und ihren Wechselwirkungen mit Röntgenstrahlen14,19,20,21,22,23ergeben. Die Fertigungsmaterialien müssen optisch transparent, biologisch inert sein und eine hohe Transparenz gegenüber Röntgenstrahlung und ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis bei der Datenerfassung aufweisen.
Die meisten kristallinierenden Methoden, die in der konventionellen Proteinkristallographie24,25 angewendet werden, wurden auch im mikrofluidischen Maßstab11,14 für die Chipkristallisation und in situ Röntgenbeugungsanalyse implementiert. Einfache, hybride oder mehrschichtige mikrofluidische Geräte mit Dampfdiffusion26, Verdampfung27, freie Grenzflächendiffusion (FID)28, Microbatch26oder sogar Aussaat29 wurden verwendet, um lösliche und Membranproteine zu kristallisieren. Hochdurchsatzabsiebung und Optimierung der Kristallisationsbedingungen können30,31 in gut basierten32, Tröpfchen-basierten33oder ventilbetätigten34 Geräten erreicht werden. In situ Röntgenbeugungsexperimente von anspruchsvollen Proteinzielen bei Raumtemperatur wurden in Mikrochips durchgeführt, die aus verschiedenen Materialien wie PDMS (Polydimethylsiloxan), COC (zyklisches Olefin-Copolymer), PMMA (Poly(Methylmethacrylat)) hergestellt wurden21,22,26,28,29, Graphenfolien23, Kapton35, Epoxidkleber6oder NOA (Norland Optical Adhesive)19 und die Transparenz der Materialien zur Röntgenstrahlung und ihr Beitrag zum Hintergrundrauschen wurden bewertet. Darüber hinaus wurden Mikrochips entwickelt, um die In-situ- und die seriellen Datenerfassungsstrategien in einem einzigen Werkzeug für Röntgenproteinkristallographie-Experimente an Synchrotronquellen23,35,36 und XFELs7zu koppeln.
Die Raumtemperatur-in-situ-Datenerfassung wurde auch in verschiedenen Bereitstellungsmethoden und -geräten implementiert. Zum Beispiel verwendeten Nogly et al.54 einen Lipid-Kubikphasen-Injektor (LCP), um die Struktur des lichtgetriebenen Photonenpumpenbakteriorhodopsin (bR) durch serielle Femtosekundenkristallographie (SFX) mit einer XFEL-Quelle zu untersuchen. Die Kristallstruktur von bR wurde auf eine Auflösung von 2,3 ° gelöst, was die Kompatibilität eines LCP-Injektors mit der zeitaufgelösten seriellen Femtosekundenkristallographie (TR-SFX) demonstriert. Baxter et al.55 entwarfen ein hochdichtes Multikristallgitter, hergestellt aus einem 100 oder 200 m dicken Polycarbonat-Kunststoff mit lasergeschnittenen Löchern in verschiedenen Größen. Bei Verwendung des Geräts für Sitz- oder Hängetropfenkristallisationsexperimente kann eine zusätzliche 5'm dicke Polycarbonatfolie an einer Seite des Gitters befestigt werden. Dieses Raster mit hoher Dichte kann auf verschiedene Arten verwendet werden, da Kristalle direkt auf die Anschlüsse des Geräts geladen werden können oder Kristalle auf dem Gerät durch Dampfdiffusion oder die LCP-Methode angebaut werden können. Darüber hinaus kann das Raster in einer Standard-Magnetbasis eingestellt und für die In-situ-Röntgendatenerfassung bei kryogenen oder Raumtemperaturbedingungen verwendet werden. In jüngerer Zeit entwickelten Feiler et al.56 einen Probenhalter für die makromolekulare In-situ-Röntgenkristallographie bei kryogener und Umgebungstemperatur mit minimalem Hintergrundgeräuschbeitrag. Konkret besteht der Halter aus einer Kunststoffstütze, einer transparenten COC-Folie und einer mikroporösen strukturierten Polyimidfolie. Es wurde entwickelt, um die häufig verwendeten Deckschlitten für die Einrichtung von Kristallisationstropfen zu ersetzen, während es eine in-place-Manipulation wie Ligandeneinweichen, komplexe Bildung und kryogenen Schutz ermöglicht, ohne den Kristallisationstropfen zu öffnen oder die Kristalle manuell zu handhaben. Darüber hinaus kann der Probenhalter von der Kristallisationsplatte entfernt und auf eine magnetische Basis für die In-situ-Datenerfassung an Standard-Goniometer-basierten Strahllinien gelegt werden. Für die Erfassung der Umgebungstemperaturdaten wird die COC-Folie vor dem Experiment entfernt und nur die 21 m dicke Polyimidfolie trägt zur Hintergrundstreuung bei, was in diesem Fall minimal ist. Diese Beispiele bilden nur einen kleinen Bruchteil der laufenden Forschung und die Vielzahl von vielseitigen Mikrochips, die für die Röntgenproteinkristallographie entwickelt wurden.
Die Dialyseproteinkristallisationsmethode ist jedoch in der Mikrofluidik nicht weit verbreitet. Dialyse ist eine diffusionsbasierte Methode, die auf den Ausgleich der Niederschlagskonzentration durch eine halbdurchlässige Membran abzielt, um sich der Nominalkonzentration für die Proteinkristallisation zu nähern und eine präzise und reversible Kontrolle der Kristallisationsbedingungen zu ermöglichen24. Der Molecular Weight Cut-Off (MWCO) der halbdurchlässigen Dialysemembran kann je nach Molekulargewicht des Makromoleküls und den Niederschlagsmitteln gewählt werden, um die Diffusion kleiner Niederschlagsmoleküle zu ermöglichen und gleichzeitig das von Interesse beinterestte Makromolekül beizubehalten. Aufgrund der Reversibilität des Dialyseprozesses kann es in Kombination mit temperaturgeregelter Temperaturregelung verwendet werden, um Die Keimbildung und das Kristallwachstum unabhängig voneinander zu entkoppeln und zu optimieren37 für die Untersuchung von Phasendiagrammen, indem die Niederschlagskonzentration verändert wird, während dieselbe Proteinprobe verwendet wird. Die Integration von Membranen in die Mikrofluidik wird von de Jong et al.38 überprüft und die Fallstudien in der Biologie, die Dialyse in Mikrochips implantieren, können hauptsächlich in Probenvorbereitungs-, Konzentrations- oder Filtrationsanwendungen39,40,41,42 oder zellbezogene Studien43,44aufgeführt werden. Pervaporation durch PDMS wurde von Shim et al.37 verwendet, um die Keimbildung und das Wachstum von Xylanase unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Das Wasser durchdrang die 15 m dicke PDMS-Membran in das Proteinreservoir des mikrofluidischen Geräts und veränderte anschließend das Protein und die Niederschlagskonzentration.
Das von Junius et al.19 ,45 entwickelte Protokoll zur Herstellung eines mikrofluidischen Chips, der sowohl für die On-Chip-Proteinkristallisation über Mikrodialyse als auch für in situ-Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur kompatibel ist, wird vorgestellt. Das Protokoll für die Gerätefertigung ist direkt von der Pionierarbeit von Studer und Kollegen12,46 für mikrogemusterte Aufkleber aus fotohärtigem Thiolenharz NOA 81 inspiriert, die handelsübliche Membranen unter Verwendung von Soft-Impressum-Lithographie einbetten. Eine innovative Modifikation der Methode führte zu Mikrochips, die den Einsatz von Mikrodialyse ermöglichten, um die experimentellen Parameter für das On-Chip-Wachstum von Proteinkristallen genau zu überwachen und zu kontrollieren und gleichzeitig die Vorteile der Mikrofluidik zu nutzen, wie z. B. den reduzierten Verbrauch von Proteinproben pro Experiment (<1 L). In einer früheren Arbeit wurden die Prinzipien der Dialyse, die auf ein Makro-Skalensystem (typisches Volumen >20 L) zum Screening und zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen durch Kartierung temperaturüberwindungsbedingter Konzentrationsphasendiagramme angewendet wurden,47demonstriert. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Herstellung von Dialyse-Mikrochips mit regenerierten Cellulose (RC) Dialysemembranen verschiedener MWCO beschrieben, um Kristallisationstests auf DemChip und in situ Röntgenbeugungsdaten zu verarbeiten. Die Materialien, die die Mikrochips umfassen, wurden auf ihre Transparenz gegenüber Röntgenstrahlen19 untersucht und die Geräte können direkt vor dem Röntgenstrahl für Raumtemperatur-In-situ-Beugungsexperimente eingestellt werden, ohne die manuelle Handhabung und die Minimierung des Abbaus empfindlicher Proteinkristalle. In einer Fallstudie wurden Hühnerei-weiße Lysozymkristalle über Mikrodialyse, die eine gleichmäßig große Population erzeugt, auf Dem Chip angebaut. Der Mikrochip wurde dann vor dem Röntgenstrahl mit einem 3D-gedruckten Stütze19 montiert und komplette In-situ-Beugungsdatensätze wurden bei Raumtemperatur aus mehreren isomorphen Kristallen gesammelt, was das hohe Potenzial und die Relevanz der Chips für Synchromtron-Seriellkristallographiestudien an anspruchsvollen makromolekularen Zielen demonstriert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von reproduzierbaren und kostengünstigen mikrofluidischen Geräten, die die gesamte Pipeline für kristallisierende Proteine auf dem Chip mit der Dialysemethode abdecken und in situ Einkristall- oder serielle Kristallographieexperimente bei Raumtemperatur ermöglichen. Das Protokoll beschreibt den Herstellungsprozess der Mikrochips, die Manipulation der On-Chip-Kristallisationsexperimente und die Behandlung der in situ gesammelten Röntgenbeugungsdaten für die strukturelle Aufklärung der Proteinprobe. Das Hauptmerkmal dieses Mikroherstellungsverfahrens liegt in der Integration einer kommerziell erhältlichen, halbpermeablen regenerierten Zellulosedialysemembran zwischen zwei Schichten des Chips. Die Molekulargewichtsabschaltung der eingebetteten Membran variiert je nach Molekulargewicht des Makromoleküls und den Niederschlagsfaktoren. Das Gerät nutzt die Vorteile der mikrofluidischen Technologie, wie z. B. die Verwendung von Kleinsten von Proben (<1 L) und die Feinabstimmung über Transportphänomene. Der Chip koppelte sie mit der Dialysemethode, die eine präzise und reversible Kontrolle über den Kristallisationsprozess bietet und kann zur Untersuchung von Phasendiagrammen von Proteinen auf der Mikroliterskala verwendet werden. Das Gerät wird mit einem photohärierbaren Thiolenharz mit weicher Impressumslithographie auf einem optisch transparenten polymeren Substrat gemustert. Darüber hinaus wurde die Hintergrundstreuung der Materialien, die die Mikrochips bilden und Hintergrundgeräusche erzeugen, ausgewertet, wodurch der Chip für In-situ-Röntgenbeugungsexperimente kompatibel gemacht wurde. Sobald Proteinkristalle auf dem Chip bis zu einer angemessenen Größe und Gleichmäßigkeit der Bevölkerung angebaut werden, können die Mikrochips mit Hilfe eines 3D-gedruckten Halters direkt vor dem Röntgenstrahl montiert werden. Dieser Ansatz geht die Herausforderungen an, die sich aus der Verwendung von Kryoprotektoren und der manuellen Ernte in konventionellen Proteinkristallographieexperimenten auf einfache und kostengünstige Weise stellen. Komplette Röntgenbeugungsdatensätze aus mehreren isomorphen Lysozymkristallen, die auf dem Chip angebaut wurden, wurden bei Raumtemperatur zur Strukturbestimmung gesammelt.

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Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

In diesem Papier wird das Herstellungsprotokoll von mikrofluidischen Chips erläutert, das für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Dialysemethode und in situ Röntgenbeugungsexperimenten entwickelt wurde. Der Mikroherstellungsprozess ermöglicht es, eine semipermeable regenerierte Zellulosedialysemembran mit einem beliebigen Molekulargewichts-Cut-off zwischen zwei Schichten des Chips zu integrieren.

Kristallisation von Proteinen auf Chip durch Mikrodialyse für In Situ-Röntgenbeugungsstudien

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Dieses Papier beschreibt das Herstellungsprotokoll von mikrofluidischen Chips, das für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Dialysemethode und in situ Röntgenbeugungsexperimenten bei Raumtemperatur entwickelt wurde. Einer der Hauptvorteile dieser Mikrochips ist die Wahl der Fertigungsmaterialien, wodurch die Chips für die Erfassung von In-situ-Röntgenbeugungsdaten bei Raumtemperatur kompatibel sind. Die On-Chip-Kristallisationsexperimente erfordern kleine Mengen der Proteinprobe, wodurch die Gesamtkosten für die Arbeit mit diesen hochwertigen Makromolekülen reduziert werden.Die On-Chip-Kristallisation eliminiert auch die manuelle Ernte der empfindlichen Proteinkristalle, die häufig in Kombination mit Kryokühlung bei konventionellen Kristallographieexperimenten angewendet werden. Darüber hinaus verwenden unsere Mikrochips die Mikrodialyse zur Proteinkristallisation, bei der es sich um eine diffusionsbasierte Methode handelt, die darauf abzielt, die Niederschlagskonzentration durch eine halbdurchlässige Membran zu ausdemaieren, um sich der cromulenten Konzentration für die Proteinkristallisation zu nähern, und eine präzise und reversible Kontrolle über die Kristallisationsbedingungen ermöglicht. Mikrodialyse in Kombination mit Temperaturregelung kann verwendet werden, um die Keimbildung vom Kristallwachstum zu entkoppeln, um Phasendiagramme zu untersuchen, indem die Niederschlagskonzentration während der Verwendung derselben Proteinprobe geändert wird.Zuerst bereiten 50 Gramm PDMS Silikonbasis und es ist Aushärtungsmittel in einem 10 zu einem Masse Verhältnis. Mischen Sie die beiden Zutaten in einem Becher mit einem Spachtel. Nach dem Mischen die Mischung in eine Vakuumkammer geben, um alle Luftblasen zu entfernen.Legen Sie 25 Gramm des vorgemischten PDMS in den ersten SU8, um die Muster des mikrofluidischen Kanals und der Säulen bis zu einer Höhe von etwa fünf Millimetern zu beherrschen. Dann gießen Sie die restlichen 25 Gramm des PDMS in den zweiten SU8-Master, der nur die Muster der Säulen enthält. Die beiden PDMS-Schichten in einem Ofen bei 338 Kelvin für eine Stunde aushärten.Schneiden Sie die ausgehärteten PDMS-Schichten um die Muster der SU8-Master mit einem Skalpell und schälen Sie die PDMS-Formen vorsichtig von den Silikon-Meistern ab. Platzieren Sie die PDMS-Form, die sowohl die Kanäle als auch die Säulen auf einem starren Mikroskopglasschlitten mit nach oben gerichteten Mustern zeigt. Schneiden Sie ein kleines Stück regenerierte Zellulose-Dialysemembran, um die zentrale Säule der PDMS-Form zu bedecken, die als Proteinkammer konzipiert ist.Der Molekulargewichts-Cutoff der Dialysemembran wird entsprechend dem Molekulargewicht der Proteinprobe und den Niederschlagsfaktoren der Kristallisationslösung gewählt. Dann das trockene Stück der regenerierten Zellulosedialysemembran sorgfältig trennen. Schneiden Sie ein kleines Stück der abgetrennten Dialysemembran.Die Größe dieses Membranstücks hängt vom Design des Chips ab. Und es hängt speziell von den Dimensionen der zentralen Säule ab. Legen Sie das Stück der Dialysemembran auf die zentrale Säule der PDMS-Form, die auf dem Glasschlitten mit seiner Säule und den nach oben gerichteten Kanälen gestützt wird.Dann legen Sie die zweite PDMS-Form mit nur den nach unten gerichteten Säulen auf die PDMS-Form, die bereits auf der Glasrutsche unterstützt wird. Richten Sie alle Säulen der beiden PDMS-Formen aus. Das Stück der regenerierten Zellulosedialysemembran ist zwischen den beiden zentralen Säulen der PDMS-Formen eingeklemmt.Dieser Schritt des Herstellungsverfahrens kann unter einem optischen Mikroskop oder einfach durch eine sorgfältige Inspektion der Ausrichtung aller Säulen durchgeführt werden. Legen Sie die Baugruppe in eine Vakuumkammer und entigelten Sie 30 Minuten lang, um die eingeschlossenen Luftblasen innerhalb der PDMS-Formen zu entfernen und das Einsetzen des fotohärierbaren NOA-Harzes zu verbessern, das im nächsten Schritt dieses Protokolls beschrieben wird. Entfernen Sie die Baugruppe aus der Vakuumkammer und füllen Sie den leeren Raum zwischen den beiden PDMS-Formen mit dem photohärierbaren Thiolin-basierten Harz, NOA 81, durch Kapillarimbibition.Tragen Sie das Harz auf drei der vier Seiten der Baugruppe auf. Legen Sie die Baugruppe in einen Querlinker und härten Sie das NOA-Harz aus, indem Sie mit einer kollimierten UV-Lampe von 35 Milliwatt pro Quadratzentimeter acht Sekunden lang UV-Licht aussetzen. Schneiden Sie ein 175 Mikrometer dickes PMMA-Stück in die Standardabmessungen eines Mikroskopglasschlittens und schälen Sie den Kunststoffschutz von jeder Seite des PMMA-Stücks ab.Sobald die erste UV-Belichtung abgeschlossen ist, entfernen Sie die obere PDMS-Form mit einem teilweise vernetzten NOA-Harz, das darauf aufgeklebt ist, aus der unteren PDMS-Form und dem Glasschlitten. Drücken Sie vorsichtig die Montage der oberen PDMS-Form und des teilweise ausgehärteten NOA-Harzes auf das PMMA-Stück. Legen Sie die neue Baugruppe in den Verkreuzer und härten Sie das NOA-Harz 60 Sekunden lang durch UV-Licht ein.Entfernen Sie vorsichtig die obere PDMS-Form. Der Dialysechip aus dem vollständig verklinken NOA-Harz, das eine regenerierte Zellulose-Dialysemembran einbettet und auf einem PMMA-Stück unterstützt wird, ist fertig. Verkleben Sie handelsübliche Steckverbinder an den Ein- und Auslasspunkten des mikrofluidischen Kanals mit schnellem Epoxidkleber.Wählen Sie für die Flüssigkeitshandhabung den Durchmesser der PTFE-Rohre basierend auf der Größe der Steckverbinder aus. Die Rohre werden für die Einführung der Kristallisationslösung innerhalb des Fluidkanals des Dialysechips verwendet. Pipette manuell ein Tröpfchen der Proteinprobe im Proteinreservoir direkt auf der Dialysemembran.Das Volumen des Proteintröpfchens hängt vom Design des verwendeten Mikrochips ab. Und speziell hängt es vom Volumen der zentralen Säule ab, und es kann 0,1 oder 0,3 Mikroliter sein. Tragen Sie eine dünne Schicht Hochvakuumsilikonfett rund um das Proteinreservoir vorsichtig auf.Schneiden Sie ein kleines Stück PMMA und legen Sie es vorsichtig über die dünne Schicht des Silikonfetts. Schneiden Sie ein Stück Kapton-Band, groß genug, um das PMMA-Stück über dem Proteinreservoir zu bedecken und auf dem NOA-Chip um alle Kanten zu kleben. Die Proteinprobe wird im Reservoir verkapselt und der Chip kann für Kristallisationsexperimente verwendet werden.Bereiten Sie zunächst ca. 500 Mikroliter der Kristallisationslösung durch Mischen geeigneter Volumen des Puffers und der Niederschlagslösungen vor. Injizieren Sie die Kristallisationslösung im Punkt des Dialysechips durch die Fluidverbinder, entweder manuell mit der Spritze oder mit einem automatisierten druckbetriebenen System. Sobald der Fluidkanal mit der Kristallisationslösung gefüllt ist und keine Luft im Inneren eingefangen ist, versiegeln Sie die Ein- und Auslassöffnungen des Chips mit Parafilmband.Pipette das entsprechende Volumen der Proteinlösung innerhalb des Proteinreservoirs und verkapseln Sie die Proteinprobe, wie bereits beschrieben. Das Proteinkristallwachstum kann mit einer Digitalkamera visualisiert und aufgezeichnet werden. Für die Herstellung der Dialyse-Mikrochips haben wir optisch transparente und biologisch inerte Materialien ausgewählt, die eine hohe Verträglichkeit für In-situ-Röntgenbeugungsexperimente demonstrieren.Das Hintergrundrauschen, das von den Materialien erzeugt wird, die das Proteinfach des Chips, der sich im direkten Weg des Röntgenstrahls befindet, umfassen, wurde ausgewertet. Das Proteinfach besteht aus der regenerierten Zellulosedialysemembran, dem Kaptonband, und zwei PMMA-Schichten, von der eine als Substrat der Mikrochips und eine zur Verkapselung der Proteinprobe verwendet wird. In diesem Bild werden das Hintergrundrauschen des Kaptonbandes, der regenerierten Zellulosedialysemembran, der PMMA-Schicht und ihrer Montage dargestellt.Obwohl das fotohärtige Harz NOA den Hauptkörper der Mikrochips umfasst, ist es in diesen Messungen nicht enthalten, da es nicht Teil der Proteinkammer ist. Diffuse Ringe, die den Wechselwirkungen von Röntgenstrahlen mit den Materialien zugeschrieben werden, können für das Kapton-Band mit der Auflösung von weniger als vier Angstroms, dem PMMA zwischen vier bis acht Angstroms und der Dialysemembran zwischen vier und fünf Angstroms gesehen werden. Das gesamte Hintergrundrauschen, das durch den Chip erzeugt wird, wird hauptsächlich bei der Auflösung unter sechs Angstrom beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Behandlung von Lysozym-Beugungsdaten mit hoher Auflösung nicht beeinträchtigt wird.Die Mikrochips wurden vor dem Röntgenstrahl mit einer 3D-gedruckten Stütze montiert, die wir für In-situ-Röntgenbeugungsexperimente entwickelt haben, und es kann bis zu drei Chips gleichzeitig aufnehmen. Es wurden Experimente durchgeführt, um die Effizienz der Mikrochips zur On-Chip-Kristallisation modelllöslicher Proteine mit der Mikrodialysemethode zu bewerten. Lysozymkristalle wurden mit 293 Kelvin unter zwei verschiedenen Bedingungen angebaut.Die erste Kristallisationsbedingung enthielt 1,5 Molnatriumchlorid und 0,1 Molnatriumacetat. Die zweite Kristallisationsbedingung enthielt ein molares Natriumchlorid, 0,1 Mol-Natriumacetat und 30%Polyethylenglycol 400 und wurde ausgewählt, um die Kompatibilität der Mikrochips und der Mikrodialysemethode mit Niederschlagsmitteln mit hohem Molekulargewicht und viskosen Lösungen zu zeigen. Die Kristallisationsexperimente wurden unter statischen Bedingungen durchgeführt.Sobald Lysozymkristalle auf dem Mikrochip angebaut wurden, wurden sie für In-situ-Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur verwendet. Die Mikrochips wurden mit Hilfe der 3D-gedruckten Stütze an der Strahllinie montiert und komplette Röntgenbeugungsdatensätze aus zwei Lysozymkristallen gesammelt. Nach der Behandlung der Röntgenbeugungsdaten wurde die Elektronendichtekarte eines einzelnen Lysozymkristalls mit 1,95 Angstrom-Auflösung erhalten, wie abbildung A zeigt die Elektronendichtekarte, die mit 1,85 Angstroms Auflösung erhalten wurde.Nach dem Zusammenführen von zwei Datensätzen aus zwei verschiedenen Lysozymkristallen zeigen beide Elektrodichtekarten detaillierte Strukturinformationen, die durch in situ-Röntgenbeugungsexperimente gewonnen werden können, die direkt an den Dialyse-Mikrochips bei Raumtemperatur, aus einzelnen oder mehreren Proteinkristallen durchgeführt werden. Wir demonstrierten das Herstellungsverfahren für mikrofluidische Geräte, die für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Mikrodialysemethode entwickelt wurden, und in situ Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur. Wir verwendeten Fertigungsmaterialien mit hoher Röntgentransparenz, kompatibel für die In-situ-Proteinkristallographie.Die Beugungsdatenerfassung wird automatisiert mit hilfe einer 3D-gedruckten Stütze für die Chips, die direkt in makromolekularen Kristallographiestrahllinien montiert werden kann. Die Vielseitigkeit dieses Mikrochips ergibt sich aus der Verwendung von Mikrodialyse zur reversiblen Kontrolle der Kristallisationsbedingungen und zur Kartenphase mit geringem Proteinvolumen. Das Prototyping des Gerätes ist einfach und ermöglicht die Herstellung von bis zu 30 Mikrochips an einem Tag in einem Reinraum mit relativ preiswerten Materialien.Wir erwarten, dass diese Eigenschaften der Chips für serielle Röntgenkristallographie-Studien von anspruchsvolleren Proteinzielen verwendet werden können.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Forschung

Chemie

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Dynamische elektrochemischen Messung von Chlorid-Ionen

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

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The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

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Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

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Elementar-Sensitive Detektion der Chemie in Batterien durch weiche Röntgenabsorptionsspektroskopie und resonanten unelastische Röntgenstreuung

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The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...