Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

MBS מכיר בתמיכת ה-MI / CNRS במסגרת ההתקשרות מכשור במגבלות 2014-2015. ניו ג'רזי מכירה בתוכנית הבינלאומית לחקר הדוקטורט (Irtelis) של CEA עבור מלגת הדוקטורט. MBS ו-SJ מאשרים מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקי-קירי מספר 722687. MBS, SJ ו- NJ מודים ל- LIPhy (UGA) על הקמת החדר הנקי לניסויים במיקרו-פשיון. IBS מכיר בהשתלבות במכון המחקר הבינתחומי של גרנובל (IRIG, CEA).

למחברים אין מה לחשוף.

מכשיר מיקרופלואידי פותח להתגבשות חלבונים על שבב בשיטת המיקרו-דיאליזה ובניסויי עקיפת קרני רנטגן במקום בטמפרטורת החדר. שבבי NOA 81 המשלבים ממברנות דיאליזה של RC של כל MWCO על מנת להשתמש במיקרו-דיאליזה להתגבשות חלבונים על השבב יכולים להיות מפוברקים. נעשה שימוש בחומרי ייצור בעלי שקיפות גבוהה יחסית של קרני רנטגן, מה שהפך את השבבים לתואמים לקריסטלוגרפיה של חלבון situ. חומרי הייצור המרכיבים את התא להתגבשות חלבונים של המכשיר (PMMA, Kapton, קרום דיאליזה RC) הוערכו כדי ליצור רעשי רקע נמוכים. באופן ספציפי, רעש הרקע שנוצר על ידי שבב הדיאליזה נצפתה בעיקר ברזולוציה נמוכה (> 6 Å) ואינה משפיעה על הטיפול בנתוני עקיפה ברזולוציה גבוהה של גבישי lysozyme הגדולים הנדרשים לקביעת מבנה החלבון. האוטומציה של איסוף הנתונים מוגברת באמצעות תמיכה מודפסת בתלת-ממד שניתן להתקין ישירות בקרני קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית ולשאת עד שלושה שבבים בו-זמנית. בדרך זו, קציר ידני ומניפולציה של גבישי חלבון שביר נמנע. יתר על כן, איסוף הנתונים מתרחש בטמפרטורת החדר, הימנעות הצורך cryoprotection אשר יכול להיות קשור לשינויים קונפורמיים ממבנה החלבון המקומי2,3.
השימוש במיקרו-דיאליזה כשיטה לגידול גבישים על השבב מאפשר לנטר ולשלוט במדויק בתהליך ההתגבשות. כפי שנדון בהקדמה, רוב שיטות התגבשות החלבון הקונבנציונליות יושמו באמצעות מכשירים מיקרופלואידיים11,14. עם זאת, היתרונות של דיאליזה להתגבשות חלבון עדיין לא נוצלו במלואם במיקרומטרי. מיקרודיאליזה על השבב מספקת את האפשרות ללמוד דיאגרמות שלב ולבצע סינון ואופטימיזציה של תנאי התגבשות עם אותה דגימת חלבון19. עבור אבות הטיפוס המוצגים בעבודה זו, צריכת החלבון לכל שבב מוגבלת עד 0.1 או 0.3 μL. בהתבסס על העבודה הניסיונית עד כה, השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול אינם נובעים מהליך הייצור של השבבים אלא מתהליך ההתגבשות. פרוטוקול הייצור כולל שלבים רבים אך הוא פשוט ומאפשר ייצור של מכשירים רבים (20 עד 30 שבבים) ביום אחד בחדר הנקי, עם חומרים זולים יחסית. עם זאת, התגבשות על השבב של חלבונים יכולה להיות הליך עדין בשל האופי הסטוקסטי המהותי של התגרענות וצמיחת הגביש, במיוחד במיקרומטרי. מקרה מבחן תואר, שבו תנאים מבוססים שימשו להתגבשות של lysozyme שהניב חזק, גבישים מוגדרים היטב מתאים באיסוף נתונים עקיפת רנטגן situ. עם זאת, קשיים עשויים להתעורר על ידי שימוש ביעדי חלבון מאתגרים יותר, כגון חלבוני ממברנה, שבהם מדיום ההתגבשות הרבה יותר מסובך, דיאגרמות פאזה אינן ידועות ותנאי התגבשות עובדים היטב עדיין אינם מבוססים היטב. שבב הדיאליזה מציע את האפשרות להתעלות על קשיים אלה וללמוד דיאגרמות שלב על השבב, מבלי להיפטר מדגם החלבון היקר ולעתים קרובות יקר, על ידי החלפת פתרון התגבשות בתוך הערוץ microfluidic.
הרבגוניות של המכשירים המיקרופלואידיים נובעת מניצול מיקרו-דיאליזה להתגבשות חלבונים על-שבב כדי לשלוט באופן הפיך בתנאי התגבשות ולמפות דיאגרמות שלב מגוונות של ריכוז וטמפרטורה באמצעות נפח חלבון נמוך. יתר על כן, המכשיר תואם בניסויים עקיפת רנטגן situ ואת אב טיפוס של המכשירים הוא זול ומהיר. ניתן לגדל על השבב גבישים איסומורפיים רבים של חלבונים מסיסים וממברנה (כהכנה) וצפויים להשתמש בכל התכונות הללו למחקרי קריסטלוגרפיה סדרתיים של קרני רנטגן של מטרות חלבון מאתגרות במתקני סינכרוטרון ו- XFEL. לבסוף, ביצוע על שבב ובמחקרים שנפתרו בזמן situ היא אפשרות עתידית שיכולה להיות עניין משמעותי לקהילה הקריסטלוגרפית. לכן, על ידי גידול גבישים על שבב הדיאליזה והכנסת ריאגנטים לתוך הערוץ המיקרופלואידי, או באופן ידני (באמצעות מזרק) או באופן אוטומטי (עם מערכת נוזל בקרת לחץ או משאבת מזרק), המאמצים העתידיים יתמקדו להוכיח כי השבבים microfluidic ניתן להשתמש בהצלחה כדי להפעיל ניסויים שנפתרו בזמן על קרני synchrotron.

הבהרת המבנה התלת מימדי (3D) של מקרומולקולות ביולוגיות היא מרדף בלתי פוסק בביולוגיה מבנית שבה קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן נותרה טכניקת החקירה העיקרית. היא ביקשה לפענח את הפרטים המבניים של מקרומולקולות מורכבות, כגון חלבונים, במטרה להקל על הבנת מנגנוני הפעולות שלהם ומעורבותם בתפקודים ביולוגיים שונים. מקורות רנטגן רבי עוצמה בלייזרים נטולי סינכרונים ורנטגן (XFELs) מספקים את כל הכלים הדרושים לתובנה מעמיקה יותר על מבנה החלבונים ברזולוציה אטומית קרובה. למרות היתרונות שמגיעים יחד עם השימוש בצילומי רנטגן למחקרים מבניים, קיימות מגבלות מהותיות לקרינת רנטגן ולתהליך ההתגבשות עצמו. נזק לקרינה שנגרם על ידי שטף רנטגן גבוה וזמני חשיפה ארוכים של גביש החלבון מול קרן הרנטגן הם פרמטרים מגבילים כי crystallographers צריך לעלות באמצעות קירור קריוגני1. עם זאת, מציאת תנאי ההקפאה האופטימליים יכולה להיות מייגעת שכן שינויים קונפורמיים ממבנה החלבון המקומי או חפצים ניתן להסתיר2,3. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מצביעים על כך ביצוע ניסויים עקיפה בטמפרטורת החדר מוביל נזק קרינה ספציפי נמוךיותר 4. צוואר בקבוק נוסף בביולוגיה מבנית הוא רכישת גבישים מפוזרים היטב בגודל מספיק5. גבישים קטנים קלים יותר לייצור, במיוחד במקרה של חלבוני ממברנה, אך רגישים יותר לנזקי קרינה גם בתנאי cryocooling מכיוון שמינוןקרינהגבוה חייב להיות מופנה בנפח קטן יותר בהשוואה למקרה של גבישי חלבון גדולים יותר 6 . הגישה החדשה של קריסטלוגרפיה סדרתית7,8 ב synchrotrons ו XFELs יכול לעקוף את הריסונים של נזקי קרינה באותו זמן לנצל גבישים קטנים יותר (200 ננומטר עד 2 מיקרומטר)7 על ידי מיזוג ערכות נתונים ממספר, גבישי חלבון איזומורפיים ומכוונים באופן אקראי ומרוויחים מההתקדמות הטכנולוגית הנלווית כגון פולסים femtosecond, זמני חשיפה קצרים יותר וקרני רנטגן ממוקדות מיקרו5,7,9,10.
טכנולוגיה מיקרופלואידית היא בעלת ערך לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ומציגה יתרונות רבים להתגבשות מקרומולקולות ביולוגיות ולחקירה המבנית שלהן. ביצוע ניסויי התגבשות במכשירים מיקרופלואידיים דורש כמויות קטנות של דגימת חלבון, ובכך מגביל את עלות הייצור של מקרומולקולות ביו בעלות ערך גבוה אלה ומאפשר סינון תפוקה גבוהה ואופטימיזציה של תנאי התגבשות רבים. יתר על כן, יחס שטח הפנים הגדול הטבוע בנפח בקנה מידה מיקרופלואידי ותופעות תחבורה מוגבלות דיפוזיה מאפשרים שליטה עדינה על זרימות וטמפרטורה או שיפוע ריכוז11,12,13,14, עיבוד התקנים מיקרופלואידיים המתאימים לגידול גבישים בגודל אחיד ולחקור דיאגרמות שלב15,16,17,18,19. יתר על כן, כלים מיקרופלואידיים מציגים פוטנציאל ייחודי להתמודד עם משוכה נוספת בקריסטלוגרפיה של חלבונים, שהיא משלוח הדגימה, והצורך לטפל ולקצור גבישי חלבון לפני השימוש בהם לניסויי עקיפת קרני רנטגן. שיטת השבב ובקריסטלוגרפיית רנטגן situ מבטלת את מניפולציית הגביש ואת ההידרדרות הפוטנציאלית של איכות הגביש לפני איסוף הנתונים. מגוון רחב של שבבים מיקרופלואידיים התואמים לקריסטלוגרפיה של חלבון רנטגן situ תוכננו, פותחו ונבדקו על ידי קבוצות מחקר רבות המתמודדות עם המגבלות הקשורות הנובעות מאופי חומרי המיקרו-פבריקציה והאינטראקציות שלהם עם צילומי רנטגן14,19,20,21,22,23. חומרי הייצור חייבים להיות שקופים אופטית, אינרטיים ביולוגית ולהפגין שקיפות גבוהה לקרינת רנטגן ויחס אות לרעש אופטימלי במהלך איסוף הנתונים.
רוב שיטות ההתגבשות המיושמות בקריסטלוגרפיה קונבנציונלית של חלבונים24,25 יושמו גם בסולם המיקרופלואידי11,14 להתגבשות שבבים ובניתוח עקיפת קרני רנטגן. מנגנון מיקרופלואידי פשוט, היברידי או רב שכבתי המשלב דיפוזיה אדים26, אידוי27, דיפוזיה ממשק חינם (FID)28, microbatch26, או אפילו זריעה29 שימשו כדי לגבש חלבונים מסיסים קרום. סינון תפוקה גבוהה ואופטימיזציה של תנאי התגבשות ניתן להשיג30,31 ב מבוסס היטב32, droplet מבוסס33, או שסתום מופעל34 התקנים. במקום ניסויי עקיפת קרני רנטגן של מטרות חלבון מאתגרות בטמפרטורת החדר נערכו בשבבים מפוברק מחומרים שונים כגון PDMS (polydimethylsiloxane), COC (קופולימר אולפין מחזורי), PMMA (פולי (מתיל methacrylate))21,22,26,28,29, גרפן סרטים23, Kapton35, דבק אפוקסי6, או NOA (דבק אופטי נורלנד)19 ואת השקיפות של החומרים קרינת רנטגן ותרומתם לרעשי רקע הוערכו. יתר על כן, שבבים תוכננו כדי זוג in situ ואת אסטרטגיות איסוף נתונים סדרתיים בכלי אחד עבור ניסויים קריסטלוגרפיה חלבון רנטגן במקורות synchrotron23,35,36 ו XFELs7.
טמפרטורת החדר באיסוף נתוני situ יושמה גם בשיטות אספקה ומכשירים שונים. לדוגמה, Nogly et al.54 השתמשו במזרק שלב מעוקב ליפידי (LCP) כדי לחקור את המבנה של בקטריאורודופסין משאבת פוטון מונחה אור (bR) על ידי קריסטלוגרפיה femtosecond סדרתי (SFX) באמצעות מקור XFEL. מבנה הגביש של bR נפתר לרזולוציה של 2.3 Å, הממחישה את תאימותו של מזרק LCP עם קריסטלוגרפיה סדרתית שנפתרה בזמן (TR-SFX). בקסטר ואח '55 עיצב רשת מרובת גבישים בצפיפות גבוהה, מפוברק על ידי פלסטיק פוליקרבונט בעובי 100 או 200 מיקרומטר עם חורים חתוכים בלייזר בגדלים שונים. סרט פוליקרבונט נוסף בעובי 5 מיקרומטר ניתן לתקן לצד אחד של הרשת בעת שימוש במכשיר לניסויי התגבשות ישיבה או תלייה. רשת זו בצפיפות גבוהה ניתן להשתמש בדרכים רבות כמו גבישים ניתן לטעון ישירות על היציאות של המכשיר או גבישים ניתן לגדל על המכשיר על ידי דיפוזיה אדים או שיטת LCP. יתר על כן, הרשת יכולה להיות מותאמת בבסיס מגנטי סטנדרטי ומשמש באיסוף נתוני רנטגן situ בתנאים קריוגניים או טמפרטורת החדר. לאחרונה, Feiler et al.56 פיתחה מחזיק מדגם עבור מקרומולקולרי בקריסטלוגרפיה רנטגן situ בטמפרטורה קריוגנית והסביבה עם תרומה מינימלית רעש רקע. באופן ספציפי, המחזיק מורכב מתמיכה בפלסטיק, רדיד COC שקוף ונייר פולימיד מיקרופורי מובנה. הוא תוכנן להחליף את שקופיות הכיסוי הנפוצות להגדרת טיפות התגבשות, תוך מתן אפשרות למניפולציה במקום כגון השריית ליגנד, היווצרות מורכבת והגנה קריוגנית מבלי לפתוח את טיפת ההתגבשות או לטפל באופן ידני בגבישים. יתר על כן, מחזיק המדגם ניתן להסיר מלוח התגבשות והניח על בסיס מגנטי עבור באיסוף נתונים situ בקורות מבוססות goniometer סטנדרטי. לאיסוף נתוני טמפרטורת הסביבה, רדיד COC מוסר לפני הניסוי ורק רדיד פולימיד בעובי 21 מיקרומטר תורם לפיזור רקע, שבמקרה זה הוא מינימלי. דוגמאות אלה להלחין רק חלק קטן של המחקר המתמשך ואת שפע של שבבים רב תכליתי שפותחו עבור קריסטלוגרפיה חלבון רנטגן.
עם זאת, שיטת התגבשות חלבון הדיאליזה לא שולבה באופן נרחב בתוך microfluidics. דיאליזה היא שיטה מבוססת דיפוזיה שמטרתה שיווי משקל של ריכוז משקעים באמצעות קרום חדיר למחצה על מנת להתקרב לריכוז הנומינלי להתגבשות חלבונים ומאפשרת שליטה מדויקת והפית הפיכה על תנאי התגבשות24. ניתן לבחור את המשקל המולקולרי (MWCO) של קרום הדיאליזה החודר למחצה בהתאם למשקל המולקולרי של המקרומולקולה והמשקעים כדי לאפשר פיזור של מולקולות משקעים קטנות תוך שמירה על המקרומולקולה של העניין. בשל היפוך תהליך הדיאליזה, ניתן להשתמש בו בשילוב עם בקרת טמפרטורה כדי לנתק ולמטב את הגרעין ואת צמיחת הגביש באופן עצמאי37 לחקירת דיאגרמות שלב על ידי שינוי ריכוז המשקעים תוך שימוש באותה דגימת חלבון. שילוב של ממברנות microfluidics נבדק על ידי דה יונג ואח'38 ואת המקרים במחקרים ביולוגיים השתלת דיאליזה לתוך שבבים יכול להיות רשום בעיקר בהכנה מדגם, ריכוז או סינון יישומים39,40,41,42 או תא הקשורים מחקרים43,44. החדירה באמצעות PDMS שימשה את Shim et al.37 כדי לחקור את הגרעין והצמיחה של קסילנאז בתנאים שונים. מים חלחלו דרך קרום PDMS בעובי 15 מיקרומטר לתוך מאגר החלבון של המכשיר המיקרופלואידי, ולאחר מכן שינו את ריכוז החלבון והמשקעים.
הפרוטוקול שפותח על ידי Junius et al.19,45 לייצור שבב microfluidic תואם הן על השבב התגבשות חלבון באמצעות מיקרודיאליזה והן באתרו רנטגן עקיפה ניסויים בטמפרטורת החדר מוצג. הפרוטוקול לייצור המכשיר הוא בהשראת העבודה החלוצית שהושגה על ידי Studer ועמיתים לעבודה12,46 עבור מדבקות מיקרו בדוגמת של שרף מבוסס תיולן צילום NOA 81 הטמעה ממברנות זמינות מסחרית, באמצעות ליתוגרפיה חותם רך. שינוי חדשני של השיטה הביא שבבים המאפשרים שימוש במיקרודיאליזה כדי לנטר ולשלוט במדויק בפרמטרים הניסיוניים לצמיחה על השבב של גבישי חלבון ובו זמנית לנצל את היתרונות של microfluidics, כגון צריכה מופחתת של דגימות חלבון לכל ניסוי (<1 μL). בעבודה קודמת, העקרונות של דיאליזה להחיל על מערכת בקנה מידה מאקרו (נפח טיפוסי > 20 μL) עבור סינון ואופטימיזציה של תנאי התגבשות על ידי מיפוי דיאגרמות שלב ריכוז משקע טמפרטורה הודגמו47. בעבודה זו מתואר פרוטוקול לייצור שבבי דיאליזה המשלבים קרום דיאליזה תאית (RC) של MWCO שונים על מנת לבצע מבחני התגבשות על השבב ובאיסוף נתונים עקיפת קרני רנטגן. החומרים המרכיבים את השבבים הוערכו על השקיפות שלהם לצילומי רנטגן19 וניתן להגדיר את המכשירים ישירות מול קרן הרנטגן לטמפרטורת החדר בניסויי עקיפת situ, למעט הטיפול הידני ומזעור ההשפלה של גבישי חלבון שבירים. במחקר מקרה, גבישי lysozyme לבן ביצה תרנגולת גדלו על שבב באמצעות מיקרודיאליזה יצירת אוכלוסייה בגודל אחיד. השבב הורכב אז מול קרן הרנטגן עם תמיכה3D מודפס 19 והושלם בערכות נתונים עקיפה situ נאספו בטמפרטורת החדר מגבישים מרובים, isomorphous, המדגים את הפוטנציאל הגבוה ואת הרלוונטיות של השבבים למחקרים קריסטלוגרפיה סדרתית סינכרוטרון של מטרות מקרמולקולריות מאתגרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מכשירים מיקרופלואידיים הניתנים לשחזור וזול המכסים את כל הצינור לצורך התגבשות חלבונים על השבב בשיטת הדיאליזה ומתן אפשרות בניסויים בקריסטל יחיד או קריסטלוגרפיה סדרתית בטמפרטורת החדר. הפרוטוקול מפרט את תהליך הייצור של השבבים, את המניפולציה של ניסויי התגבשות על השבב ואת הטיפול באתרו אסף נתוני עקיפת רנטגן עבור ההבהרה המבנית של דגימת החלבון. התכונה העיקרית של הליך microfabrication זה טמון על שילוב של מסחרי זמין, קרום דיאליזה תאית מתחדשת למחצה בין שתי שכבות של השבב. המשקל המולקולרי של הממברנה המוטבעת משתנה בהתאם למשקל המולקולרי של המקרומולקולה והמשקעים. המכשיר מנצל את היתרונות של טכנולוגיה מיקרופלואידית, כגון שימוש בכמויות זעירות של דגימות (<1 μL) וכוונון עדין על תופעות תחבורה. השבב צירף אותם לשיטת הדיאליזה, המספקת שליטה מדויקת והפיכה על תהליך ההתגבשות וניתן להשתמש בה לבדיקת דיאגרמות פאזה של חלבונים בסולם המיקרוליטר. המכשיר מעוצב באמצעות שרף מבוסס ת'יולן פוטו-קורלן עם ליתוגרפיה של הטבעה רכה על מצע פולימרי שקוף אופטית. יתר על כן, פיזור הרקע של החומרים המרכיבים את השבבים ויצירת רעשי רקע הוערך מה שהופכים את השבב תואם בניסויי עקיפת קרני רנטגן. ברגע שגבישי חלבון גדלים על שבב עד לגודל הולם ואחידות אוכלוסין, השבבים יכולים להיות מותקנים ישירות מול קרן הרנטגן בעזרת מחזיק מודפס בתלת-ממד. גישה זו מטפלת באתגרים העולים משימוש בהקפאה וקצירה ידנית בניסויי קריסטלוגרפיה קונבנציונליים של חלבונים באופן קל וזול. ערכות נתונים מלאות של עקיפת קרני רנטגן מגבישי ליזוזים איסומורפיים מרובים הגדלים על שבב נאספו בטמפרטורת החדר לצורך קביעת מבנה.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

נייר זה מפרט את פרוטוקול הייצור של שבבים מיקרופלואידיים שפותחו להתגבשות חלבונים על שבב בשיטת הדיאליזה ובניסויי עקיפת קרני רנטגן. תהליך microfabrication מאפשר לשלב קרום דיאליזה תאית מתחדשת למחצה עם כל משקל מולקולרי מנותק, בין שתי שכבות של השבב.

התגבשות חלבונים על שבב על ידי מיקרודיאליזה עבור In Situ רנטגן עקיפה מחקרים

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

מאמר זה מתאר את פרוטוקול הייצור של שבבים מיקרופלואידיים שפותחו עבור התגבשות חלבונים על שבב בשיטת הדיאליזה ובניסויי עקיפת רנטגן situ בטמפרטורת החדר. אחד היתרונות העיקריים של שבבים אלה הוא הבחירה של חומרי ייצור, מה שהופכים את השבבים תואמים באיסוף נתונים עקיפת רנטגן situ בטמפרטורת החדר. ניסויי התגבשות על השבב דורשים כמויות קטנות של דגימת החלבון, מה שמפחית את העלות הכוללת של עבודה עם מקרומולקולות בעלות גבוהה אלה.התגבשות על השבב גם מבטלת את הקציר הידני של גבישי החלבון השבירים, המיושמים לעתים קרובות בשילוב עם קירור קריו במהלך ניסויי התגבשות קונבנציונליים. יתר על כן, השבבים שלנו משתמשים במיקרו-דיאליזה להתגבשות חלבונים, שהיא שיטה מבוססת דיפוזיה שמטרתה לייצב את ריכוז המשקעים באמצעות קרום חדיר למחצה, על מנת להתקרב לריכוז הקרומולנט להתגבשות חלבונים, ומאפשרת שליטה מדויקת והפיגור על תנאי ההתגבשות. מיקרו-דיאליזה בשילוב עם בקרת טמפרטורה יכולה לשמש לניתוק התגרענות מצמיחת גביש לצורך חקירת דיאגרמות פאזה, על ידי שינוי ריכוז המשקעים תוך שימוש באותה דגימת חלבון.ראשית להכין 50 גרם של בסיס סיליקון PDMS וזה ריפוי סוכן ביחס מסה 10-1. מערבבים את שני המרכיבים בקסה עם מרית. לאחר ערבוב, מניחים את התערובת בתא ואקום על מנת להסיר את כל בועות האוויר.שים 25 גרם של PDMS premixed לתוך SU8 הראשון לשלוט המכיל את הדפוסים של הערוץ microfluidic ואת העמודים, עד לגובה של כחמישה מילימטרים. לאחר מכן יוצקים את 25 גרם הנותרים של PDMS לתוך המאסטר השני SU8, המכיל רק את התבניות של העמודים. לרפא את שתי שכבות PDMS בתנור ב 338 קלווין במשך שעה אחת.חותכים את שכבות PDMS נרפא סביב הדפוסים של אדוני SU8 עם אזמל, בעדינות לקלף את תבניות PDMS מן אדוני סיליקון. הנח את תבנית ה- PDMS, הכוללת הן את הערוצים והן את העמודים על מגלשת זכוכית מיקרוסקופ נוקשה עם התבניות הפונות כלפי מעלה. חותכים חתיכה קטנה של קרום דיאליזה תאית מחדש על מנת לכסות את העמוד המרכזי של עובש PDMS, אשר נועד להיות תא החלבון.ניתוק המשקל המולקולרי של קרום הדיאליזה נבחר בהתאם למשקל המולקולרי של דגימת החלבון, והמשקעים של פתרון ההתגבשות. לאחר מכן להפריד בזהירות את החלק היבש של קרום דיאליזה תאית מחדש. חותכים חתיכה קטנה של קרום הדיאליזה המופרד.הגודל של חתיכת קרום זה תלוי בתכנון השבב. ובאופן ספציפי, זה תלוי בממדים של העמוד המרכזי. הפקד את חתיכת קרום הדיאליזה על העמוד המרכזי של תבנית PDMS, הנתמכת על מגלשת הזכוכית, כשעמודיה ותעלותיה פונים כלפי מעלה.לאחר מכן הניחו את תבנית ה-PDMS השנייה הכוללת רק את העמודים הפונים כלפי מטה, מעל תבנית ה-PDMS שכבר נתמכת בשקופית הזכוכית. יישרו את כל העמודים של שתי תבניות PDMS. פיסת קרום הדיאליזה התאית המחודשת דחוקה בין שני העמודים המרכזיים של תבניות PDMS.שלב זה של הליך הייצור יכול להתבצע תחת מיקרוסקופ אופטי או פשוט על ידי בדיקה חזותית בזהירות את היישור של כל העמודים. מניחים את ההרכבה בתא ואקום ומתייבשים במשך 30 דקות על מנת להסיר את בועות האוויר הלכודות בתוך תבניות ה- PDMS, וכדי לשפר את החדרת שארף ה- NOA הפוטו-קורי, המתואר בשלב הבא של פרוטוקול זה. מוציאים את ההרכבה מתא הוואקום וממלאים את החלל הריק בין שתי תבניות PDMS עם שרף מבוסס תיולין פוטו, NOA 81, על ידי imbibition נימי.החל את שף על שלושה מארבעת הצדדים של ההרכבה. מניחים את ההרכבה במקשר צולב ומרפאים את שרף ה- NOA על ידי חשיפה לאור UV למשך שמונה שניות, באמצעות מנורת UV קולימינציה של 35 מילי-ואט לסנטימטר מרובע. חותכים חתיכת PMMA בעובי 175 מיקרומטר בממדים הסטנדרטיים של מגלשת זכוכית מיקרוסקופ, ומקלפים את הגנת הפלסטיק מכל צד של פיסת PMMA.לאחר השלמת החשיפה הראשונה ל-UV, הסירו את תבנית ה-PDMS העליונה עם שף NOA מקושר חלקית תקוע עליו מתבנית ה-PDMS התחתונה ומשקופית הזכוכית. לחץ בעדינות על ההרכבה של תבנית PDMS העליונה ואת שף NOA נרפא חלקית על פיסת PMMA. מניחים את ההרכבה החדשה בקישור הנגדי ומרפאים שוב את שרף ה-NOA על ידי חשיפה לאור UV למשך 60 שניות.הסר בזהירות את תבנית ה- PDMS העליונה. שבב הדיאליזה העשוי משוחל NOA חוצה קישורים לחלוטין המטביע קרום דיאליזה תאית מחודשת ונתמך על פיסת PMMA מוכן. מחברים זמינים מסחרית בונד בנקודות ההטבעה והשקע של הערוץ המיקרופלואידי עם דבק אפוקסי מהיר.לטיפול בנוזלים, בחר את קוטר צינורות ה- PTFE בהתבסס על גודל המחברים. הצינורות משמשים להכנסת פתרון ההתגבשות בתוך הערוץ הנוזלי של שבב הדיאליזה. פיפטה ידנית טיפה של דגימת החלבון בתוך מאגר החלבון הממוקם ממש על קרום הדיאליזה.נפח טיפת החלבון תלוי בתכנון השבב שנמצא בשימוש. ובאופן ספציפי, זה תלוי בנפח של העמוד המרכזי, וזה יכול להיות 0.1 או 0.3 microliters. יש למרוח בזהירות שכבה דקה של שומן סיליקון ואקום גבוה מסביב למאגר החלבון.חותכים חתיכה קטנה של PMMA ומניחים אותה בעדינות מעל השכבה הדקה של גריז הסיליקון. חותכים חתיכה של סרט קפטון, גדול מספיק כדי לכסות את חתיכת PMMA ממוקם מעל מאגר החלבון להידבק על שבב NOA סביב כל הקצוות. דגימת החלבון נעטפת בתוך המאגר והשבב יכול לשמש לניסויי התגבשות.ראשית להכין כ 500 microliters של פתרון התגבשות על ידי ערבוב כמויות מתאימות של החיץ ואת פתרונות משקעים. הזרק את פתרון ההתגבשות בנקודה של שבב הדיאליזה דרך המחברים הנוזליים, או באופן ידני עם המזרק או עם מערכת מונעת לחץ אוטומטית. ברגע שהערוץ הנוזלי מתמלא בתמיסת ההתגבשות ואף אוויר לא נלכד בתוכו, אטמו את יציאות המפרצון והשקע של השבב עם סרט Parafilm.פיפטה את הנפח המתאים של תמיסת החלבון בתוך מאגר החלבון ולתמצת את דגימת החלבון כפי שכבר תואר. ניתן לדמיין את צמיחת גביש החלבון ולתעד אותו באמצעות מצלמה דיגיטלית. לייצור שבבי הדיאליזה, בחרנו בחומרים שקופים אופטיים ולא פעילים ביולוגית, המדגימים תאימות גבוהה לניסויי עקיפת קרני רנטגן.רעש הרקע שנוצר על ידי החומרים המרכיבים את תא החלבון של השבב, שנמצא בנתיב הישיר של קרן הרנטגן, הוערך. תא החלבון מורכב מממברנה דיאליזה תאית מחודשת, סרט קפטון, ושתי שכבות PMMA, אחת המשמשת כמצע של השבבים, ואחת המשמשת לאנקפסולציה של דגימת החלבון. בתמונה זו, מודגם רעש הרקע שנוצר על ידי קלטת Kapton, קרום דיאליזה תאית מחודשת, שכבת PMMA, ואת ההרכבה שלהם.למרות שהשורף הפוטו-מרפא NOA מהווה את הגוף העיקרי של השבבים, אינו נכלל במדידות אלה מכיוון שהוא אינו חלק מתא החלבון. טבעות מפוזרות המיוחסות לאינטראקציות של צילומי רנטגן עם החומרים ניתן לראות עבור קלטת Kapton ברזולוציה נמוכה מארבעה אנגסטרום, PMMA בין ארבעה לשמונה אנגסטרום, ואת קרום הדיאליזה בין ארבע לחמש אנגסטרום. רעש הרקע הכולל שנוצר על ידי השבב נצפה בעיקר ברזולוציה נמוכה משש חרדות, המציין כי הטיפול בנתוני עקיפה ברזולוציה גבוהה lysozyme אינו מושפע.השבבים הורכבו מול קרן הרנטגן עם תמיכה מודפסת בתלת מימד שעיצבנו לניסויי עקיפת קרני רנטגן, והוא יכול להכיל עד שלושה שבבים בו זמנית. ניסויים נערכו על מנת להעריך את היעילות של השבבים להתגבשות על השבב של חלבונים מסיסים במודל בשיטת המיקרו-דיאליזה. גבישי lysozyme גדלו ב 293 קלווין בשני תנאים שונים.מצב ההתגבשות הראשון הכיל 1.5 נתרן כלורי טוחן, ו 0.1 נתרן אצטט טוחן. מצב ההתגבשות השני הכיל נתרן כלורי טוחן אחד, נתרן אצטט טוחן 0.1 ו-30% פוליאתילן גליקול 400, ונבחר להראות את תאימות השבבים ואת שיטת השבבים, עם משקעים בעלי משקל מולקולרי גבוה ופתרונות צמיגים. ניסויי ההתגבשות בוצעו בתנאים סטטיים.לאחר גבישי lysozyme גדלו על השבב, הם שימשו בניסויים עקיפת רנטגן situ בטמפרטורת החדר. השבבים הורכבו בקו הקרן בעזרת התמיכה המודפסת בתלת-ממד וערכות נתונים מלאות של עקיפת קרני רנטגן נאספו משני גבישי lysozyme. לאחר טיפול בנתוני עקיפת קרני הרנטגן, מפת צפיפות האלקטרונים של גביש lysozyme יחיד הושגה ברזולוציה של 1.95 חרדה, כפי שמוצג באיור A.Figure B מראה את מפת צפיפות האלקטרונים שהושגה ברזולוציה של 1.85 אנגסטרום.לאחר מיזוג שתי ערכות נתונים המתקבלות משני גבישי lysozyme שונים, שתי מפות צפיפות האלקטרו מראות מידע מבני מפורט שניתן להשיג על ידי ניסויי עקיפת רנטגן situ שנערך ישירות על שבבי דיאליזה בטמפרטורת החדר, מגבישי חלבון יחיד או מרובים. הדגמנו את הליך הייצור של מכשירים מיקרופלואידיים המיועדים להתגבשות חלבונים על שבב בשיטת המיקרו-דיאליזה, ובניסויי עקיפת קרני רנטגן במקום בטמפרטורת החדר. השתמשנו בחומרי ייצור עם שקיפות רנטגן גבוהה, תואמת לקריסטלוגרפיה של חלבון situ.איסוף נתוני עקיפה הוא אוטומטי עם שימוש בתמיכה מודפסת 3D עבור השבבים, כי ניתן להתקין ישירות בקווי קרן קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית. הרב-תכליתיות של שבב זה נובעת משימוש במיקרו-דיאליזה כדי לשלוט באופן הפיך בתנאי התגבשות ולמפות דיאגרמות פאזה באמצעות נפח חלבון קטן. אב-טיפוס של המכשיר הוא פשוט, המאפשר ייצור של עד 30 שבבים ביום אחד בחדר נקי, עם חומרים זולים יחסית.אנו מצפים כי תכונות אלה של השבבים ניתן להשתמש עבור מחקרים קריסטלוגרפיה רנטגן סדרתי של מטרות חלבון מאתגר יותר.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

מדידת אלקטרוכימיות הדינמית של יוני כלוריד

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

השתברות אבקת רנטגן שימור מדע: לקראת קביעת מבנה שיגרתית קריסטל של מוצרי קורוזיה על יצירות אמנות מורשה

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

לכימות רנטגן פלורסצנטיות נתונים באמצעות מפות

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

מדידות של מתאמים אלקטרונית לטווח ארוך במהלך הניסויים עקיפה הפמטו-שנייה מתבצע על Nanocrystals של Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

ספיגת מתכת חיוני של חיידקים גראם שליליים: רנטגן פלורסצנטיות, רדיואיזוטופים, ותא Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

זיהוי רגיש היסודות של הכימיה בסוללות דרך בליעה רכה רנטגן, רנטגן פלסטית תהודה פיזור

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

הכנת דגימות ביולוגיות לספקולציה בטמפרטורה קריוגנית באמצעות ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...