Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

MBS anerkjenner støtte fra MI / CNRS under kontrakten Instrumentering på grensene 2014-2015. NJ anerkjenner CEA's International Doctoral Research Program (Irtelis) for PhD Fellowship. MBS og SJ anerkjenner støtte fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale nummer 722687. MBS, SJ og NJ takker LIPhy (UGA) for det rene romet for mikrofabrikasjonseksperimenter. IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA).

1. Maske design og master fabrikasjon
<ol><li>Tegn de ønskede geometriene til mikrofluidisk enhet ved hjelp av en vektorisk tegneprogramvare. For hvert lag av fotoresisten som skal brukes til neste trinn av fotolitografi, forberede en individuell maske: en maske skissert med kanaler og søyler og en maske som bare inneholder søylene.</li>
	<li>Oversett CIF filer generert av tegning programvare til film fotomasker. Dette kan gjøres gjennom kommersielle tjenester. Krev riktig fotomaske avhengig av valg av fotoresisten som brukes under fotolitografi. MERK: For SU-8-fotoresisten kan du bestille masker med svarte funksjoner på en gjennomsiktig bakgrunn. SU-8 er en epoksybasert negativ fotoresist, noe som betyr at under eksponering for UV-lys (365 nm) blir delene eksponert for UV krysskoblet mens resten forblir løselig. Derfor vil alle svarte mønstre på masken ikke bli krysskoblet av UV-lys under fotolitografien. Kanaler og søyler vil bli gravert på mesterne.</li>
	<li>Forbered to mestere på silisiumwafers for hver chip design av fotolitografi ved hjelp av SU-8 negativ fotoresist. MERK: Trinn 1.3.1-1.3.7 utføres i et rent rom. Trinnene beskrevet nedenfor er de tradisjonelle trinnene i fotolitografi etterfulgt av PDMS myk litografi, som er beskrevet i mange lærebøker. Alle verdiene til eksperimentelle parametere (fotoresist, varighet, temperatur, etc.) avhenger av mange subtile parametere og må optimaliseres avhengig av det forskjellige apparatet som brukes.<ol>
<li>Bruk en 3-tommers silisiumwafer og behandle overflaten med plasma i 90 s, for å lette avsetningen og vedlegget til SU-8-fotoresisten.</li>
		<li>Hell omtrent 3 ml SU-8 motstå på midten av wafer og spinn pels SU-8 ned til ønsket tykkelse (Figur 1A). For 50 μm nominell tykkelse, bruk SU-8 3050 og spin coat for 10 s ved 500 rpm og suksessivt for 30 s ved 3500 rpm. Myk bake fotoresistens på en kokeplate i 15 min ved 368 K for å være delvis størknet ved å la oppløsningsvæsken i harpiksen fordampe og hindre at det stikker på fotomasken. Etterpå, la wafer ved romtemperatur i 2 min.</li>
		<li>Utsett fotoresisten for UV-lys (figur 1B). Bruk en maskejuster med en effekt på 35 mW cm-2 og 8 s eksponeringstid.</li>
		<li>Fortsett med baking etter eksponering. Plasser wafer på en kokeplate i 5 min ved 368 K for å fullføre fotoreaksjonen som er påkalt av UV-eksponeringen.</li>
		<li>Fjern alle SU-8 motstå som ikke ble krysset ved å plassere wafer i et bad som inneholder propylenglykol metylengedyleteracetat (PGMEA) og rør i 15 min. Skyll wafer med isopropanol til ingen uklar nedbør kan observeres. Tørk wafer med nitrogengass og lagre den i en petriskål (100 mm x 15 mm standardstørrelse).</li>
		<li>Behandle overflaten av wafer med et silan for å lette løsrivelse av polydimetylsiloxane (PDMS) som skal brukes til å fremstille 2 frimerker. Deponer wafer på en tappet kokeplate på 368 K i 10 min under dampatmosfæren til heksametyldisilazan (HMDS). MERK: Hvis peeling av PDMS fra wafer blir vanskelig etter flere bruksområder, bør overflaten av wafer behandles igjen med HMDS damp.</li>
		<li>Den første mesteren som inneholder kanalene og søylene er klare. Gjenta disse trinnene og forberede den andre master mønster bare søylene. MERK: Under fotolitografi er målet å oppnå geometriene til enheten på SU-8-mesterne med en høyde på 50 μm. Men når de to SU-8-mesterne er fabrikkert, måler du høyden på geometriene gravert på mesterne med et profilometer for å skaffe seg den eksperimentelle verdien. Den målte verdien for begge SU-8-mestere fabrikkert for denne protokollen er ca. 45 μm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PDMS former fabrikasjon
MERK: Følgende trinn i protokollen kan utføres i ethektig laboratorium så lenge en laminær strømningshette brukes, gult lys i rommet brukes når du arbeider med NOA 81-harpiksen (trinn 3.6-3.11) og en kilde til UV-lys er tilgjengelig for polymerisering av NOA 81-harpiksen (trinn 3.7 og 3.11).
<ol><li>Forbered 50 g PDMS silikonbase og herdingsmiddelet i et 10:1-masseforhold.</li>
	<li>Bland begge ingrediensene i et beger med en slikkepott og legg blandingen i et vakuumkammer for å fjerne alle luftboblene.</li>
	<li>Hell 25 g av de forhåndsblandet PDMS i SU-8 master (lagret i en petriskål) mønster kanalene og søylene opp til en høyde på ca 5 mm. Hell de resterende 25 g pdmene i det andre SU-8-hovedmønsteret, bare søylene opp til en høyde på ca. 5 mm (figur 1C).</li>
	<li>Legg begge Petri-rettene i en ovn og herd PDMS-lagene ved 338 K i 1 time.</li>
	<li>Klipp det herdede PDMS-laget rundt mønstrene til SU-8-mesterne med en skalpell og fjern forsiktig PDMS-formene fra mesterne (figur 1D). MERK: Prosedyren beskrevet ovenfor, kalt replikastøping, brukes ofte til å forberede former av PDMS som vil bli festet til glassflater og være en del av en mikrofluidiskenhet 53. I denne protokollen er PDMS-formene ikke en del av brikken, men de brukes som mellomprodukter for chipfabrikasjonen. For hver design er 2 PDMS-former utarbeidet fra de respektive SU-8-mesterne (figur 1D og 1E) og vil bli brukt tilsvarende (som beskrevet nedenfor) for fabrikasjon av mikrobrikken.</li>
</ol>3. Dialyse chip fabrikasjon
<ol><li>Plasser PDMS-formen som både kanaler og søyler på et stivt mikroskopglasslysbilde (3 x 1 tommer standardstørrelse) med mønstrene vendt oppover (figur 1F). Den sentrale søylen som tilsvarer proteinreservoaret overstiger vertikalt med 45 μm fra den horisontale overflaten av PDMS-formen.</li>
	<li>Klipp og skill et tørt stykke av den regenererte cellulose (RC) dialysemembranen og deponer den på den sentrale søylen i PDMS-formen, som støttes på glasslysbildet (figur 1F). MERK: RC dialysemembranen er kommersielt tilgjengelig, og den molekylære vektkuttet (MWCO) velges tilsvarende med proteinets molekylære vekt under studier og bunndempivane som brukes. Størrelsen på stykke RC dialysemembran avhenger av utformingen av brikken. I denne protokollen er 2 prototyper utformet der volumet av proteinreservoaret er 0,1 eller 0,3 μL. I disse tilfellene er størrelsen på dialysemembranstykket henholdsvis 2 x 2 mm2 eller 4 x 4 mm2.</li>
	<li>Plasser den andre PDMS-formen som bare er vendt nedover på toppen av PDMS-formen som støttes på glasslysbildet (figur 1F). Den sentrale søylen i denne formen tilsvarer proteinreservoaret og overskrider vertikalt (vendt nedover) med 45 μm fra den horisontale overflaten.</li>
	<li>Juster de sentrale pilarene i de 2 PDMS-formene. RC dialysemembranen er "klemt" mellom de 2 PDMS-formene (figur 1G). MERK: Justeringen mellom mikrostrukturene til de 2 PDMS-formene kan oppnås visuelt, uten ekstra utstyr. Ellers kan denne manipulasjonen oppnås under et mikroskop. Et lite skifte mellom reservoarene er ikke problematisk, så lenge den fluidiske kanalen og inngangs- eller utgangspunktene ikke er helt dekket.</li>
	<li>Uttørk forsamlingen i 30 min i et vakuumkammer for å fjerne alle fanget luftbobler i PDMS-formene og for å fremme innsetting av harpiksen i løpet av neste trinn av fabrikasjonen. MERK: De 2 PDMS-formene holdes på plass av PDMS-PDMS-vedheft, og det kreves ikke ekstra trykk eller annen måte å binde på midlertidig binding på.</li>
	<li>Fyll det tomme rommet mellom de 2 PDMS-formene med den fotohelbredelige, tiolenbaserte harpiksen NOA 81 ved kapillær imbibition (figur 1H og 1I).</li>
	<li>Herd harpiksen ved eksponering for UV-lys (365 nm) i 8 s ved hjelp av en kollidert UV-lampe (effekt 35 mW cm-2). MERK: Denne første eksponeringen gjør at NOA 81 harpiks kan være delvis krysskoblet siden et tynt lag av NOA 81 i kontakt med PDMS-formene på begge sider forblir usikret.</li>
	<li>Skjær det overskytende av NOA 81 fra de ytre sidene av PDMS-formene med en skalpell.</li>
	<li>Fjern den øvre PDMS-formen med den delvis krysskoblede NOA 81 fast på den fra den nederste PDMS-formen og glasslysbildet.</li>
	<li>Klipp et 175 μm tykt PMMA-ark i standarddimensjonene til et mikroskopglasssklie (3 x 1 tommer) og skrell av plastbeskyttelsesarkene fra hver side av PMMA-stykket. Trykk forsiktig på monteringen av den øvre PDMS-formen og den delvis herdede NOA 81 på PMMA-stykket (figur 1J).</li>
	<li>Herd igjen NOA 81 ved eksponering for UV-lys i 60 s og fjern den øvre PDMS-formen (figur 1K). Harpiksen holder seg til PMMA-substratet uten videre behandling. MERK: PDMS-formene kan gjenbrukes omtrent 5 ganger etter vask av dem med isopropanol og aceton, så lenge formene ikke er bøyd. RC dialysemembranen er inkorporert i NOA 81 klistremerket og ingen ytterligere manipulering eller mekanisk klemming er nødvendig.</li>
</ol>4. Fluidic-kontakter
MERK: Utformingen av mikrofluidisk chip består av en lineær fluidisk kanal for krystalliseringsløsningen og et sentralt reservoar for proteinprøven (proteinreservoar), begge vist fra en toppvisning av to mikrobrikker i figur 2A. En RC dialysemembran er innebygd mellom disse to mikrostrukturene (figur 2D) og krystalliseringsprosessen utvikler seg mens utfellingsmidler fra krystalliseringsløsningen diffuserer over membranen på grunn av en konsentrasjonsgradient mellom de to rommene på brikken som er skilt av membranen. Den mikrofluidiske kanalen er trykt på den nederste PDMS-formen (figur 1F). Når fabrikasjonsprotokollen for sjetongene er fullført, er den lineære kanalen plassert på det nederste laget av NOA 81-klistremerket i kontakt med PMMA-underlaget, som vist i figur 1K. Et innløp og et utløpstilgangspunkt for krystalliseringsløsningen er plassert i hver ende av den lineære kanalen og ser ut som hull (total høyde 90 μm) som det kan ses i figur 2A. For håndtering av krystalliseringsløsningen må kontakter legges til på tilgangspunktene.
<ol><li>Bond-kontakter som er kommersielt tilgjengelige (NanoPort) på innløpet og utløpet på den mikrofluidiske kanalen med raskt epoksylim (figur 2C).</li>
	<li>Velg riktig diameter på PTFE-rørene basert på størrelsen på kontaktene. PTFE-rørene vil bli brukt til innføring av krystalliseringsløsningen i den fluidiske kanalen på brikken. MERK: Kommersielt tilgjengelige sett anbefales for enkel og nøyaktig kontroll over strømningshastigheten og kombineres vanligvis med automatiserte trykkdrevne eller strømningsstyrte (sprøytepumper) systemer for blanding og væskehåndtering. Krystalliseringsløsningen kan imidlertid innføres manuelt i den lineære kanalen med en engangsplastsprøyte. I dette tilfellet foreslås trinn 4.3 til 4.5.</li>
	<li>Fyll en 1 ml engangssprøyte med krystalliseringsoppløsningen. For sjetongene som presenteres i denne protokollen, er 400 μL tilstrekkelig for å fylle opp hele fluidisk kanal.</li>
	<li>Klipp to pipettespisser slik at diameteren på spissen på den ene siden er lik den indre diameteren på PTFE-røret som skal brukes til løsningshåndteringen. Lim de beskårne tipsene på tilgangspunktene på kanalen med raskt epoksylim (figur 2B).</li>
	<li>Koble sprøyten med de beskårne spissene med et stykke PTFE-rør av riktig størrelse og sett inn oppløsningen i kanalen ved å stadig skyve sprøytestempelet sakte.</li>
</ol>5. Protein innkapsling
MERK: Mønsteret på brikken dedikert til å bli brukt som proteinreservoaret forblir så langt åpent for atmosfæren. Følgende protokoll foreslås å nøye begrense proteinprøven i mikrofluidisk chip.
<ol><li>Pipette en dråpe proteinprøven manuelt inne i proteinreservoaret, som ligger rett ved RC dialysemembranen, som vist i figur 2E. Volumet av proteinprøven varierer i henhold til utformingen av brikken og kan være 0,1 eller 0,3 μL.</li>
	<li>Påfør et tynt lag med høyvakuss silikonfett rundt proteinreservoaret.</li>
	<li>Klipp et lite stykke av et 175 μm tykt PMMA-ark og legg det forsiktig over det tynne laget av silikonfettet. PMMA-stykket må dekke hele overflaten av proteinreservoaret der proteinoppløsningen deponeres. MERK: Silikonfettet brukes til å øke lufttettheten og forhindre spredning av proteindråpen. Det er ingen binding eller tetting mellom PMMA-stykket som brukes til å dekke proteinreservoaret og NOA 81-klistremerket. Kontakten mellom dem er et solid/solid grensesnitt. For å produsere en total forsegling og en lufttett innkapsling av proteinprøven, brukes et stykke Kapton-tape som beskrevet i trinn 5.4. MERK: Det er noen ganger vanskelig å begrense proteinprøven i enhetens dedikerte hulrom (proteinreservoar) når et trykkdrevet system brukes til innføring av krystalliseringsløsningen i den fluidiske kanalen (trinn 6.4). For å unngå problemet nevnt ovenfor, bør relativt lavtrykksverdier opprettholdes mens du sirkulerer krystalliseringsløsningen. Et injeksjonstrykk på 20-60 mbar for vandige løsninger eller 50-150 mbar for mer viskøse løsninger (PEGs, glyserol) foreslås19.</li>
	<li>Klipp et stykke Kapton tape (20 μm tykk) stor nok til å dekke PMMA-stykket som er satt over proteinreservoaret og å holde seg på NOA-brikken rundt alle kanter. Proteinprøven er innkapslet i reservoaret og brikken er klar til bruk til krystalliseringseksperimentet, som vist i figur 2C. MERK: Sjetongene kan gjenbrukes flere ganger så lenge dialysemembranen og vedheftet av NOA på PMMA-underlaget ikke forverres. Hvis disse delene av brikken er skadet, observeres lekkasjer som bekrefter at enheten ikke lenger kan brukes. Vasking av chips avhenger av krystalliseringsløsningen. Ved lave viskositetsløsninger (salter, buffere), kan den fluidiske kanalen vaskes ved bare å innføre destillert vann og la den strømme i noen minutter. 400 μL er volumet som kreves for å fullstendig bytte en løsning i kanalen med en annen løsning. Ved mer viskøs løsninger (PEGs, glyserol), anbefales det ikke å gjenbruke chips siden det ikke er tilstrekkelig å vaske kanalen med vann. Den øvre delen av brikken, hvor proteinreservoaret ligger, kan også vaskes med destillert vann og tørkes med trykkluft.</li>
</ol>6. Proteinkrystallisering på chip
<ol><li>Vei lyofilisert høneeggehvitt lysozympulver og oppløses i destillert vann for å oppnå en endelig konsentrasjon på 30 mg ml-1.</li>
	<li>Filtrer proteinoppløsningen gjennom et 0,22 μm filter og sentrifuge i 5 min ved høyeste hastighet ved 293 K for å fjerne alle faste partikler. Bruk det overnaturlige for krystalliseringseksperimentet.</li>
	<li>Forbered 500 μL krystalliseringsløsning som inneholder bufferen og bunnstet i konsentrasjoner gitt i tabell 1. Filtrer oppløsningen gjennom et filter på 0,22 μm.</li>
	<li>Injiser oppløsningen i innløpspunktet på brikken med en sprøyte eller et automatisert trykkdrevet fluidisk system eller en sprøytepumpe, som beskrevet i trinn 4.1-4.5. MERK: Krystalliseringseksperimentet kan oppstå enten under statisk tilstand, hvis mikrofluidkanalen er fylt med krystalliseringsløsningen og settes til side, eller under flytende forhold, hvis det kontinuerlig injiseres inne i kanalen med konstant strømningshastighet. I sistnevnte tilfelle anbefales bruk av et eksternt trykkdrevet system eller sprøytepumpe. Realiseringen av eksperimentet under flytende forhold gir også mulighet til å dynamisk utveksle krystalliseringsløsninger i den fluidiske kanalen. Dermed kan flere eksperimenter utføres mens du bruker samme proteinprøve.</li>
	<li>Når den fluidiske kanalen er fylt med krystalliseringsløsningen, forsegler du innløps- og utløpsportene på brikken med parafilmtape.</li>
	<li>Pipette riktig volum av proteinoppløsningen i proteinreservoaret og kapsle proteinprøven som beskrevet i trinn 5.1-5.4.</li>
	<li>Oppbevar brikken på 293 K. MERK: Krystallisering via dialyse følger en annen kinetisk bane fra eksperimenter utført med dampdiffusjonsmetoden eller batchkrystallisering og avhenger dypt av arten av stupbrakte molekyler som er involvert i diffusjonsprosessen, ifølge målte data51, og det kan ta mer tid før kjerneringen starter. For å forhindre fordampning, hvis noen, i denne perioden, plasser brikken i en fuktighet mettet atmosfære på 293 K.</li>
</ol>7. In situ og on-chip X-ray diffraction
<ol><li>3D-trykt støtte for strålelinjer<ol>
<li>Skriv ut støtten som kan bære opptil tre sjetonger samtidig. Dimensjonene på støtten er de samme som dimensjonene på kommersielle krystalliseringsplater (96 godt / SBS standard) kompatibel med i plate røntgendiffraksjonseksperimenter. MERK: Utskriften av støtten kan tilordnes kommersielle tjenester. Støtten ble designet ved hjelp av en 3D-CAD designprogramvare og vises i figur 3A under on-chip protein krystallisering eksperimenter og i figur 3B under in situ X-ray diffraksjon datainnsamling på BM30A-FIP (ESRF).</li>
		<li>Stabiliser dialysebrikkene på støtten med et enkelt- eller dobbeltsidig tape.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In situ X-ray diffraksjon<ol>
<li>Samle røntgendiffraksjonsdata ved romtemperatur fra krystaller dyrket i proteinreservoaret. Bruk for eksempel røntgenstråler med en energi på 12.656 keV, en fluks på 3,32 x 1010 fotoner s-1 og en strålestørrelse på 250 x 250 μm2. Ta opp diffraksjonsbildene med en ADSC Quantum 315r-detektor med en matrise på 3 x 3 CCD for en aktiv overflate på oppløsning på 315 x 315 mm2 og 9,4 megapiksler. MERK: Diffraksjonsdataene for lysozymkrystallene som dyrkes på dialysebrikkene ble samlet inn ved BM30A-FIP-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Strålestørrelsen, fluksen og detektortypen kan imidlertid være forskjellig i andre røntgenstrålingskilder. 3D-trykt støtte muliggjør datainnsamling med et vinkelområde på -40° til +40° rundt krystallen. Antall lysozymkrystaller eksponert for in situ datainnsamling, antall diffraksjonsmønstre samlet inn for hver krystall, svingningsvinkelområdet per eksponering og eksponeringstiden oppsummeres i tabell 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Databehandling<ol>
<li>Behandle de fullstendige eller delvise datasettene med diffraksjonsmønstrene for lysozymkrys krystallene med XDS-programmet48.</li>
		<li>Generer HKL-filen for hvert datasett og skaler dem ved hjelp av XSCALE-programvaren48.</li>
		<li>Bruk molekylær erstatning med programmet Phaser av CPP4 suite49 og bestemme fasene for modellbygging. For dette trinnet, bruk de kjente 3D-koordinatene til lysozyme fra Protein Data Bank (PDB) oppføring 193L.</li>
		<li>Avgrens strukturen ved hjelp av Phenix52 og inspiser den endelige proteinmodellen ved hjelp av COOT50.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

En mikrofluidisk enhet er utviklet for on-chip proteinkrystallisering med mikrodialysemetoden og in situ X-ray diffraction eksperimenter ved romtemperatur. NOA 81 chips integrere RC dialyse membraner av noen MWCO for å bruke mikrodialyse for on-chip protein krystallisering kan fremstilles. Fabrikasjonsmaterialer med relativt høy røntgengjennomsiktighet ble brukt, noe som gjorde sjetongene kompatible for in situ proteinkrystallografi. Fabrikasjonsmaterialene som komponerer rommet for proteinkrystallisering av enheten (PMMA, Kapton, RC dialysemembran) ble evaluert for å generere lav bakgrunnsstøy. Spesielt observeres bakgrunnsstøyen som genereres av dialysebrikken hovedsakelig ved lav oppløsning (> 6 Å) og påvirker ikke behandlingen av høyoppløselige diffraksjonsdata av de store lysozymkrystallene som kreves for bestemmelse av proteinstruktur. Automatiseringen av datainnsamlingen forsterkes ved hjelp av en 3D-trykt støtte som kan monteres direkte i makromolekylære krystallografistrålelinjer og bære opptil tre mikrobrikker samtidig. På denne måten unngås manuell høsting og manipulering av de skjøre proteinkrys krystallene. Videre foregår datainnsamlingen ved romtemperatur, og unngår behovet for kryobeskyttelse som kan være relatert til konformasjonsendringer fra den innfødte proteinstrukturen2,3.
Bruken av mikroanalyse som en metode for å dyrke krystaller på brikken gjør det mulig å nøyaktig overvåke og kontrollere krystalliseringsprosessen. Som diskutert i innledningen, de fleste av de konvensjonelle protein krystallisering metoder har blitt implementert ved hjelp av mikrofluidiskeenheter 11,14. Fordelene med dialyse for proteinkrystallisering hadde imidlertid ennå ikke blitt fullt utnyttet på mikroskalaen. On-chip mikroanalyse gir mulighet til å studere fasediagrammer og utføre screening og optimalisering av krystalliseringsforhold med samme proteinprøve19. For prototypene som presenteres i dette arbeidet, er proteinforbruket per chip begrenset ned til 0,1 eller 0,3 μL. Basert på det eksperimentelle arbeidet så langt, kommer de mest kritiske trinnene i protokollen ikke fra chipsfabrikasjonsprosedyren, men fra krystalliseringsprosessen. Fabrikasjonsprotokollen inneholder mange trinn, men det er enkelt og muliggjør fabrikasjon av mange enheter (20 til 30 chips) på en enkelt dag i det rene rommet, med relativt rimelige materialer. Imidlertid kan krystallisering av proteiner på chip være en delikat prosedyre på grunn av den iboende stokastiske natur kjernering og krystallvekst, spesielt i mikroskalaen. En case-studie er beskrevet, hvor veletablerte forhold ble brukt til krystallisering av lysozym som ga robuste, veldefinerte krystaller egnet for in situ X-ray diffraksjon datainnsamling. Likevel kan det oppstå vanskeligheter ved bruk av mer utfordrende proteinmål, som membranproteiner, hvor krystalliseringsmediet er mye mer komplisert, fasediagrammer er ikke kjente og velfnende krystalliseringsforhold er ennå ikke godt etablert. Dialysebrikken gir mulighet til å overgå disse vanskelighetene og studere fasediagrammene på chip, uten å kaste den verdifulle og ofte kostbare proteinprøven, ved bare å utveksle krystalliseringsløsningen i mikrofluidisk kanal.
Allsidigheten til mikrofluidiske enheter stammer fra å utnytte mikrodialyse for on-chip proteinkrystallisering for å reversibelt kontrollere krystalliseringsforhold og kartkonsentrasjon og temperatur varierte fasediagrammer ved hjelp av lavt proteinvolum. Videre er enheten kompatibel med in situ X-ray diffraksjon eksperimenter og prototyping av enhetene er billig og rask. Tallrike, isomorfe krystaller av løselige og membranproteiner (i forberedelse) kan dyrkes på chip, og det forventes at alle disse funksjonene kan benyttes til serielle røntgenkrystallografistudier av utfordrende proteinmål ved synchrotron og XFEL-anlegg. Til slutt, utføre on-chip og in situ tid-løst studier er en fremtidig mulighet som kan være av betydelig interesse for det krystallografiske samfunnet. Derfor, ved å dyrke krystaller på dialysebrikken og introdusere reagensene i mikrofluidkanalen, enten manuelt (ved hjelp av en sprøyte) eller automatisk (med et trykkkontrollvæskesystem eller en sprøytepumpe), vil fremtidig innsats fokusere på å bevise at mikrofluidiske chips kan brukes til å utløse tidsløste eksperimenter på synchrotron beamlines.

Belyse den tredimensjonale (3D) strukturen av biologiske makromolekyler er en uopphørlig jakt på strukturell biologi der røntgenkrystallografi forblir den viktigste undersøkelsesteknikken. Anvendt for å løse de strukturelle detaljene i komplekse makromolekyler, som proteiner, tar den sikte på å legge til rette for forståelsen av deres virkningsmekanismer og deres engasjement i ulike biologiske funksjoner. Kraftige røntgenkilder ved synchrotrons og røntgenfrie elektronlasere (XFELs) gir alle verktøyene som kreves for et dypere innblikk i proteinenes struktur ved nær atomoppløsning. Til tross for fordelene som kommer sammen med bruk av røntgenstråler for strukturelle studier, er det iboende begrensninger for røntgenstråling og selve krystalliseringsprosessen. Strålingsskader provosert av høy røntgenfluks og lange eksponeringstider av proteinkrystallen foran røntgenstrålen er restriktive parametere som krystallografer må overgå ved hjelp av kryogenkjøling 1. Det kan imidlertid være å finne de optimale kryooolingsforholdene, siden konformasjonsendringer fra den innfødte proteinstrukturen eller artefaktene kan skjules2,3. Videre indikerer nyere studier at å utføre diffraksjonseksperimenter ved romtemperatur fører til lavere spesifikk strålingsskade4. En annen flaskehals i strukturell biologi er oppkjøpet av velfnærte krystaller med tilstrekkelig størrelse5. Små krystaller er lettere å produsere, spesielt når det gjelder membranproteiner, men er mer utsatt for strålingsskader selv under kryooolingsforhold fordi en høy strålingsdose må rettes i et mindre volum sammenlignet med tilfelle av større proteinkrystaller6. Den nye tilnærmingen til seriekrystallografi7,8 ved synchrotrons og XFELs kan omgå begrensningene av strålingsskader og samtidig utnytte mindre krystaller (200 nm til 2 μm)7 ved å slå sammen datasett fra flere, isomorfe og tilfeldig orienterte proteinkrystaller og profitterer på de tilknyttede teknologiske fremskrittene som femtosecond pulser, kortere eksponeringstider og mikrofokuserterøntgenstråler 5,7,9,10.
Mikrofluidisk teknologi er verdifull for røntgenkrystallografi, og viser mangfoldige fordeler for krystallisering av biologiske makromolekyler og deres strukturelle undersøkelse. Gjennomføring av krystalliseringseksperimenter i mikrofluidiske enheter krever små mengder proteinprøve, og begrenser derfor produksjonskostnadene for disse høyt verdsatte biomakromolekylene og tilrettelegger for screening og optimalisering av mange krystalliseringsforhold. Videre gir det iboende store overflateareal-til-volum-forholdet i mikrofluidisk skala og diffusjonsbegrensede transportfenomener fin kontroll over strømmer og temperatur- eller konsentrasjonsgradienter11,12,13,14,gjengivelse av mikrofluidiske enheter egnet for dyrking av krystaller i ensartet størrelse og utforsking av fasediagrammer15,16,17,18,19. Videre viser mikrofluidiske verktøy et særegent potensial for å løse et annet hinder i proteinkrystallografi, som er prøveleveringen, og nødvendigheten av å håndtere og høste proteinkrystaller før de bruker røntgendiffraksjonseksperimenter. Metoden for on-chip og in situ X-ray krystallografi eliminerer krystall manipulasjon og potensiell forverring av krystallkvalitet før datainnsamling. Et bredt spekter av mikrofluidiske chips som er kompatible for in situ X-ray protein krystallografi har blitt designet, utviklet og testet av mange forskningsgrupper som konfronterer relaterte restriksjoner som oppstår fra arten av mikrofabrikasjonsmaterialer og deres interaksjonermed røntgenstråler 14,19,20,21,22,23. Fabrikasjonsmaterialene må være optisk gjennomsiktige, biologisk inerte og demonstrere høy gjennomsiktighet til røntgenstråling og et optimalt signal-til-støy-forhold under datainnsamling.
De fleste av krystalliseringsmetodene som brukes i konvensjonell proteinkrystallografi24,25 har også blitt implementert i mikrofluidisk skala11,14 for på chip krystallisering og in situ X-ray diffraksjon analyse. Enkelt, hybrid eller flerlags mikrofluidisk apparat som omfatter dampdiffusjon26,fordampning27,fri grensesnittdiffusjon (FID)28, mikrobatch26, eller til og med seeding29 har blitt brukt til å krystallisere løselige og membranproteiner. Høy gjennomstrømning screening og optimalisering av krystalliseringsforhold kan oppnås30,31 i godtbaserte 32, dråpebaserte33, eller ventil-aktiverte34 enheter. In situ Røntgendiffraksjonseksperimenter av utfordrende proteinmål ved romtemperatur er utført i mikrobrikker fabrikkert fra ulike materialer som PDMS (polydimetylsiloxane), COC (syklisk olefinkopolymer), PMMA (poly(metylmetakkrylat))21,22,26,28,29, grafen filmer23, Kapton35, epoxy lim6, eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 og materialenes gjennomsiktighet til røntgenstråling og deres bidrag til bakgrunnsstøy har blitt evaluert. Videre har mikrobrikker blitt designet for å pare in situ og serielle datainnsamlingsstrategier i et enkelt verktøy for røntgenproteinkrystallografieksperimenter ved synchrotron kilder23,35,36 og XFELs7.
Romtemperatur i situ datainnsamling er også implementert i ulike leveringsmetoder og enheter. For eksempel brukte Nogly et al.54 en lipidisk kubikkfase (LCP) injektor for å studere strukturen til den lysdrevne fotonpumpen bakteriorhodopsin (bR) av seriell femtosecond krystallografi (SFX) ved hjelp av en XFEL-kilde. Krystallstrukturen til bR ble løst til 2,3 Å-oppløsning, noe som viser kompatibiliteten til en LCP-injektor med tidsavklart seriell femtosecond krystallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 designet et høy tetthet multi-krystall rutenett, fabrikkert av en 100 eller 200 μm tykk polykarbonat plast med laser-cut hull i ulike størrelser. En ekstra 5 μm tykk polykarbonatfilm kan festes til den ene siden av rutenettet når du bruker enheten til å sitte- eller hengende krystalliseringseksperimenter. Dette høytetthetsgitteret kan brukes på flere måter, da krystaller kan lastes direkte på portene på enheten, eller krystaller kan dyrkes på enheten ved dampdiffusjon eller LCP-metoden. Videre kan rutenettet justeres i en standard magnetisk base og brukes til in situ X-ray datainnsamling ved kryogene eller romtemperaturforhold. Mer nylig utviklet Feiler et al.56 en prøveholder for makromolekylær in situ X-ray krystallografi ved kryogen og omgivelsestemperatur med minimal bakgrunnsstøybidrag. Spesielt består holderen av en plaststøtte, en gjennomsiktig COC-folie og en mikroporisk strukturert polyimidfolie. Den ble designet for å erstatte de vanlige deksellysbildene for å sette opp krystalliseringsdråper, samtidig som den tillater manipulering på stedet som ligand soaking, kompleks formasjon og kryogen beskyttelse uten å åpne krystalliseringsdråpen eller manuelt håndtere krystallene. Videre kan prøveholderen fjernes fra krystalliseringsplaten og plasseres på en magnetisk base for in situ-datainnsamling ved standard goniometerbaserte strålelinjer. For innsamling av omgivelsestemperaturer fjernes COC-folien før forsøket, og bare den 21 μm tykke polyimidefolien bidrar til bakgrunnsspperende, som i dette tilfellet er minimal. Disse eksemplene komponerer bare en liten brøkdel av den pågående forskningen og mangfoldet av allsidige mikrobrikker utviklet for røntgenproteinkrystallografi.
Dialyseproteinkrystalliseringsmetoden har imidlertid ikke vært mye innlemmet i mikrofluidier. Dialyse er en diffusjonsbasert metode som tar sikte på likevekt av bunnkonsentrasjon gjennom en halvgjennomtrengelig membran for å nærme seg den nominelle konsentrasjonen for proteinkrystallisering og muliggjør presis og reversibel kontroll over krystalliseringsforholdene24. Molecular Weight Cut-Off (MWCO) av den halvgjennomtrengelige dialysemembranen kan velges avhengig av makromolekylets molekylvekt og precipitants for å tillate diffusjon av små stupbraptmolekyler samtidig som makromolekylet av interesse beholdes. På grunn av reversibilitet av dialyseprosessen, kan den brukes i kombinasjon med temperaturkontroll for å koble fra og optimalisere kjerne- og krystallvekstuavhengig 37 for å undersøke fasediagrammer ved å endre den utløsende konsentrasjonen mens du bruker samme proteinprøve. Integreringen av membraner i mikrofluidics gjennomgås av de Jong et al.38 og case-studier i biologi implantering dialyse i mikrobrikker kan hovedsakelig listes opp i prøveforberedelse, konsentrasjon eller filtrering applikasjoner39,40,41,42 eller cellerelaterte studier43,44. Pervaporasjon gjennom PDMS ble brukt av Shim et al.37 for å studere kjernering og vekst av xylanase under ulike forhold. Vann gjennomsyret gjennom den 15 μm tykke PDMS-membranen inn i proteinreservoaret på mikrofluidisk enhet, og deretter endret proteinet og bunnkonsentrasjonen.
Protokollen utviklet av Junius et al.19,45 for fabrikasjon av en mikrofluidisk chip kompatibel for både on-chip protein krystallisering via mikroanalyse og in situ X-ray diffraksjon eksperimenter ved romtemperatur er presentert. Protokollen for enhetsfabrikasjonen er direkte inspirert av det banebrytende arbeidet som Studer og kollegaene12,46 for mikromønstrede klistremerker av fotoherdbare tiolenbaserte harpiks NOA 81 bygger inn kommersielt tilgjengelige membraner, ved hjelp av myk avtrykk litografi. En innovativ modifikasjon av metoden resulterte i mikrobrikker som gjør det mulig for bruk av mikroanalyse å nøyaktig overvåke og kontrollere eksperimentelle parametere for on-chip vekst av proteinkrystaller og samtidig utnytte fordelene med mikrofluidics, for eksempel redusert forbruk av proteinprøver per eksperiment (< 1 μL). I et tidligere arbeid ble prinsippene for dialyse som brukes på et makroskalasystem (typisk volum > 20 μL) for screening og optimalisering av krystalliseringsforhold ved å kartlegge temperaturutfellende konsentrasjonsfasediagrammervist 47. I dette arbeidet er en protokoll beskrevet for å produsere dialysemikrobrikker som omfatter regenerert cellulose (RC) dialysemembraner av forskjellige MWCO for å utføre krystalliseringsanalyser på chip og in situ X-ray diffraksjon datainnsamling. Materialene som består av mikrobrikkene har blitt evaluert for deres gjennomsiktighet til røntgen19, og enhetene kan settes rett foran røntgenstrålen for romtemperatur i situ diffraksjonseksperimenter, unntatt manuell håndtering og minimere nedbrytning av skjøre proteinkrystaller. I en case-studie ble høneegg-hvite lysozymkrystaller dyrket på chip via mikrodialyse som genererte en jevnt størrelse befolkning. Mikrobrikken ble deretter montert foran røntgenstrålen med en 3D-trykt støtte19 og komplett in situ diffraksjon datasett ble samlet inn ved romtemperatur fra flere, isomorfe krystaller, viser det høye potensialet og relevansen av chips for synchrotron seriekrystallografi studier av utfordrende makromolekylære mål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Denne protokollen beskriver produksjon av reproduserbare og rimelige mikrofluidiske enheter som dekker hele rørledningen for krystallisering av proteiner på chip med dialysemetoden og tillater in situ enkeltkrystall- eller seriekrystallografieksperimenter ved romtemperatur. Protokollen beskriver fabrikasjonsprosessen av mikrobrikkene, manipuleringen av krystalliseringseksperimentene på brikken og behandlingen av in situ-innsamlede røntgendiffraksjonsdata for den strukturelle belysningen av proteinprøven. Hovedtrekket i denne mikrofabrikasjonsprosedyren ligger på integreringen av en kommersielt tilgjengelig, halvpermetabel regenerert cellulosedialysemembran mellom to lag av brikken. Den molekylære vektutskjæringen av den innebygde membranen varierer avhengig av makromolekylets molekylvekt og utfellingsstoffene. Enheten utnytter fordelene med mikrofluidisk teknologi, for eksempel bruk av minuttvolumer av prøver (< 1 μL) og finjustering over transportfenomener. Brikken sammenlignet dem med dialysemetoden, noe som gir presis og reversibel kontroll over krystalliseringsprosessen og kan brukes til å undersøke fasediagrammer av proteiner i mikroliterskalaen. Enheten er mønstret ved hjelp av en foto uhelbredelig tiolenbasert harpiks med myk avtrykk litografi på et optisk gjennomsiktig polymer substrat. Videre ble bakgrunnsspødingen av materialene som komponerer mikrobrikkene og genererer bakgrunnsstøy evaluert, noe som gjorde brikken kompatibel for in situ X-ray diffraction eksperimenter. Når proteinkrystaller dyrkes på chip opp til en tilstrekkelig størrelse og befolkningsens ensartethet, kan mikrobrikkene monteres direkte foran røntgenstrålen ved hjelp av en 3D-trykt holder. Denne tilnærmingen tar for seg utfordringene som stiger fra bruk av kryobeskyttende midler og manuell høsting i konvensjonelle proteinkrystallografieksperimenter på en enkel og rimelig måte. Komplette røntgendiffraksjonsdatasett fra flere isomorfe lysozymkrystaller dyrket på chip ble samlet inn ved romtemperatur for strukturbestemmelse.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Dette papiret beskriver fabrikasjonsprotokollen for mikrofluidiske chips utviklet for on-chip proteinkrystallisering med dialysemetoden og in situ X-ray diffraction eksperimenter. Mikrofabrikasjonsprosessen gjør det mulig å integrere en halvgjennomtrengelig regenerert cellulosedialysemembran med en molekylær vekt cut-off, mellom to lag av brikken.

Krystallisering av proteiner på chip ved mikroanalyse for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Dette dokumentet beskriver fabrikasjonsprotokollen til mikrofluidiske sjetonger utviklet for proteinkrystallisering på chip med dialysemetoden og in situ røntgendiffraksjonseksperimenter ved romtemperatur. En av de viktigste fordelene med disse mikrochips er valget av fabrikasjonsmaterialer, noe som gjør sjetongene kompatible for in situ røntgendiffraksjonsdatainnsamling ved romtemperatur. Krystalliseringseksperimentene på brikken krever små volumer av proteinprøven, noe som reduserer de totale kostnadene ved å jobbe med disse makromolekylene med høy verdi.On-chip krystallisering eliminerer også manuell høsting av de skjøre proteinkrystallene, ofte brukt i kombinasjon med kryokjøling under konvensjonelle krystallografieksperimenter. Videre bruker våre mikrochips mikrodialyse for proteinkrystallisering, som er en diffusjonsbasert metode som tar sikte på å likevekte utfellingskonsentrasjonen gjennom en halvgjennomtrengelig membran, for å nærme seg cromulentkonsentrasjonen for proteinkrystallisering, og muliggjør presis og reversibel kontroll over krystalliseringsforholdene. Mikrodialyse kombinert med temperaturkontroll kan brukes til å koble kjernedannelse fra krystallvekst for å undersøke fasediagrammer, ved å endre utfellingskonsentrasjonen mens du bruker samme proteinprøve.Først forbereder du 50 gram PDMS silikonbase, og det er herdemiddel i et 10 til ett masseforhold. Bland de to ingrediensene i et beger med en slikkepott. Etter blanding, plasser blandingen i et vakuumkammer for å fjerne alle luftboblene.Sett 25 gram av den forhåndsblandede PDMS inn i den første SU8 for å mestre som inneholder mønstrene til den mikrofluidiske kanalen og søylene, opp til en høyde på omtrent fem millimeter. Hell deretter de resterende 25 gram av PDMS i den andre SU8-mesteren, som bare inneholder mønstrene til søylene. Herd de to PDMS-lagene i en ovn ved 338 kelvin i en time.Klipp de herdede PDMS-lagene rundt mønstrene til SU8-mesterne med en skalpell, og skrell forsiktig av PDMS-formene fra silikonmesterne. Plasser PDMS-formen, med både kanalene og søylene på en stiv mikroskopglasssklie med mønstrene vendt oppover. Klipp et lite stykke regenerert cellulosedialysemembran for å dekke den sentrale søylen i PDMS-formen, som er designet for å være proteinkammeret.Molekylvektkuttet av dialysemembranen velges tilsvarende til molekylvekten til proteinprøven, og utfellingene i krystalliseringsløsningen. Skill deretter forsiktig det tørre stykket av den regenererte cellulosedialysemembranen. Klipp et lite stykke av den separerte dialysemembranen.Størrelsen på dette membranstykket avhenger av utformingen av brikken. Og spesielt avhenger det av dimensjonene til den sentrale søylen. Deponer dialysemembranen på den sentrale søylen i PDMS-formen, som støttes på glasssklie, med søylen og kanalene vendt oppover.Plasser deretter den andre PDMS-formen med bare søylene vendt nedover, på toppen av PDMS-formen som allerede støttes på glasssklie. Juster alle søylene i de to PDMS-formene. Stykket av den regenererte cellulosedialysemembranen er smurt mellom de to sentrale søylene i PDMS-formene.Dette trinnet i fabrikasjonsprosedyren kan utføres under et optisk mikroskop eller bare ved å visuelt inspisere nøye justeringen av alle søylene. Plasser enheten i et vakuumkammer og desiccate i 30 minutter for å fjerne de fangede luftboblene i PDMS-formene, og for å forbedre innsettingen av den fotohelelige NOA-harpiksen, som vil bli beskrevet i neste trinn i denne protokollen. Fjern enheten fra vakuumkammeret og fyll det tomme rommet mellom de to PDMS-formene med den fotohellige tiolinbaserte harpiksen NOA 81 ved kapillær imbibition.Påfør harpiksen på tre av de fire sidene av forsamlingen. Plasser enheten i en krysskobling og herd NOA-harpiksen ved å utsette UV-lyset i åtte sekunder ved hjelp av en kollatert UV-lampe på 35 milliwatt per kvadratcentimeter. Klipp et 175 mikrometer tykt PMMA-stykke i standarddimensjonene til et mikroskopglasssklie, og skrell av plastbeskyttelsen fra hver side av PMMA-stykket.Når den første UV-eksponeringen er fullført, fjerner du den øvre PDMS-formen med en delvis krysskoblet NOA-harpiks som sitter fast på den fra den nederste PDMS-formen og glasssklie. Trykk forsiktig på monteringen av den øvre PDMS-formen og den delvis herdede NOA-harpiksen på PMMA-stykket. Plasser den nye enheten i tverrkoblingen og herd igjen NOA-harpiksen ved eksponering for UV-lys i 60 sekunder.Fjern forsiktig den øvre PDMS-formen. Dialysebrikken laget av den fullstendig kryss-link NOA-harpiksen som bygger inn en regenerert cellulosedialysemembran og støttes på et PMMA-stykke, er klar. Lim kommersielt tilgjengelige kontakter på innløps- og utløpspunktene til den mikrofluidiske kanalen med raskt epoksylim.For væskehåndtering, velg diameteren på PTFE-rørene basert på størrelsen på kontaktene. Rørene brukes til innføring av krystalliseringsløsningen i den fluidiske kanalen til dialysebrikken. Pipette manuelt en dråpe av proteinprøven inne i proteinreservoaret som ligger rett på dialysemembranen.Volumet av proteindråpen avhenger av utformingen av mikrochipen som brukes. Og spesielt avhenger det av volumet av den sentrale søylen, og det kan være 0,1 eller 0,3 mikroliter. Påfør forsiktig et tynt lag med høyvakuum silikonfett rundt proteinbeholderen.Klipp et lite stykke PMMA og legg det forsiktig over det tynne laget av silikonfettet. Klipp et stykke Kapton tape, stor nok til å dekke PMMA-stykket plassert over proteinreservoaret og for å holde seg på NOA-brikken rundt alle kanter. Proteinprøven er innkapslet i reservoaret og brikken kan brukes til krystalliseringseksperimenter.Forbered først ca. 500 mikroliter av krystalliseringsløsningen ved å blande passende volumer av bufferen og de utfellende løsningene. Injiser krystalliseringsløsningen i dialysebrikkens punkt gjennom de fluidiske kontaktene, enten manuelt med sprøyten eller med et automatisert trykkdrevet system. Når den fluidiske kanalen er fylt med krystalliseringsløsningen og ingen luft er fanget inni, forsegler du innløps- og utløpsportene på brikken med Parafilm tape.Pipette riktig volum av proteinoppløsningen i proteinreservoaret og kapsler inn proteinprøven som allerede er beskrevet. Proteinkrystallveksten kan visualiseres og tas opp med et digitalt kamera. For fabrikasjon av dialysemikrochips har vi valgt optisk gjennomsiktige og biologisk inerte materialer, som viser høy kompatibilitet for in situ røntgendiffraksjonseksperimenter.Bakgrunnsstøyen som genereres av materialene som består av proteinrommet til brikken, som er i direkte bane til røntgenstrålen, er evaluert. Proteinrommet består av den regenererte cellulosedialysemembranen, Kapton-båndet og to PMMA-lag, en som brukes som et substrat av mikrochips, og en som brukes til innkapsling av proteinprøven. På dette bildet er illustrert bakgrunnsstøyen generert av Kapton-båndet, den regenererte cellulosedialysemembranen, PMMA-laget og deres montering.Selv om den fotohelelige harpiksen NOA består av mikrochipsens hoveddel, er ikke inkludert i disse målingene, da det ikke er en del av proteinkammeret. Diffuse ringer tilskrevet samspillet mellom røntgenstråler og materialene kan ses for Kapton-båndet ved oppløsningen lavere enn fire angstrom, PMMA mellom fire til åtte angstrom og dialysemembranen mellom fire til fem angstrom. Den totale bakgrunnsstøyen generert av brikken observeres hovedsakelig ved oppløsningen lavere enn seks angstrom, noe som indikerer at behandlingen av lysozyme høyoppløselige diffraksjonsdata ikke påvirkes.Mikrochipsene ble montert foran røntgenstrålen med en 3D-trykt støtte som vi designet for in situ røntgendiffraksjonseksperimenter, og den kan holde opptil tre sjetonger samtidig. Eksperimenter ble utført for å evaluere effektiviteten til mikrochips for on-chip krystallisering av modellløselige proteiner med mikrodialysemetoden. lysozymekrystaller ble dyrket ved 293 kelvin under to forskjellige forhold.Den første krystalliseringstilstanden inneholdt 1,5 molar natriumklorid og 0,1 molar natriumacetat. Den andre krystalliseringstilstanden inneholdt en molar natriumklorid, 0,1 molar natriumacetat og 30% polyetylenglykol 400, og ble valgt for å vise kompatibiliteten til mikrochips og mikrodialysemetoden, med utfellingsmidler av høy molekylvekt og viskøse løsninger. Krystalliseringsforsøkene ble utført under statiske forhold.Når lysozymekrystaller ble dyrket på mikrochipen, ble de brukt til in situ røntgendiffraksjonsforsøk ved romtemperatur. Mikrochipsene ble montert ved bjelkelinjen ved hjelp av 3D-trykt støtte og komplette røntgendiffraksjonsdatasett ble samlet inn fra to lysozymekrystaller. Etter behandling av røntgendiffraksjonsdataene ble elektrontetthetskartet til en enkelt lysozymekrystall oppnådd ved 1,95 angstromoppløsning, som vist i figur A.Figur B viser elektrontetthetskartet oppnådd ved 1,85 angstromsoppløsning.Etter å ha slått sammen to datasett hentet fra to forskjellige lysozymekrystaller, viser begge elektrotetthetskart detaljert strukturell informasjon som kan oppnås ved in situ røntgendiffraksjonseksperimenter utført direkte på dialysemikrochips ved romtemperatur, fra enkelt- eller multippel proteinkrystaller. Vi demonstrerte fabrikasjonsprosedyren for mikrofluidiske enheter designet for proteinkrystallisering på chip med mikrodialysemetoden, og in situ røntgendiffraksjonseksperimenter ved romtemperatur. Vi brukte fabrikasjonsmaterialer med høy røntgengjennomsiktighet, kompatibel for in situ proteinkrystallografi.Diffraksjonsdatasamlingen automatiseres ved bruk av en 3D-trykt støtte for sjetongene, som kan monteres direkte i makromolekylære krystallografistrålelinjer. Allsidigheten til denne mikrochipen stammer fra å bruke mikrodialyse for å reversibel kontrollere krystalliseringsforhold og kartfasediagrammer ved hjelp av lite proteinvolum. Prototypingen av enheten er grei, noe som muliggjør fabrikasjon av opptil 30 mikrochips på en enkelt dag i et rent rom, med relativt billige materialer.Vi forventer at disse egenskapene til sjetongene kan brukes til seriell røntgenkrystallografistudier av mer utfordrende proteinmål.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Dynamisk Elektrokjemisk Måling av kloridioner

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Karakterisering av Hydratiserte Proteiner i vann ved Salvi og TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray Powder Diffraksjon i Conservation Science: Mot Rutine Crystal Structure Bestemmelse av korrosjonsprodukter på Heritage Kunstverk

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantifisere X-Ray fluorescens Data ved hjelp av kart

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Målinger av langtrekkende elektronisk sammenhenger under Femtosecond Diffraksjon eksperimenter utført på nanokrystaller av Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic brikker for In Situ Crystal X-ray Diffraksjon og In Situ dynamisk lysspredning for føljetong krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Viktig metall opptak i Gram-negative bakterier: X-ray fluorescens, Radioisotopes, og cellen fraksjoneres

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-sensitive påvisning av kjemien i batterier gjennom myk X-ray absorpsjon spektroskopi og Resonant uelastisk X-ray spredning

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Biologiske prøver Forberedelse for spesiering ved kryogen temperatur ved bruk av høyoppløselig røntgenabsorpsjonsspektroskopi

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...