Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
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एमबीएस 2014-2015 की सीमा पर अनुबंध इंस्ट्रूमेंटेशन के तहत एमआई/सीएनआरएस के समर्थन को स्वीकार करता है । एनजे पीएचडी फैलोशिप के लिए सीईए के इंटरनेशनल डॉक्टोरल रिसर्च प्रोग्राम (Irtelis) को स्वीकार करता है । एमबीएस और एसजे मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते संख्या ७२२६८७ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन स्वीकार करते हैं । एमबीएस, एसजे, और एनजे माइक्रोफैब्रिकेशन प्रयोगों के लिए स्वच्छ कमरे स्थापना के लिए LIPHY (UGA) धन्यवाद। आईबीएस ग्रेनोबल के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान (IRIG, सीईए) में एकीकरण को स्वीकार करता है ।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

माइक्रोडायलिसिस विधि के साथ और कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विकसित किया गया है। एनओए 81 चिप्स किसी भी एमडब्ल्यूसीओ के आर सी डायलिसिस झिल्ली को एकीकृत करने के लिए ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए माइक्रोडायलिसिस का उपयोग करने के लिए निर्मित किया जा सकता है। अपेक्षाकृत उच्च एक्स-रे पारदर्शिता के साथ निर्माण सामग्री का उपयोग किया गया था, जो चिप्स को सीटू प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी में संगत प्रदान करता था। डिवाइस (पीएमएमए, काप्टन, आरसी डायलिसिस झिल्ली) के प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए डिब्बे की रचना करने वाली निर्माण सामग्री का मूल्यांकन कम पृष्ठभूमि शोर उत्पन्न करने के लिए किया गया था। विशेष रूप से, डायलिसिस चिप द्वारा उत्पन्न पृष्ठभूमि शोर मुख्य रूप से कम रिज़ॉल्यूशन (> 6 Å) पर मनाया जाता है और प्रोटीन संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक बड़े lysozyme क्रिस्टल के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवर्तन डेटा के उपचार को प्रभावित नहीं करता है। डेटा संग्रह का स्वचालन 3 डी मुद्रित समर्थन का उपयोग करके परिलक्षित होता है जिसे सीधे मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइंस में रखा जा सकता है और एक साथ तीन माइक्रोचिप्स तक ले जा सकता है। इस तरह, मैन्युअल कटाई और नाजुक प्रोटीन क्रिस्टल के हेरफेर से बचा जाता है। इसके अलावा, डेटा संग्रह कमरे के तापमान पर होता है, क्रायोप्रोटेक्शन की आवश्यकता से बचता है जो देशी प्रोटीन संरचना2,3से अनुरूप परिवर्तन से संबंधित हो सकता है।
क्रिस्टल ऑन-चिप विकसित करने की विधि के रूप में माइक्रोडायलिसिस का उपयोग क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया की सटीक निगरानी और नियंत्रण करने की अनुमति देता है। जैसा कि परिचय में चर्चा की गई है, अधिकांश पारंपरिक प्रोटीन क्रिस्टलीकरण विधियों को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों11, 14का उपयोग करके लागू किया गया है। हालांकि, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए डायलिसिस के फायदों का अभी तक माइक्रोस्केल पर पूरी तरह से दोहन नहीं किया गया था । ऑन-चिप माइक्रोडायलिसिस चरण आरेखों का अध्ययन करने और एक ही प्रोटीन नमूना19के साथ क्रिस्टलीकरण की स्थिति की स्क्रीनिंग और अनुकूलन करने की संभावना प्रदान करता है। इस काम में प्रस्तुत प्रोटोटाइप के लिए, प्रति चिप प्रोटीन की खपत ०.१ या ०.३ μL तक सीमित है । अब तक के प्रायोगिक कार्य के आधार पर, प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम चिप्स के निर्माण प्रक्रिया से नहीं बल्कि क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया से प्राप्त होते हैं । निर्माण प्रोटोकॉल में कई कदम शामिल हैं लेकिन यह सीधा है और अपेक्षाकृत सस्ती सामग्रियों के साथ, स्वच्छ कमरे में एक ही दिन में कई उपकरणों (20 से 30 चिप्स) के निर्माण को सक्षम बनाता है। हालांकि, प्रोटीन का ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण विशेष रूप से माइक्रोस्केल में नाभिक और क्रिस्टल विकास की आंतरिक स्टोचस्टिक प्रकृति के कारण एक नाजुक प्रक्रिया हो सकती है। एक केस स्टडी का वर्णन किया गया है, जहां lysozyme के क्रिस्टलीकरण के लिए अच्छी तरह से स्थापित स्थितियों का उपयोग किया गया था जो सीटू एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह में उपयुक्त मजबूत, अच्छी तरह से परिभाषित क्रिस्टल मिले थे। फिर भी, झिल्ली प्रोटीन जैसे अधिक चुनौतीपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों के उपयोग से कठिनाइयां उत्पन्न हो सकती हैं, जहां क्रिस्टलीकरण माध्यम बहुत अधिक जटिल है, चरण आरेख ज्ञात नहीं हैं और अच्छी तरह से काम करने वाली क्रिस्टलीकरण की स्थिति अभी तक अच्छी तरह से स्थापित नहीं है। डायलिसिस चिप केवल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के भीतर क्रिस्टलीकरण समाधान का आदान-प्रदान करके मूल्यवान और अक्सर महंगे प्रोटीन नमूने को निपटाने के बिना, इन कठिनाइयों को पार करने और चरण आरेखों को पार करने की संभावना प्रदान करती है।
माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की बहुमुखी प्रतिभा कम प्रोटीन की मात्रा का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण की स्थितियों और मानचित्र एकाग्रता और तापमान को अलग-अलग चरण आरेखों को नियंत्रित करने के लिए ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए माइक्रोडायलिसिस का शोषण करने से उपजी है। इसके अलावा, डिवाइस सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में संगत है और उपकरणों की प्रोटोटाइप सस्ती और तेजी से है। घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन (तैयारी में) के कई, आइसोमॉर्फस क्रिस्टल को ऑन-चिप उगाया जा सकता है और यह उम्मीद की जाती है कि इन सभी सुविधाओं का उपयोग सिंक्रोट्रॉन और एक्सफेल सुविधाओं पर चुनौतीपूर्ण प्रोटीन लक्ष्यों के धारावाहिक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। अंत में, ऑन-चिप और सीटू समय-हल किए गए अध्ययनों में प्रदर्शन करना भविष्य की संभावना है जो क्रिस्टलीय समुदाय के लिए महत्वपूर्ण रुचि हो सकती है। इसलिए, डायलिसिस चिप पर क्रिस्टल बढ़ रहा है और माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में अभिवात शुरू करके, या तो मैन्युअल रूप से (एक सिरिंज का उपयोग कर) या स्वचालित रूप से (एक दबाव नियंत्रण तरल पदार्थ प्रणाली या एक सिरिंज पंप के साथ), भविष्य के प्रयासों को साबित करने पर ध्यान केंद्रित करेंगे कि माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स सफलतापूर्वक सिंक्रोट्रॉन बीमलाइन पर समय का समाधान प्रयोगों को ट्रिगर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

यह प्रोटोकॉल डायलिसिस विधि के साथ प्रोटीन ऑन-चिप को क्रिस्टलाइज करने और कमरे के तापमान पर सीटू सिंगल-क्रिस्टल या सीरियल क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों में अनुमति देने के लिए पूरी पाइपलाइन को कवर करने वाले प्रजनन योग्य और सस्ती माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल में माइक्रोचिप्स की निर्माण प्रक्रिया, ऑन-चिप क्रिस्टलीकरण प्रयोगों में हेरफेर और सीटू में के उपचार ने प्रोटीन नमूने के संरचनात्मक स्पष्टीकरण के लिए एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र किया है। इस माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया की मुख्य विशेषता चिप की दो परतों के बीच में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, अर्धप्रतिमेणित पुनर्जनित सेल्यूलोज डायलिसिस झिल्ली के एकीकरण पर निहित है। एम्बेडेड झिल्ली का आणविक वजन कट-ऑफ मैक्रोमॉल्यूल और प्रीसिपिटेंट्स के आणविक वजन के आधार पर भिन्न होता है। डिवाइस माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के फायदों का फायदा उठाता है, जैसे नमूनों की मिनट वॉल्यूम (<1 माइक्रोल) का इस्तेमाल और ट्रांसपोर्ट की घटनाओं पर फाइन ट्यूनिंग । चिप ने उन्हें डायलिसिस विधि के साथ जोड़ा, क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया पर सटीक और रिवर्सिबल नियंत्रण प्रदान किया और माइक्रोलिटर पैमाने पर प्रोटीन के चरण आरेखों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। डिवाइस को ऑप्टिकली पारदर्शी पॉलीमेरिक सब्सट्रेट पर नरम छाप लिथोग्राफी के साथ फोटोकरेबल थिओलीन आधारित राल का उपयोग करके पैटर्न किया गया है। इसके अलावा, माइक्रोचिप्स रचना और पृष्ठभूमि शोर पैदा करने वाली सामग्रियों की पृष्ठभूमि बिखरने का मूल्यांकन सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के लिए चिप संगत प्रदान करने के लिए किया गया था। एक बार प्रोटीन क्रिस्टल एक पर्याप्त आकार और जनसंख्या एकरूपता तक चिप पर बड़े हो रहे हैं, माइक्रोचिप्स सीधे एक्स-रे बीम के सामने एक 3 डी मुद्रित धारक की सहायता से मुहिम शुरू की जा सकती है । यह दृष्टिकोण एक आसान और सस्ती तरीके से पारंपरिक प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों में क्रायोप्रोटेक्टेंट और मैनुअल हार्वेस्टिंग के उपयोग से बढ़ती चुनौतियों का समाधान करता है। संरचना निर्धारण के लिए कमरे के तापमान पर विकसित कई, आइसोमॉर्फोस lysozyme क्रिस्टल से पूर्ण एक्स-रे विवर्तन डेटा सेट एकत्र किए गए थे।

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Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

यह पेपर डायलिसिस विधि के साथ और सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में ऑन-चिप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए विकसित माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के निर्माण प्रोटोकॉल का विवरण देता है। माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया चिप की दो परतों के बीच किसी भी आणविक वजन कट-ऑफ के साथ एक अर्धप्रेमीजनित सेल्यूलोज डायलिसिस झिल्ली को एकीकृत करना संभव बनाती है।

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Chemistry

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