Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

MBSは、契約インスツルメンテーションの下でのMI / CNRSのサポートを2014-2015の制限で認めています。NJは、CEAの国際博士研究プログラム(イルテリス)の博士フェローシップを認めています。MBSとSJは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金協定番号722687の下で、欧州連合(EU)のホライゾン2020研究イノベーションプログラムからの資金提供を認めています。MBS、SJ、NJは、マイクロファブリケーション実験のためのクリーンルームの設置に対するLIPhy(UGA)に感謝します。IBSは、グルノーブル学際研究所(CEA)への統合を認めています。

著者らは開示するものは何もない。

マイクロ流体デバイスは、マイクロ透析法によるオンチップタンパク質結晶化、室温でのX線回折実験を行うため開発されています。オンチップタンパク質の結晶化にマイクロ透析を使用するために、任意のMWCOのRC透析膜を組み込んだNOA 81チップを製作することができます。比較的高いX線透過性を有する製造材料が使用され、その部分タンパク質結晶学においてチップに適合する。装置のタンパク質結晶化用コンパートメント(PMMA、カプトン、RC透析膜)を構成する製造材料を評価し、低いバックグラウンドノイズを発生させる。具体的には、透析チップで発生するバックグラウンドノイズは、主に低分解能(>6Å)で観察され、タンパク質構造決定に必要な大きなリゾチーム結晶の高分解能回折データの処理には影響しません。データ収集の自動化は、高分子結晶学ビームラインに直接取り付けることができ、同時に3つのマイクロチップまで運ぶことができる3Dプリントサポートを使用して増幅されます。このようにして、脆弱なタンパク質結晶の手動収穫および操作が回避される。また、データ収集は室温で行われ、天然タンパク質構造2,3からの立体構造変化に関連する凍結保護の必要性を回避する。
マイクロ透析をオンチップで結晶を成長させる方法として使用することで、結晶化プロセスを正確に監視および制御することができます。導入で議論されるように、従来のタンパク質結晶化方法のほとんどは、マイクロ流体デバイス11,14を用いて実施されている。しかし、タンパク質結晶化に対する透析の利点は、マイクロスケールではまだ十分に活用されていませんでした。オンチップマイクロ透析は、同じタンパク質サンプル19で、相図を研究し、結晶化条件のスクリーニングおよび最適化を行う可能性を提供する。この研究で紹介するプロトタイプでは、チップ当たりのタンパク質消費量は0.1 μLまたは0.3 μLに制限されています。製造プロトコルは多くのステップを含むが、それは簡単であり、比較的安価な材料と、クリーンルームで1日で多数のデバイス(20〜30チップ)の製造を可能にする。しかし、タンパク質のオンチップ結晶化は、特にマイクロスケールにおける核生成および結晶成長の本質的な確率的性質のために微妙な手順であり得る。ケーススタディでは、リソチームの結晶化に十分に確立された条件が使用され、その場でX線回折データ収集に適した堅牢で明確な結晶が得られた。しかしながら、結晶化媒体がはるかに複雑で、相図が知られておらず、十分に働く結晶化条件がまだ確立されていない膜タンパク質のような、より困難なタンパク質標的の使用によって困難が生じる可能性がある。透析チップは、マイクロ流体チャネル内の結晶化溶液を交換するだけで、貴重で頻繁に高価なタンパク質サンプルを処分することなく、これらの困難を上回る可能性を提供し、チップ上のフェーズ図を研究します。
マイクロ流体デバイスの多様性は、結晶化条件を可逆的に制御し、低タンパク質体積を使用して濃度および温度変化相図をマッピングするために、オンチップタンパク質結晶化のためのマイクロ透析を利用することから生じる。さらに、この装置は 、Situ X線回折実験において互換性があり、デバイスのプロトタイピングは安価で迅速である。可溶性タンパク質および膜タンパク質の同形結晶(調製)の多くは、オンチップで成長することができ、これらすべての特徴は、シンクロトロンおよびXFEL施設での困難なタンパク質標的の連続X線結晶学研究に利用できることが期待される。最後に、オンチップと その時点で の時間解決された研究を行うことは、結晶学コミュニティにとって大きな関心事となり得る将来の可能性です。したがって、透析チップ上の結晶を成長させ、試薬をマイクロ流体チャネルに導入することで、手動(注射器を使用)または自動的に(圧力制御流体システムまたはシリンジポンプを使用)、マイクロ流体チップがシンクロトロンビームラインの時間分解実験を正常にトリガできることを証明することに焦点を当てます。

生体高分子の3次元(3D)構造を解明することは、X線結晶学が依然として主要な調査技術である構造生物学における絶え間ない追求である。タンパク質などの複雑な高分子の構造の詳細を解明するために応用され、それらの作用のメカニズムと様々な生物学的機能への関与の理解を促進することを目的としています。シンクロトロンとX線自由電子レーザー(XFET)の強力なX線源は、ほぼ原子分解能でタンパク質の構造をより深く洞察するために必要なすべてのツールを提供します。構造研究のためのX線の使用と一緒に来る利点にもかかわらず、X線放射および結晶化プロセス自体に本質的な制限がある。X線ビーム前の高X線フラックスおよびタンパク質結晶の長時間露光時間によって引き起こされる放射線損傷は、結晶学者が極低温冷却1を用いて上回らなければならない制限的なパラメータである。しかし、天然のタンパク質構造やアーチファクトからの立体構造変化は2,3を隠すことができるので、最適な凍結冷却条件を見つけることは面倒です。また、最近の研究では、室温で回折実験を行うと、特定の放射線損傷が低下する4が示されている。構造生物学のもう一つのボトルネックは、十分なサイズ5を有する十分に拡散結晶の獲得である。小さい結晶は、特に膜タンパク質の場合に生成しやすくなるが、より大きなタンパク質結晶の場合に比べて高い放射線量を小さな体積で向けなければならないため、凍結冷却条件下でも放射線損傷の影響を受けやすい。連続結晶学7,8のシンクロトロンおよびXFELの新しいアプローチは、放射線損傷の抑制を回避すると同時に、複数の同型およびランダム指向のタンパク質結晶からのデータセットをマージし、フェムト秒パルス、短い暴露時間およびマイクロフォーカスX-7線線などの関連技術の進歩から利益を得ることによって、より小さな結晶(200nm〜2 μm)7を利用することができる。 
マイクロ流体技術はX線結晶学にとって価値があり、生物学的高分子の結晶化とその構造調査に多様な利点を示します。マイクロ流体デバイスで結晶化実験を行うには、少量のタンパク質サンプルが必要であり、これらの高価値生体高分子の製造コストを制約し、多数の結晶化条件のハイスループットスクリーニングと最適化を促進します。さらに、マイクロ流体スケールと拡散限定輸送現象における固有の大きな表面積比は、流れおよび温度または濃度勾配11、12、13、14を細かく制御することを可能にし、均一なサイズの結晶を成長させるために適した微小流体デバイスをレンダリングし、相図15、16、17、18、19を探索する。さらに、マイクロ流体ツールは、サンプルデリバリーであるタンパク質結晶学のもう一つのハードルに対処する独特の可能性を示し、X線回折実験に使用する前にタンパク質結晶を処理し、収穫する必要性を示しています。オンチップおよびIn situ X線結晶学の方法は、データ収集前に結晶の操作と結晶品質の潜在的な劣化を排除します。X線タンパク質結晶学に対応する幅広いマイクロ流体チップは、マイクロファブリケーション材料の性質とX線14、19、20、21、22、23との相互作用に起因する関連制限に直面する多くの研究グループによって設計、開発、試験されています。製造材料は、光学的に透明で生物学的に不活性であり、X線放射に対する高い透明性と、データ収集中の最適な信号対雑音比を実証する必要があります。
従来のタンパク質結晶学24,25において適用される結晶化法の大部分は、チップ結晶化およびX線回折解析においてマイクロ流体スケール11、14で実施されている。蒸気拡散26を組み込んだ単純、ハイブリッド、または多層マイクロ流体装置、蒸発27、遊離界面拡散(FID)28、マイクロバッチ26、あるいは播種29が可溶性および膜タンパク質を結晶化するために用いられている。高スループットスクリーニングと結晶化条件の最適化は、ウェルベース32、液滴ベース33、またはバルブ作動34デバイスで30、31を達成することができます。 その時PDMS(ポリジメチルシロキサン)、COC(環状オレフィン共重合体)、PMMA(メチルメタクリレート)などの様々な材料から作製されたマイクロチップで室温での難解なタンパク質標的のX線回折実験が行われている21、22、26、28、29、グラフェンフィルム23、カプトン35、エポキシ接着剤6、またはNOA(ノーランド光学接着剤)19およびX線放射に対する材料の透明性およびバックグラウンドノイズへの寄与が評価されている。さらに、マイクロチップは、シンクロトロン源23、35、36およびXFET7におけるX線タンパク質結晶学実験のための単一のツールでin in situとシリアルデータ収集戦略を結合するように設計されている。
また、その場での室温データ収集は、さまざまな配信方法や装置にも実装されています。例えば、Noglyら54は、XFEL源を用いてシリアルフェムト秒結晶学(SFX)による光駆動光子ポンプバクテリオロドプシン(bR)の構造を研究するために脂質立方相(LCP)インジェクターを用いた。BRの結晶構造は2.3Å分解に解かれ、LCPインジェクターと時間分解型順ム・フェムト秒結晶学(TR-SFX)との相溶性を実証した。Baxterら55は、さまざまなサイズのレーザーカット穴を持つ100または200 μmの厚いポリカーボネートプラスチックによって製造された高密度多結晶グリッドを設計しました。さらに5μmの厚いポリカーボネートフィルムは、座り込みまたは吊り下げ-落下結晶化実験のためにデバイスを使用する場合、グリッドの片側に固定することができます。この高密度グリッドは、水晶をデバイスのポートに直接ロードしたり、水蒸気拡散やLCP法でデバイス上で成長させることができるように、複数の方法で使用することができます。さらに、グリッドは標準的な磁気ベースで調整され、極低温または室温条件でのSitu X線データ収集に使用することができる。最近では、Feilerら.56は、低分子および周囲温度での高分子X線結晶学のサンプルホルダーを開発し、バックグラウンドノイズの寄与を最小限に抑えた。具体的には、ホルダーは、プラスチック支持体、透明COC箔及び微多孔性ポリイミド箔を備える。結晶化液を設定するために一般的に使用されるカバースライドを置き換えるように設計された一方で、結晶化ドロップを開いたり手動で結晶を処理したりすることなく、リガンド浸漬、複雑な形成、極低温保護などのインプレース操作が可能です。さらに、サンプルホルダーは結晶化板から取り出し、標準的なゴニオメータベースのビームラインでの現場データ収集用の磁気ベースに置くことができます。周囲温度データ収集の場合、COC箔は実験前に除去され、21μm厚のポリイミド箔のみがバックグラウンド散乱に寄与し、この場合は最小限に抑えられます。これらの例は、進行中の研究のほんの一部と、X線タンパク質結晶学のために開発された多彩なマイクロチップを構成しています。
しかしながら、透析タンパク質結晶化法は、マイクロ流体内に広く組み込まれていない。透析は、タンパク質結晶化のための公称濃度に近づくために半透過性膜を通して沈殿物濃度の平衡を目指し、結晶化条件24を正確かつ可逆的に制御することを目的とした拡散ベースの方法である。半透析膜の分子量カットオフ(MWCO)は、目的の高分子を保持しながら小さな沈殿分子の拡散を可能にする高分子および沈殿物の分子量に応じて選択することができる。透析プロセスの可逆性のために、同じタンパク質サンプルを使用しながら沈殿物濃度を変化させることによって相図を調査するために、個別に核化および結晶成長を分離し最適化するために温度制御と組み合わせて使用することができる。マイクロ流体学中の膜の統合は、de Jong et38によってレビューされ、マイクロチップへの透析を移植する生物学における事例研究は、主にサンプル調製、濃度または濾過アプリケーション39、40、41、42または細胞関連研究43、44に記載することができる。PDMSによる浸透気化は、種々の条件下でのキシラナーゼの核生成および成長を研究するためにShimらら37によって使用された。厚さ15μmのPDMS膜を通してマイクロ流体装置のタンパク質貯留層に水が浸透し、その後タンパク質と沈殿物濃度が変化した。
Juniusらによって開発されたプロトコルは、マイクロ透析を介したオンチップタンパク質結晶化と室温でのX線回折実験の両方に適合するマイクロ流体チップの製造のために提示される。デバイス製造のためのプロトコルは、柔らかいインプリントリソグラフィを使用して、市販の膜を埋め込む光硬化性チオレンベースの樹脂NOA 81のマイクロパターンステッカーのためのStuderと同僚12、46によって達成された先駆的な仕事に直接触発されています。この方法の革新的な改変により、マイクロダイアルシスを使用してタンパク質結晶のオンチップ成長のための実験パラメータを正確に監視および制御し、同時に実験あたりのタンパク質サンプルの消費量の減少(<1 μL)などのマイクロ流体の利点を利用することが可能となりました。これまでの研究では、温度沈殿濃度相図をマッピングすることにより結晶化条件をスクリーニングおよび最適化するためのマクロスケールシステム(典型的な容積>20μL)に適用される透析の原理が47に実証された。本研究では、異なるMWCOの再生セルロース(RC)透析膜を組み込んだ透析マイクロチップを製造するためのプロトコルを記載し、オンチップおよびSitu X線回折データ収集において結晶化アッセイを行う。マイクロチップを含む材料は、X線19に対する透明性について評価されており、装置は、手動処理を除き、脆弱なタンパク質結晶の分解を最小限に抑える、その場で室温に対してX線ビームの前に直接設定することができる。ケーススタディでは、卵白リソチーム結晶を、均一な大きさの集団を生成するマイクロ透析を介してオンチップで成長させた。その後、マイクロチップを3Dプリントされた支持体19でX線ビームの前に取り付け、その場で完全な回折データセットを複数の同型結晶から室温で収集し、挑戦的な高分子標的のシンクロトロン連続結晶学研究のためのチップの高い可能性と関連性を実証した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

このプロトコルは、透析法でオンチップのタンパク質を結晶化し、室温での単結晶または連続結晶学の実験を可能にするパイプライン全体をカバーする再現性と安価なマイクロ流体デバイス の 製造を記述します。プロトコルは、マイクロチップの製造プロセス、オンチップ結晶化実験の操作、およびタンパク質サンプルの構造解明のための Insitu 収集されたX線回折データの治療を詳述する。この微細加工手順の主な特徴は、チップの2層間に市販の半透析可能な再生セルロース透析膜の統合にあります。組み込み膜の分子量カットオフは、高分子の分子量および沈殿物によって異なる。このデバイスは、微量サンプル(<1 μL)の使用や輸送現象の微調整など、マイクロ流体技術の利点を活用しています。チップはそれらを透析法と組み合わせて、結晶化プロセスを正確かつ可逆的に制御し、マイクロリットルスケールでタンパク質の位相図を調査するために使用することができます。装置は光学的に透明なポリマー基質の柔らかいインプリントのリソグラフィが付いている光硬化性チオレンベースの樹脂を使用してパターン化される。また、マイクロチップを構成する材料の背景散乱とバックグラウンドノイズの発生を評価し 、その際 のX線回折実験でチップの適合性を評価した。タンパク質結晶が十分なサイズと集団の均一性までオンチップで成長すると、マイクロチップは3Dプリントホルダーの助けを借りてX線ビームの前に直接取り付けることができます。このアプローチは、従来のタンパク質結晶学実験における凍結保護剤の使用と手動収穫から生じる課題に、容易かつ安価な方法で対処します。複数のX線回折データセットを、オンチップで成長させた同形リソチーム結晶から完全に、構造決定のために室温で収集した。

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Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

本論文では、透析法とX線回折実験を用いて、オンチップタンパク質結晶化のために開発されたマイクロ流体チップの製造プロトコルについて詳しく述べる。微細加工プロセスにより、半透膜再生可能なセルロース透析膜を、チップの2層間の任意の分子量カットオフと統合することが可能になります。

In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

本論文では、透析法によるオンチップタンパク質結晶化および室温でのX線回折実験で開発されたマイクロ流体チップの製造プロトコルについて述べる。これらのマイクロチップの主な利点の1つは、製造材料の選択であり、室温でのSitu X線回折データ収集に適合するチップをレンダリングします。オンチップの結晶化実験では、タンパク質サンプルの少量が必要であり、これらの高価値の高い高分子での作業の全体的なコストを削減します。オンチップ結晶化はまた、従来の結晶学実験の間に凍結冷却と組み合わせて頻繁に適用される脆弱なタンパク質結晶の手動収穫を排除する。また、ミクロミチップスは、半透過膜を通して沈殿物濃度を平衡化することを目的とした拡散ベースの方法であるタンパク質結晶化にマイクロ透析を用い、タンパク質結晶化のためのクロミュレント濃度に近づき、結晶化条件を精密かつ可逆的に制御することができます。温度制御と組み合わせたマイクロ透析は、同じタンパク質サンプルを使用しながら沈殿物濃度を変化させることによって、結晶成長から核形成を切り離して相図を調べるのに使用することができる。まず、PDMSシリコーンベースの50グラムを調製し、10〜1質量比で硬化剤です。2つの材料をヘラとビーカーに混ぜます。混合後、すべての気泡を除去するために真空チャンバーに混合物を置きます。マイクロ流体チャネルと柱のパターンを含むマスターに最初のSU8に、約5ミリメートルの高さまで、プレミックスPDMSの25グラムを入れます。次に、残りの25グラムのPDMSを第2のSU8マスターに注ぎ、柱のパターンのみを含む。338ケルビンでオーブン内の2つのPDMS層を1時間硬化させます。メスでSU8マスターのパターンの周りに硬化PDMS層をカットし、シリコンマスターからPDMS金型を穏やかに剥がします。PDMS金型を配置し、チャネルと柱の両方を上向きのパターンでスライドした硬い顕微鏡のガラススライド上に配置します。再生セルロース透析膜の小片をカットして、タンパク質チャンバーとして設計されたPDMSモールドの中央柱を覆います。透析膜の分子量カットオフは、タンパク質試料の分子量に応じて選択され、結晶化液の沈殿物とがこれに応じて選択される。次に再生セルロース透析膜の乾燥片を慎重に分離する。分離透析膜の小片を切ります。膜のこの部分のサイズは、チップの設計に依存します。具体的には、中央柱の寸法に依存します。ガラススライドに支えられたPDMS型の中央柱に透析膜の部分を堆積させ、その柱とチャネルを上向きにします。次に、ガラススライド上で既にサポートされているPDMS金型の上に、下向きの柱だけを備えた2番目のPDMS金型を配置します。2 つの PDMS 金型のすべての柱を位置合わせします。再生セルロース透析膜の部分は、PDMS金型の2つの中央柱の間に挟まれている。製造手順のこのステップは、光学顕微鏡の下で、または単に目視ですべての柱の位置合わせを慎重に検査することによって行うことができます。PDMS金型内の閉じ込められた気泡を除去するために、真空チャンバーにアセンブリを置き、30分間乾燥させ、光硬化性NOA樹脂の挿入を増強し、このプロトコルの次のステップで説明する。真空チャンバからアセンブリを取り出し、2つのPDMS金型の間の空きスペースを、毛細血管インビビジョンによって光硬化性チオリン系樹脂NOA 81で満たします。アセンブリの4つの側面のうちの3つの樹脂を塗布します。アセンブリをクロスリンカーに入れ、1平方センチメートルあたり35ミリワットのコリメートUVランプを使用して、8秒間UV光にさらしてNOA樹脂を硬化させます。顕微鏡ガラススライドの標準寸法で175マイクロメートルの厚さのPMMAピースをカットし、PMMAピースの両側からプラスチック保護を剥がします。最初のUV露光が完了したら、下部PDMS金型とガラススライドから部分的に架橋されたNOA樹脂が貼り付けられた上部PDMS金型を取り外します。上部 PDMS 金型のアセンブリと PMMA ピース上の部分的に硬化した NOA 樹脂を静かに押します。クロスリンカーに新しいアセンブリを配置し、60秒間UV光に曝露することによって、再びNOA樹脂を硬化させます。上部 PDMS 金型は慎重に取り外します。再生セルロース透析膜を埋め込み、PMMAピースでサポートされている完全クロスリンクNOA樹脂で作られた透析チップは準備ができています。高速エポキシ接着剤とマイクロ流体チャネルの入口および出口点に市販のコネクタを結合します。流体の取り扱いについては、コネクタのサイズに基づいて PTFE チューブの直径を選択します。チューブは、透析チップの流体チャネル内の結晶化溶液の導入に使用されます。ピペットは、透析膜のすぐ上に位置するタンパク質貯蔵所内のタンパク質サンプルの液滴を手動で行う。タンパク質液滴の体積は、使用されているマイクロチップの設計に依存します。具体的には、中央柱の体積に依存し、0.1または0.3マイクロリットルであることができます。タンパク質貯留層の周りには、高真空シリコーングリースの薄層を慎重に塗布します。PMMAの小片をカットし、シリコーングリースの薄い層の上にそっと置きます。タンパク質貯留層の上に置かれたPMMA部分を覆い、すべての端の周りにNOAチップに貼り付けるのに十分な大きさのカプトンテープを切ります。タンパク質サンプルはリザーバー内に封入され、チップは結晶化実験に使用できます。まず、緩衝液と沈殿液の適切な体積を混合して、結晶化液の約500マイクロリットルを調製する。透析チップの点に、シリンジを使用するか、自動圧力駆動システムを使用して、流体コネクタを介して結晶化液を注入します。流体チャネルが結晶化溶液で満たされ、内部に空気が閉じ込められなかったら、パラフィルムテープでチップの入口と出口ポートを密封します。ピペットは、タンパク質貯留層内のタンパク質溶液の適切な体積を、既に説明したようにタンパク質サンプルを封入する。タンパク質の結晶成長を視覚化し、デジタルカメラで記録することができます。透析マイクロチップの製造のために、我々は光学的に透明で生物学的に不活性な材料を選択し、その中でのX線回折実験のための高い適合性を実証した。X線ビームの直接経路にあるチップのタンパク質区画を含む材料によって発生するバックグラウンドノイズが評価された。タンパク質コンパートメントは、再生セルロース透析膜、カプトンテープ、および2つのPMMA層からなり、1つはマイクロチップの基質として使用され、1つはタンパク質サンプルのカプセル化に使用される。この図では、カプトンテープ、再生セルロース透析膜、PMMA層、及びそれらの組み立てにより発生するバックグラウンドノイズを示す。光硬化性樹脂NOAはマイクロチップの本体を含むが、タンパク質チャンバの一部ではないため、この測定には含まれない。X線と材料との相互作用に起因する拡散リングは、4つのオングストロームより低い解像度でカプトンテープ、4~8オングストローム間のPMMA、および4~5オングストローム間の透析膜に対して見ることができます。チップによって発生する総バックグラウンドノイズは主に6オングストロームより低い解像度で観察され、リゾチームの高分解能回折データの処理は影響を受けないことを示している。マイクロチップは、X線回折実験で設計した3DプリントサポートでX線ビームの前に取り付けられ、最大3つのチップを同時に保持することができます。マイクロジアルシス法によるモデル可溶性タンパク質のオンチップ結晶化に関するマイクロチップの効率を評価する実験を行った。リソチーム結晶は2つの異なる条件で293ケルビンで成長した。最初の結晶化条件は、1.5モル塩化ナトリウム、および0.1酢酸モルナトリウムを含んでいた。第2の結晶化条件は、塩化モルナトリウム、酢酸モルナトリウム0.1モル、ポリエチレングリコール400を含み、マイクロチップとマイクロ透析法との相溶性を示すために選択され、高分子量および粘性溶液の沈殿物を有する。結晶化実験は、静的条件下で行った。ライソチームの結晶をマイクロチップ上で成長させた後、室温でのX線回折実験に使用した。マイクロチップは、3Dプリントされた支持体の助けを借りてビームラインに取り付けられ、完全なX線回折データセットを2つのリソチーム結晶から収集した。X線回折データの処理後、1つのリゾチーム結晶の電子密度マップを1.95オングストローム分解能で得た図A.図Bに示すように、1.85オングストローム解像度で得られた電子密度マップを示す。2つの異なるリソチーム結晶から得られた2つのデータセットをマージした後、両方の電気密度マップは、単一または複数のタンパク質結晶から、室温で透析マイクロチップに直接行われたX線回折実験で得ることができる詳細な構造情報を示しています。マイクロ透析法によるオンチップタンパク質結晶化用に設計されたマイクロ流体デバイスの製造手順、室温でのX線回折実験を実証しました。X線透過性の高い作製材料を使用し、その際に使用するタンパク質結晶学に対応しました。回折データ収集は、高分子結晶性ビームラインに直接取り付けることができるチップの3Dプリントサポートを使用して自動化されています。このマイクロチップの多様性は、小タンパク質体積を使用して結晶化条件を可逆的に制御し、相図をマッピングするためにマイクロ透析を使用することから生じる。装置のプロトタイプ作成は簡単で、比較的安価な材料で、クリーンルームで1日に最大30個のマイクロチップを製造することができます。チップのこれらの特徴は、より困難なタンパク質標的の連続X線結晶学研究に使用できることを期待しています。

Research

JoVE Journal

Chemistry

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