Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
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MBS riconosce il supporto dell'MI/CNRS nell'ambito del contratto Instrumentation ai limiti 2014-2015. NJ riconosce il Programma internazionale di ricerca di dottorato (Irtelis) del CEA per la Borsa di dottorato. MBS e SJ riconoscono i finanziamenti del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito della sovvenzione Marie Skłodowska-Curie numero 722687. MBS, SJ e NJ ringraziano LIPhy (UGA) per lo stabilimento della camera pulita per gli esperimenti di microfabbricazione. IBS riconosce l'integrazione nell'Istituto di Ricerca Interdisciplinare di Grenoble (IRIG, CEA).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

È stato sviluppato un dispositivo microfluidico per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della microdialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. È possibile fabbricare chip NOA 81 che integrano membrane di dialisi RC di qualsiasi MWCO al fine di utilizzare la microdialisi per la cristallizzazione delle proteine su chip. Sono stati utilizzati materiali di fabbricazione con una trasparenza dei raggi X relativamente elevata, rendendo i chip compatibili per la cristallografia proteica in situ. I materiali di fabbricazione che compongono il compartimento per la cristallizzazione proteica del dispositivo (PMMA, Kapton, membrana di dialisi RC) sono stati valutati per generare un basso rumore di fondo. In particolare, il rumore di fondo generato dal chip di dialisi è osservato principalmente a bassa risoluzione (> 6 Å) e non influisce sul trattamento dei dati di diffrazione ad alta risoluzione dei grandi cristalli di lisozima necessari per la determinazione della struttura proteica. L'automazione della raccolta dei dati viene amplificata utilizzando un supporto stampato in 3D che può essere montato direttamente in travi di cristallografia macromolecolare e trasportare fino a tre microchip contemporaneamente. In questo modo, si evita la raccolta manuale e la manipolazione dei fragili cristalli proteici. Inoltre, la raccolta dei dati avviene a temperatura ambiente, evitando la necessità di crioprotezione che può essere correlata a cambiamenti conformazionali dalla struttura proteicanativa 2,3.
L'uso della microdialisi come metodo per far crescere i cristalli su chip consente di monitorare e controllare con precisione il processo di cristallizzazione. Come discusso nell'introduzione, la maggior parte dei metodi convenzionali di cristallizzazione delle proteine sono stati implementati utilizzando dispositivi microfluidici11,14. Tuttavia, i vantaggi della dialisi per la cristallizzazione delle proteine non erano ancora stati pienamente sfruttati su scala micrometrica. La microdialisi su chip offre la possibilità di studiare diagrammi di fase ed eseguire lo screening e l'ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione con lo stesso campioneproteico 19. Per i prototipi presentati in questo lavoro, il consumo proteico per chip è limitato a 0,1 o 0,3 μL. Sulla base del lavoro sperimentale finora svolto, le fasi più critiche del protocollo non derivano dalla procedura di fabbricazione dei chip ma dal processo di cristallizzazione. Il protocollo di fabbricazione include molti passaggi, ma è semplice e consente la fabbricazione di numerosi dispositivi (da 20 a 30 chip) in un solo giorno nella camera pulita, con materiali relativamente economici. Tuttavia, la cristallizzazione su chip delle proteine può essere una procedura delicata a causa della natura stocastica intrinseca della nucleazione e della crescita cristallina, specialmente nella microscala. È stato descritto un caso di studio, in cui sono state utilizzate condizioni ben consolidate per la cristallizzazione del lisozima che ha prodotto cristalli robusti e ben definiti adatti per la raccolta di dati di diffrazione a raggi X in situ. Tuttavia, possono sorgere difficoltà dall'uso di obiettivi proteici più impegnativi, come le proteine di membrana, dove il mezzo di cristallizzazione è molto più complicato, i diagrammi di fase non sono noti e le condizioni di cristallizzazione ben funzionanti non sono ancora ben consolidate. Il chip di dialisi offre la possibilità di superare queste difficoltà e studiare diagrammi di fase su chip, senza smaltire il prezioso e spesso costoso campione proteico, semplicemente scambiando la soluzione di cristallizzazione all'interno del canale microfluidico.
La versatilità dei dispositivi microfluidici deriva dallo sfruttamento della microdialisi per la cristallizzazione delle proteine su chip al fine di controllare reversibilmente le condizioni di cristallizzazione e mappare la concentrazione e la temperatura vari diagrammi di fase utilizzando un basso volume proteico. Inoltre, il dispositivo è compatibile con esperimenti di diffrazione a raggi X in situ e la prototipazione dei dispositivi è economica e rapida. Numerosi cristalli isomorfi di proteine solubili e di membrana (in preparazione) possono essere coltivati su chip e si prevede che tutte queste caratteristiche possano essere utilizzate per studi di cristallografia seriale a raggi X di obiettivi proteici impegnativi presso impianti di sincrotrone e XFEL. Infine, l'esecuzione di studi su chip e in situ risolti nel tempo è una possibilità futura che potrebbe essere di notevole interesse per la comunità cristallografica. Pertanto, coltivando cristalli sul chip di dialisi e introducendo i reagenti nel canale microfluidico, manualmente (usando una siringa) o automaticamente (con un sistema fluido di controllo della pressione o una pompa a siringa), gli sforzi futuri si concentreranno sulla dimostrazione che i chip microfluidici possono essere utilizzati con successo per innescare esperimenti risolti nel tempo sulle linee di fascio di sincrotrone.

Chiarire la struttura tridimensionale (3D) delle macromolecole biologiche è una ricerca incessante nella biologia strutturale dove la cristallografia a raggi X rimane la principale tecnica di indagine. Applicato per svelare i dettagli strutturali delle macromolecole complesse, come le proteine, mira a facilitare la comprensione dei loro meccanismi di azione e il loro coinvolgimento in varie funzioni biologiche. Potenti sorgenti di raggi X ai sincrotroni e ai laser a raggi X a elettroni liberi (XFEL) forniscono tutti gli strumenti necessari per una visione più approfondita della struttura delle proteine a una risoluzione quasi atomica. Nonostante i vantaggi che si offrono con l'uso dei raggi X per gli studi strutturali, ci sono limitazioni intrinseche alla radiazione a raggi X e al processo di cristallizzazione stesso. I danni da radiazioni provocati dall'elevato flusso di raggi X e dai lunghi tempi di esposizione del cristallo proteico davanti al fascio di raggi X sono parametri restrittivi che i cristallografi devono superare utilizzando il raffreddamento criogenico1. Tuttavia, trovare le condizioni ottimali di crioraffreddamento può essere laborioso poiché i cambiamenti conformazionali dalla struttura proteica nativa o dagli artefatti possono esserenascosti 2,3. Inoltre, studi recenti indicano che l'esecuzione di esperimenti di diffrazione a temperatura ambiente porta a minori danni specifici da radiazioni4. Un altro collo di bottiglia nella biologia strutturale è l'acquisizione di cristalli ben diffratti con una dimensionesufficiente 5. I piccoli cristalli sono più facili da produrre, specialmente nel caso delle proteine di membrana, ma sono più suscettibili ai danni da radiazioni anche in condizioni di crioraffreddamento perché un'elevata dose di radiazioni deve essere diretta in un volume inferiore rispetto al caso di cristalli proteici più grandi6. Il nuovo approccio della cristallografia seriale7,8 ai sincrotroni e agli XFEL può aggirare i contenuti dei danni da radiazioni e allo stesso tempo sfruttare cristalli più piccoli (da 200 nm a 2 μm)7 fondendo set di dati da più, cristalli proteici isomorfi e orientati casualmente e approfittando dei progressi tecnologici associati come impulsi di femtosecondo, tempi di esposizione più brevi e fasci di raggi X micro-focalizzati5,7,9,10.
La tecnologia microfluidica è preziosa per la cristallografia a raggi X, che presenta molteplici vantaggi per la cristallizzazione delle macromolecole biologiche e la loro indagine strutturale. Condurre esperimenti di cristallizzazione in dispositivi microfluidici richiede piccoli volumi di campione proteico, vincolando quindi il costo di produzione di queste bio macromolecole di alto valore e facilitando lo screening ad alta produttività e l'ottimizzazione di numerose condizioni di cristallizzazione. Inoltre, l'intrinseco elevato rapporto superficie-volume su scala microfluidica e fenomeni di trasporto limitati alla diffusione consentono un controllo fine dei flussi e dei gradienti di temperatura o concentrazione11,12,13,14,rendendo dispositivi microfluidici adatti alla coltivazione di cristalli di dimensioni uniformi ed esplorando diagrammi di fase15,16,17,18,19. Inoltre, gli strumenti microfluidici mostrano un potenziale distintivo per affrontare un altro ostacolo nella cristallografia proteica, che è la consegna del campione, e la necessità di gestire e raccogliere cristalli proteici prima del loro uso per esperimenti di diffrazione a raggi X. Il metodo della cristallografia a raggi X su chip e in situ elimina la manipolazione dei cristalli e il potenziale deterioramento della qualità cristallina prima della raccolta dei dati. Una vasta gamma di chip microfluidici compatibili per la cristallografia proteica a raggi X in situ sono stati progettati, sviluppati e testati da molti gruppi di ricerca che affrontano le relative restrizioni derivanti dalla natura dei materiali di microfabbricazione e dalle loro interazioni con i raggi X14,19,20,21,22,23. I materiali di fabbricazione devono essere otticamente trasparenti, biologicamente inerti e dimostrare un'elevata trasparenza rispetto alle radiazioni a raggi X e un rapporto segnale-rumore ottimale durante la raccolta dei dati.
La maggior parte dei metodi di cristallizzazione applicati nella cristallografia proteicaconvenzionale 24,25 sono stati implementati anche sulla scala microfluidica11,14 per la cristallizzazione su chip e l'analisi di diffrazione dei raggi X in situ. Apparecchiature microfluidiche semplici, ibride o multistrato che incorporano diffusione del vapore26,evaporazione 27,diffusione dell'interfaccia libera (FID)28,microbatch26o persino semina29 sono state utilizzate per cristallizzare proteine solubili e di membrana. Lo screening ad alta produttività e l'ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazionepossono essere raggiunti 30,31 indispositivi 32,33basati su goccioline o azionati davalvole. In situ Esperimenti di diffrazione a raggi X di obiettivi proteici impegnativi a temperatura ambiente sono stati condotti in microchip fabbricati con vari materiali come PDMS (polidimetilossano), COC (copolimero olefine ciclico), PMMA (poli(metacrilato metile))21,22,26,28,29, pellicole di grafene23, Kapton35, colla epossidica6o NOA (Adesivo ottico Norland)19 e sono stati valutati la trasparenza dei materiali alle radiazioni a raggi X e il loro contributo al rumore di fondo. Inoltre, i microchip sono stati progettati per accoppiare le strategie di raccolta dei dati in situ e seriali in un unico strumento per esperimenti di cristallografia delle proteine a raggi X a sorgenti di sincrotrone23,35,36 e XFELs7.
La raccolta dei dati in situ a temperatura ambiente è stata implementata anche in vari metodi e dispositivi di consegna. Ad esempio, Nogly et al. La struttura cristallina di bR è stata risolta con la risoluzione 2.3 Å, dimostrando la compatibilità di un iniettore LCP con la cristallografia seriale femtosecondi risolta nel tempo (TR-SFX). 55 ha progettato una griglia multicristacrista con alta densità, fabbricata da una plastica policarbonato spessa 100 o 200 μm con fori tagliati al laser di varie dimensioni. Un ulteriore film di policarbonato spesso 5 μm può essere fissato su un lato della griglia quando si utilizza il dispositivo per esperimenti di cristallizzazione a goccia seduta o appesa. Questa griglia ad alta densità può essere utilizzata in diversi modi in quanto i cristalli possono essere caricati direttamente sulle porte del dispositivo o i cristalli possono essere coltivati sul dispositivo tramite diffusione del vapore o il metodo LCP. Inoltre, la griglia può essere regolata in una base magnetica standard e utilizzata per la raccolta di dati a raggi X in situ in condizioni criogeniche o a temperatura ambiente. Più recentemente, Feiler etal. Nello specifico, il supporto comprende un supporto in plastica, un foglio COC trasparente e un foglio di poliimmide strutturato microporosa. È stato progettato per sostituire i vetrini di copertura comunemente usati per impostare gocce di cristallizzazione, consentendo al contempo la manipolazione sul posto come l'ammollo del ligando, la formazione complessa e la protezione criogenica senza aprire la goccia di cristallizzazione o maneggiare manualmente i cristalli. Inoltre, il portacampioni può essere rimosso dalla piastra di cristallizzazione e posizionato su una base magnetica per la raccolta dei dati in situ su linee di fascio standard basate su goniometro. Per la raccolta dei dati sulla temperatura ambiente, il foglio COC viene rimosso prima dell'esperimento e solo la lamina di poliimmide spessa 21 μm contribuisce allo scattering di fondo, che in questo caso è minimo. Questi esempi compongono solo una piccola frazione della ricerca in corso e la moltitudine di microchip versatili sviluppati per la cristallografia proteica a raggi X.
Tuttavia, il metodo di cristallizzazione delle proteine della dialisi non è stato ampiamente incorporato nella microfluidica. La dialisi è un metodo basato sulla diffusione che mira all'equilibrazione della concentrazione del precipitante attraverso una membrana semi-permeabile al fine di avvicinarsi alla concentrazione nominale per la cristallizzazione proteica e consente un controllo preciso e reversibile sulle condizioni di cristallizzazione24. Il taglio del peso molecolare (MWCO) della membrana di dialisi semi-permeabile può essere scelto a seconda del peso molecolare della macromolecola e dei precipitanti per consentire la diffusione di piccole molecole precipitanti pur mantenendo la macromolecola di interesse. A causa della reversibilità del processo di dialisi, può essere utilizzato in combinazione con il controllo della temperatura per disaccoppiare e ottimizzare la nucleazione e la crescita del cristalloin modo indipendente 37 per lo studio dei diagrammi di fase alterando la concentrazione del precipitante mentre si utilizza lo stesso campione proteico. L'integrazione delle membrane in microfluidica è riesaminata da de Jong et al. La pervaporazioneattraverso il PDMS è stata utilizzata da Shim et al. L'acqua permeava attraverso la membrana PDMS spessa 15 μm nel serbatoio proteico del dispositivo microfluidico, alterando successivamente la concentrazione proteica e precipitante.
Viene presentato il protocollo sviluppato da Junius etal. Il protocollo per la fabbricazione del dispositivo si ispira direttamente al lavoro pionieristico svolto da Studer e colleghi12,46 per adesivi micro-fantasia di resina foto-polimerizzabile a base di tiolene NOA 81 incorporando membrane disponibili in commercio, utilizzando litografia a impronta morbida. Una modifica innovativa del metodo ha portato a microchip che hanno permesso l'uso della microdialisi per monitorare e controllare con precisione i parametri sperimentali per la crescita su chip dei cristalli proteici e allo stesso tempo sfruttare i vantaggi della microfluidica, come il ridotto consumo di campioni proteici per esperimento (<1 μL). In un lavoro precedente, sono stati dimostrati i principi di dialisi applicati ad un sistema macro-scala (volume tipico >20 μL) per lo screening e l'ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione mappando diagrammi di fase di concentrazione temperatura-precipitante47. In questo lavoro, viene descritto un protocollo per la produzione di microchip di dialisi che incorporano membrane di dialisi a cellulosa rigenerata (RC) di diversi MWCO al fine di eseguire test di cristallizzazione su chip e raccolta di dati di diffrazione a raggi X in situ. I materiali che comprendono i microchip sono stati valutati per la loro trasparenza ai raggi X19 e i dispositivi possono essere impostati direttamente davanti al fascio di raggi X per esperimenti di diffrazione in situ a temperatura ambiente, escludendo la movimentazione manuale e riducendo al minimo la degradazione dei cristalli proteici fragili. In un caso di studio, i cristalli di lisozima bianco-uovo di gallina sono stati coltivati su chip attraverso la microdialisi generando una popolazione di dimensioni uniformi. Il microchip è stato quindi montato davanti al fascio di raggi X con un supporto stampato in 3D19 e i set di dati di diffrazione in situ completi sono stati raccolti a temperatura ambiente da cristalli multipli e isomorfi, dimostrando l'alto potenziale e la rilevanza dei chip per gli studi di cristallografia seriale del sincrotrone di obiettivi macromolecolari impegnativi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Questo protocollo descrive la produzione di dispositivi microfluidici riproducibili ed economici che coprono l'intera tubazione per cristallizzare le proteine su chip con il metodo della dialisi e consentono esperimenti di cristallografia singola o seriale in situ a temperatura ambiente. Il protocollo descrive in dettaglio il processo di fabbricazione dei microchip, la manipolazione degli esperimenti di cristallizzazione su chip e il trattamento dei dati di diffrazione a raggi X raccolti in situ per la spiegazione strutturale del campione proteico. La caratteristica principale di questa procedura di microfabbricazione risiede nell'integrazione di una membrana di dialisi della cellulosa rigenerata disponibile in commercio e semipermeabile tra due strati del chip. Il taglio del peso molecolare della membrana incorporata varia a seconda del peso molecolare della macromolecola e dei precipitanti. Il dispositivo sfrutta i vantaggi della tecnologia microfluidale, come l'uso di volumi minuti di campioni (<1 μL) e la messa a punto sui fenomeni di trasporto. Il chip li accoppiava con il metodo della dialisi, fornendo un controllo preciso e reversibile sul processo di cristallizzazione e può essere utilizzato per studiare diagrammi di fase delle proteine su scala microliter. Il dispositivo è modellato utilizzando una resina fotocurabile a base di tiolene con litografia a impronta morbida su un substrato polimerico otticamente trasparente. Inoltre, è stata valutata la dispersione di fondo dei materiali che componevano i microchip e generavano rumore di fondo rendendo il chip compatibile per esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. Una volta che i cristalli proteici vengono coltivati su chip fino a dimensioni adeguate e uniformità della popolazione, i microchip possono essere montati direttamente davanti al fascio di raggi X con l'aiuto di un supporto stampato in 3D. Questo approccio affronta le sfide derivanti dall'uso di crioprotettivi e dalla raccolta manuale negli esperimenti convenzionali di cristallografia proteica attraverso un modo semplice ed economico. I set completi di dati di diffrazione a raggi X da più cristalli di lysozima isomorfo coltivati su chip sono stati raccolti a temperatura ambiente per la determinazione della struttura.

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Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Questo documento descrive in dettaglio il protocollo di fabbricazione dei chip microfluidici sviluppati per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della dialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. Il processo di microfabbricazione consente di integrare una membrana semipermeabile di dialisi della cellulosa rigenerata con qualsiasi taglio di peso molecolare, tra due strati del chip.

Cristallizzazione delle proteine su chip mediante microdialisi per studi di diffrazione a raggi X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Questo articolo descrive il protocollo di fabbricazione dei chip microfluidici sviluppato per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della dialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. Uno dei principali vantaggi di questi microchip è la scelta dei materiali di fabbricazione, rendendo i chip compatibili per la raccolta dei dati di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. Gli esperimenti di cristallizzazione su chip richiedono piccoli volumi del campione proteico, riducendo il costo complessivo del lavoro con queste macromolecole di alto valore.La cristallizzazione su chip elimina anche la raccolta manuale dei fragili cristalli proteici, frequentemente applicati in combinazione con il raffreddamento criogenico durante gli esperimenti di cristallografia convenzionali. Inoltre, i nostri microchip utilizzano la microdialisi per la cristallizzazione proteica, che è un metodo basato sulla diffusione che mira ad equilibrare la concentrazione del precipitante attraverso una membrana semi-permeabile, al fine di avvicinarsi alla concentrazione cromulente per la cristallizzazione proteica, e consente un controllo preciso e reversibile sulle condizioni di cristallizzazione. La microdialisi combinata con il controllo della temperatura può essere utilizzata per separare la nucleazione dalla crescita cristallina per studiare i diagrammi di fase, cambiando la concentrazione del precipitante utilizzando lo stesso campione proteico.Per prima cosa prepara 50 grammi di base in silicone PDMS ed è agente polimerizzante in un rapporto di massa da 10 a uno. Mescolare i due ingredienti in un becher con una spatola. Dopo la miscelazione, posizionare la miscela in una camera a vuoto per rimuovere tutte le bolle d'aria.Metti 25 grammi del PDMS premiscelato nel primo SU8 per padroneggiare contenente i motivi del canale microfluidico e dei pilastri, fino a un'altezza di circa cinque millimetri. Quindi versare i restanti 25 grammi del PDMS nel secondo master SU8, contenente solo i motivi dei pilastri. Curare i due strati PDMS in forno a 338 kelvin per un'ora.Tagliare gli strati di PDMS stagionati intorno ai motivi dei maestri SU8 con un bisturi e staccare delicatamente gli stampi PDMS dai maestri del silicone. Posizionare lo stampo PDMS, con sia i canali che i pilastri su uno scivolo rigido in vetro al microscopio con i motivi rivolti verso l'alto. Tagliare un piccolo pezzo di membrana di dialisi della cellulosa rigenerata per coprire il pilastro centrale dello stampo PDMS, progettato per essere la camera proteica.Il taglio del peso molecolare della membrana di dialisi viene scelto di conseguenza in base al peso molecolare del campione proteico e ai precipitanti della soluzione di cristallizzazione. Quindi separare con cura il pezzo secco della membrana di dialisi della cellulosa rigenerata. Tagliare un piccolo pezzo della membrana di dialisi separata.La dimensione di questo pezzo di membrana dipende dal design del chip. E in particolare, dipende dalle dimensioni del pilastro centrale. Depositare il pezzo della membrana di dialisi sul pilastro centrale dello stampo PDMS, che è supportato sullo scivolo di vetro, con il suo pilastro e i canali rivolti verso l'alto.Quindi posizionare il secondo stampo PDMS con solo i pilastri rivolti verso il basso, sopra lo stampo PDMS già supportato sullo scivolo di vetro. Allineare tutti i pilastri dei due stampi PDMS. Il pezzo della membrana di dialisi della cellulosa rigenerata è inserito tra i due pilastri centrali degli stampi PDMS.Questa fase della procedura di fabbricazione può essere condotta al microscopio ottico o semplicemente ispezionando visivamente attentamente l'allineamento di tutti i pilastri. Posizionare l'assieme in una camera a vuoto e essiccare per 30 minuti al fine di rimuovere le bolle d'aria intrappolate all'interno degli stampi PDMS e migliorare l'inserimento della resina NOA fotocurabile, che verrà descritta nella fase successiva di questo protocollo. Rimuovere l'assieme dalla camera a vuoto e riempire lo spazio vuoto tra i due stampi PDMS con la resina fotocurabile a base di tiolina, NOA 81, per imbibizione capillare.Applicare la resina su tre dei quattro lati dell'assieme. Posizionare il gruppo in un cross-linker e polimerizzarla esponendo alla luce UV per otto secondi, utilizzando una lampada UV collimata di 35 milliwatt per centimetro quadrato. Tagliare un pezzo PMMA spesso 175 micrometri nelle dimensioni standard di uno scivolo di vetro al microscopio e staccare la protezione plastica da ciascun lato del pezzo PMMA.Una volta completata la prima esposizione ai raggi UV, rimuovere lo stampo PDMS superiore con una resina NOA parzialmente collegata in modo incrociato bloccata su di essa dallo stampo PDMS inferiore e dallo scivolo di vetro. Premere delicatamente l'assemblaggio dello stampo PDMS superiore e la resina NOA parzialmente polimerizzata sul pezzo PMMA. Posizionare il nuovo gruppo nel cross-linker e curare nuovamente la resina NOA per esposizione alla luce UV per 60 secondi.Rimuovere con cura lo stampo PDMS superiore. Il chip di dialisi realizzato con la resina NOA completamente incrociata che incorpora una membrana di dialisi della cellulosa rigenerata ed è supportato su un pezzo di PMMA è pronto. Incolla i connettori disponibili in commercio sui punti di ingresso e di uscita del canale microfluidico con colla epossidica veloce.Per la movimentazione del fluido, scegliere il diametro dei tubi PTFE in base alle dimensioni dei connettori. I tubi sono utilizzati per l'introduzione della soluzione di cristallizzazione all'interno del canale fluidico del chip di dialisi. Pipetta manualmente una goccia del campione proteico all'interno del serbatoio proteico situato proprio sulla membrana di dialisi.Il volume della goccia proteica dipende dal design del microchip che viene utilizzato. E in particolare, dipende dal volume del pilastro centrale, e può essere 0,1 o 0,3 microlitri. Applicare con cura un sottile strato di grasso siliconico ad alto vuoto intorno al serbatoio proteico.Tagliare un piccolo pezzo di PMMA e posizionarlo delicatamente sopra lo strato sottile del grasso siliconico. Tagliare un pezzo di nastro Kapton, abbastanza grande da coprire il pezzo pmma posto sopra il serbatoio proteico e attaccare sul chip NOA intorno a tutti i bordi. Il campione proteico è incapsulato all'interno del serbatoio e il chip può essere utilizzato per esperimenti di cristallizzazione.Preparare innanzitutto circa 500 microlitri della soluzione di cristallizzazione mescolando volumi appropriati del tampone e delle soluzioni precipitanti. Iniettare la soluzione di cristallizzazione nel punto del chip di dialisi attraverso i connettori fluidici, manualmente con la siringa o con un sistema automatizzato a pressione. Una volta riempito il canale fluidico con la soluzione di cristallizzazione e nessuna aria è intrappolata all'interno, sigillare le porte di ingresso e uscita del chip con nastro Parafilm.Pipettare il volume appropriato della soluzione proteica all'interno del serbatoio proteico e incapsulare il campione proteico come è già stato descritto. La crescita del cristallo proteico può essere visualizzato e registrato con una fotocamera digitale. Per la fabbricazione dei microchip di dialisi, abbiamo scelto materiali otticamente trasparenti e biologicamente inerti, dimostrando un'elevata compatibilità per gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ.È stato valutato il rumore di fondo generato dai materiali che comprendono il compartimento proteico del chip, che si trova nel percorso diretto del fascio di raggi X. Il compartimento proteico è costituito dalla membrana di dialisi della cellulosa rigenerata, dal nastro Kapton e da due strati di PMMA, uno utilizzato come substrato dei microchip e uno utilizzato per l'incapsulamento del campione proteico. In questa immagine, viene illustrato il rumore di fondo generato dal nastro Kapton, dalla membrana di dialisi della cellulosa rigenerata, dallo strato PMMA e dal loro assemblaggio.Anche se la resina fotocurabile NOA comprende il corpo principale dei microchip, non è inclusa in queste misurazioni in quanto non fa parte della camera proteica. Anelli diffusi attribuiti alle interazioni dei raggi X con i materiali possono essere visti per il nastro kapton a risoluzione inferiore a quattro angstrom, il PMMA tra i quattro e gli otto angstrom e la membrana di dialisi tra quattro e cinque angstrom. Il rumore di fondo totale generato dal chip si osserva principalmente a una risoluzione inferiore a sei angstrom, indicando che il trattamento dei dati di diffrazione ad alta risoluzione del lysozima non è influenzato.I microchip sono stati montati davanti al fascio di raggi X con un supporto stampato in 3D che abbiamo progettato per esperimenti di diffrazione a raggi X in situ e può contenere fino a tre chip contemporaneamente. Sono stati condotti esperimenti per valutare l'efficienza dei microchip per la cristallizzazione su chip di proteine solubili in modello con il metodo della microdialisi. I cristalli di lysozima sono stati coltivati a 293 kelvin in due condizioni diverse.La prima condizione di cristallizzazione conteneva 1,5 cloruro di sodio molare e 0,1 acetato di sodio molare. La seconda condizione di cristallizzazione conteneva un cloruro di sodio molare, 0,1 acetato di sodio molare e il 30% di polietilene glicole 400, ed è stato scelto per mostrare la compatibilità dei microchip e del metodo di microdialisi, con precipitanti ad alto peso molecolare e soluzioni viscose. Gli esperimenti di cristallizzazione sono stati effettuati in condizioni statiche.Una volta coltivati i cristalli di lisozima sul microchip, sono stati utilizzati per esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. I microchip sono stati montati sulla linea del fascio con l'aiuto del supporto stampato in 3D e i set completi di dati di diffrazione a raggi X sono stati raccolti da due cristalli di lysozima. Dopo il trattamento dei dati di diffrazione dei raggi X, la mappa della densità elettronica di un singolo cristallo di glisozima è stata ottenuta a 1,95 angstrom, come mostrato nella figura A.La figura B mostra la mappa della densità degli elettroni ottenuta con risoluzione di 1,85 angstrom.Dopo aver unito due set di dati ottenuti da due diversi cristalli di lisozima, entrambe le mappe di elettrodensità mostrano informazioni strutturali dettagliate che possono essere ottenute mediante esperimenti di diffrazione a raggi X in situ condotti direttamente sui microchip di dialisi a temperatura ambiente, da cristalli proteici singoli o multipli. Abbiamo dimostrato la procedura di fabbricazione per dispositivi microfluidici progettati per la cristallizzazione proteica su chip con il metodo della microdialisi e esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. Abbiamo utilizzato materiali di fabbricazione ad alta trasparenza a raggi X, compatibili per la cristallografia proteica in situ.La raccolta dei dati di diffrazione è automatizzata con l'utilizzo di un supporto stampato in 3D per i chip, che può essere montato direttamente in linee di fascio di cristallografia macromolecolare. La versatilità di questo microchip deriva dall'utilizzo della microdialisi per controllare reversibilmente le condizioni di cristallizzazione e mappare i diagrammi di fase utilizzando un piccolo volume proteico. La prototipazione del dispositivo è semplice, consentendo la fabbricazione di un massimo di 30 microchip in un solo giorno in una stanza pulita, con materiali relativamente economici.Ci aspettiamo che queste caratteristiche dei chip possano essere utilizzate per studi seriali di cristallografia a raggi X su obiettivi proteici più impegnativi.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Ricerca

Chimica

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Dinamica elettrochimica Misura di cloruro di ioni

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

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In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Diffrazione di raggi X Polvere in Conservazione Scienza: verso Routine di cristallo Struttura Determinazione di corrosione prodotti sul patrimonio Art Objects

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Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

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Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

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L'assorbimento del metallo essenziale nei batteri gram-negativi: fluorescenza, radioisotopi, a raggi x e delle cellule di frazionamento

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Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elementale-sensibile alla rilevazione della chimica in batterie attraverso la spettroscopia di assorbimento di raggi x molli e risonante Inelastic x-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

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Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...