Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
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MBS reconoce el apoyo del MI/CNRS en virtud del contrato Instrumentación en los límites 2014-2015. NJ reconoce el Programa Internacional de Investigación doctoral (Irtelis) de la CEA para la Beca de Doctorado. MBS y SJ reconocen la financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie número 722687. MBS, SJ y NJ agradecen a LIPhy (UGA) por el establecimiento de salas limpias para experimentos de microfabricación. IBS reconoce su integración en el Instituto Interdisciplinario de Investigación de Grenoble (IRIG, CEA).

Los autores no tienen nada que revelar.

Se ha desarrollado un dispositivo microfluídico para la cristalización de proteínas en chip con el método de microdiálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Se pueden fabricar chips NOA 81 que integran membranas de diálisis RC de cualquier MWCO con el fin de utilizar microdiálisis para la cristalización de proteínas en chip. Se utilizaron materiales de fabricación con una transparencia de rayos X relativamente alta, lo que hace que los chips sean compatibles con la cristalografía de proteínas in situ. Los materiales de fabricación que componen el compartimento para la cristalización proteica del dispositivo (PMMA, Kapton, membrana de diálisis RC) fueron evaluados para generar bajo ruido de fondo. En concreto, el ruido de fondo generado por el chip de diálisis se observa principalmente a baja resolución (> 6 Å) y no afecta al tratamiento de datos de difracción de alta resolución de los grandes cristales de lysozyme necesarios para la determinación de la estructura proteica. La automatización de la recopilación de datos se amplifica utilizando un soporte impreso en 3D que se puede montar directamente en líneas de haz de cristalografía macromolecular y transportar hasta tres microchips simultáneamente. De esta manera, se evita la recolección manual y la manipulación de los frágiles cristales proteicos. Además, la recopilación de datos se realiza a temperatura ambiente, evitando la necesidad de crioprotección que puede estar relacionada con cambios de conformación de la estructura proteica nativa2,3.
El uso de microdiálisis como método para cultivar cristales en el chip permite monitorear y controlar con precisión el proceso de cristalización. Como se discutió en la introducción, la mayoría de los métodos convencionales de cristalización de proteínas se han implementado utilizando dispositivos microfluídicos11,14. Sin embargo, las ventajas de la diálisis para la cristalización de proteínas aún no se habían explotado plenamente a microescala. La microdiálisis en chip ofrece la posibilidad de estudiar diagramas de fase y realizar la detección y optimización de las condiciones de cristalización con la misma muestra deproteínas 19. Para los prototipos presentados en este trabajo, el consumo de proteínas por chip está limitado a 0,1 o 0,3 μL. Según el trabajo experimental realizado hasta ahora, los pasos más críticos del protocolo no derivan del procedimiento de fabricación de los chips, sino del proceso de cristalización. El protocolo de fabricación incluye muchos pasos, pero es sencillo y permite la fabricación de numerosos dispositivos (20 a 30 chips) en un solo día en la sala limpia, con materiales relativamente baratos. Sin embargo, la cristalización en chip de las proteínas puede ser un procedimiento delicado debido a la naturaleza estocástica intrínsca de la nucleación y el crecimiento de cristales, especialmente en la microescala. Se ha descrito un estudio de caso, donde se utilizaron condiciones bien establecidas para la cristalización de la lisozyme que produjo cristales robustos y bien definidos adecuados para la recopilación de datos de difracción de rayos X in situ. Sin embargo, pueden surgir dificultades por el uso de dianas proteicas más desafiantes, como las proteínas de membrana, donde el medio de cristalización es mucho más complicado, no se conocen diagramas de fase y las condiciones de cristalización bien trabajadas aún no están bien establecidas. El chip de diálisis ofrece la posibilidad de superar estas dificultades y estudiar diagramas de fase en chip, sin eliminar la valiosa y frecuentemente costosa muestra proteica, simplemente intercambiando la solución de cristalización dentro del canal microfluídico.
La versatilidad de los dispositivos microfluídicos se debe a la explotación de la microdiálisis para la cristalización de proteínas en chip con el fin de controlar de forma reversible las condiciones de cristalización y mapear diagramas de fase variados de concentración y temperatura utilizando bajo volumen proteico. Además, el dispositivo es compatible con experimentos de difracción de rayos X in situ y el prototipado de los dispositivos es barato y rápido. Numerosos cristales isórficos de proteínas solubles y de membrana (en preparación) se pueden cultivar en chip y se espera que todas estas características puedan ser utilizadas para estudios de cristalografía de rayos X en serie de objetivos proteicos desafiantes en instalaciones sincrotrón y XFEL. Por último, realizar estudios in situ y en tiempo de espera es una posibilidad futura que podría ser de gran interés para la comunidad cristalográfica. Por lo tanto, al cultivar cristales en el chip de diálisis e introducir los reactivos en el canal microfluídico, ya sea manualmente (usando una jeringa) o automáticamente (con un sistema de fluidos de control de presión o una bomba de jeringa), los esfuerzos futuros se centrarán en demostrar que los chips microfluídicos se pueden utilizar con éxito para desencadenar experimentos resueltos con tiempo en líneas de haz sincrotrón.

Dilucidar la estructura tridimensional (3D) de las macromoléculas biológicas es una búsqueda incesante en la biología estructural donde la cristalografía de rayos X sigue siendo la principal técnica de investigación. Aplicado para desentrañar los detalles estructurales de macromoléculas complejas, como las proteínas, tiene como objetivo facilitar la comprensión de sus mecanismos de acción y su participación en diversas funciones biológicas. Potentes fuentes de rayos X en sincrotrónes y láseres de electrones libres de rayos X (XFELs) proporcionan todas las herramientas necesarias para una visión más profunda de la estructura de las proteínas a una resolución casi atómica. A pesar de las ventajas que conlleva el uso de rayos X para estudios estructurales, existen limitaciones intrínsecos a la radiación de rayos X y al propio proceso de cristalización. El daño por radiación provocado por el alto flujo de rayos X y los largos tiempos de exposición del cristal proteico frente al haz de rayos X son parámetros restrictivos que los cristalógrafos tienen que superar utilizando refrigeración criogénica1. Sin embargo, encontrar las condiciones óptimas de criocooling puede ser laborioso ya que los cambios de conformación de la estructura proteica nativa o artefactos se pueden ocultar2,3. Además, estudios recientes indican que la realización de experimentos de difracción a temperatura ambiente conduce a un menor daño de radiación específico4. Otro cuello de botella en la biología estructural es la adquisición de cristales bien diffracting con un tamaño suficiente5. Los cristales pequeños son más fáciles de producir, especialmente en el caso de las proteínas de membrana, pero son más susceptibles al daño por radiación incluso en condiciones de criooling porque una dosis de radiación alta debe dirigirse en un volumen menor en comparación con el caso de cristales proteicos más grandes6. El nuevo enfoque de la cristalografía en serie7,8 en sincrotrónes y XFELs puede eludir las restricciones de daño por radiación y al mismo tiempo explotar cristales más pequeños (200 nm a 2 μm)7 mediante la fusión de conjuntos de datos de múltiples, cristales proteicos isórficos y orientados aleatoriamente y beneficiándose de los avances tecnológicos asociados como pulsos de femtosegundo, tiempos de exposición más cortos y haces de rayos X microenfocéticos5,7,9,10.
La tecnología microfluídica es valiosa para la cristalografía de rayos X, mostrando múltiples ventajas para la cristalización de macromoléculas biológicas y su investigación estructural. La realización de experimentos de cristalización en dispositivos microfluídicos requiere pequeños volúmenes de muestra de proteínas, lo que limita el costo de producción de estas macromoléculas biológicas de alto valor y facilita la detección y optimización de alto rendimiento de numerosas condiciones de cristalización. Además, la relación superficie-volumen grande inherente a la escala microfluídica y los fenómenos de transporte limitados por difusión permiten un control fino sobre los flujos y los gradientes de temperatura o concentración11,12,13,14,haciendo que los dispositivos microfluídicos sean adecuados para el cultivo de cristales de tamaño uniforme y explorando diagramas de fase15,16,17,18,19. Además, las herramientas microfluídicas muestran un potencial distintivo para abordar otro obstáculo en la cristalografía de proteínas, que es la entrega de muestras, y la necesidad de manejar y cosechar cristales proteicos antes de su uso para experimentos de difracción de rayos X. El método de cristalografía de rayos X in situ e in situ elimina la manipulación de cristales y el deterioro potencial de la calidad del cristal antes de la recopilación de datos. Una amplia gama de chips microfluídicos compatibles con la cristalografía de proteínas de rayos X in situ han sido diseñados, desarrollados y probados por muchos grupos de investigación que se enfrentan a las restricciones relacionadas derivadas de la naturaleza de los materiales de microfabricación y sus interacciones con los rayos X14,19,20,21,22,23. Los materiales de fabricación deben ser ópticamente transparentes, biológicamente inertes y demostrar una alta transparencia a la radiación de rayos X y una relación óptima señal-ruido durante la recopilación de datos.
La mayoría de los métodos de cristalización aplicados en la cristalografía proteica convencional24,25 también se han implementado en la escala microfluídica11,14 para la cristalización de chip y el análisis de difracción de rayos X in situ. Aparatos microfluídicos simples, híbridos o multicapa que incorporan difusión de vapor26,evaporación27,difusión de interfaz libre (FID)28,microbatch26,o incluso la siembra29 se han utilizado para cristalizar proteínas solubles y de membrana. Se puede lograr un alto rendimiento de cribado y optimización de las condiciones de cristalización30,31 en dispositivos32bien basados, basados en gotasde 33o34 accionados por válvulas. In situ Los experimentos de difracción de rayos X de objetivos proteicos desafiantes a temperatura ambiente se han llevado a cabo en microchips fabricados a partir de diversos materiales como PDMS (polidimetillsiloxano), COC (copolímero de olefina cíclico), PMMA (poli(metacrilato metilo))21,22,26,28,29, películas de grafeno23,Kapton35,pegamento epoxi6,o NOA (adhesivo óptico Norland)19 y se han evaluado la transparencia de los materiales a la radiación de rayos X y su contribución al ruido de fondo. Además, se han diseñado microchips para acoplar las estrategias in situ y de recolección de datos en serie en una única herramienta para experimentos de cristalografía de proteínas de rayos X en fuentes sincrotrón23,35,36 y XFELs7.
La recopilación de datos in situ de temperatura ambiente también se ha implementado en varios métodos y dispositivos de entrega. Por ejemplo, Nogly et al.54 utilizaron un inyector de fase cúbica lipídica (LCP) para estudiar la estructura de la bomba fotográfica impulsada por la luz bacteriorhodopsina (bR) mediante cristalografía femtosecond serie (SFX) utilizando una fuente XFEL. La estructura cristalina de bR se resolvió a resolución de 2,3 Å, demostrando la compatibilidad de un inyector LCP con cristalografía femtosecond serie resuelta en el tiempo (TR-SFX). Baxter et al.55 diseñó una rejilla multi-cristal de alta densidad, fabricada por un plástico de policarbonato de 100 o 200 μm de espesor con agujeros cortados por láser de varios tamaños. Una película de policarbonato de 5 μm de espesor adicional se puede fijar a un lado de la cuadrícula cuando se utiliza el dispositivo para experimentos de cristalización de caída sentada o colgante. Esta rejilla de alta densidad se puede utilizar de múltiples maneras, ya que los cristales se pueden cargar directamente en los puertos del dispositivo o los cristales se pueden cultivar en el dispositivo mediante la difusión de vapor o el método LCP. Además, la rejilla se puede ajustar en una base magnética estándar y utilizarse para la recopilación in situ de datos de rayos X en condiciones criogénicas o de temperatura ambiente. Más recientemente, Feiler et al.56 desarrolló un soporte de muestra para cristalografía macromolecular in situ de rayos X a temperatura criogénica y ambiental con una contribución mínima al ruido de fondo. En concreto, el soporte consta de un soporte plástico, una lámina COC transparente y una lámina de poliimida estructurada microporosa. Fue diseñado para reemplazar las diapositivas de cubierta de uso común para configurar gotas de cristalización, al tiempo que permitía la manipulación in situ, como remojo de ligando, formación compleja y protección criogénica sin abrir la gota de cristalización o manipular manualmente los cristales. Además, el soporte de muestra se puede extraer de la placa de cristalización y colocarse en una base magnética para la recopilación de datos in situ en líneas de haz estándar basadas en goniómetros. Para la recopilación de datos de temperatura ambiente, la lámina COC se elimina antes del experimento y sólo la lámina de poliimida de 21 μm de espesor contribuye a la dispersión de fondo, que en este caso es mínima. Estos ejemplos componen sólo una pequeña fracción de la investigación en curso y la multitud de microchips versátiles desarrollados para la cristalografía de proteínas de rayos X.
Sin embargo, el método de cristalización de proteínas de diálisis no se ha incorporado ampliamente dentro de los microfluídicos. La diálisis es un método basado en la difusión que busca el equilibrio de la concentración precipitada a través de una membrana semipermeable con el fin de acercarse a la concentración nominal para la cristalización de proteínas y permite un control preciso y reversible sobre las condiciones de cristalización24. El Corte de Peso Molecular (MWCO) de la membrana de diálisis semi-permeable se puede elegir dependiendo del peso molecular de la macromolécula y los precipitantes para permitir la difusión de pequeñas moléculas precipitantes mientras se conserva la macromolécula de interés. Debido a la reversibilidad del proceso de diálisis, se puede utilizar en combinación con el control de temperatura para desacoplar y optimizar la nucleación y el crecimiento del cristal independientemente37 para investigar diagramas de fase mediante la alteración de la concentración precipitante mientras se utiliza la misma muestra de proteínas. La integración de las membranas en microfluídicas es revisada por de Jong et al.38 y los estudios de caso en biología que implantan diálisis en microchips pueden figurar principalmente en las aplicaciones de preparación, concentración o filtración de muestras39,40,41,42 o estudios relacionados con células43,44. Pervaporation through PDMS fue utilizado por Shim et al.37 para estudiar la nucleación y el crecimiento de la xilanase en diversas condiciones. Agua permeada a través de la membrana PDMS de 15 μm de espesor en el depósito de proteínas del dispositivo microfluídico, alterando posteriormente la proteína y la concentración precipitante.
Se presenta el protocolo desarrollado por Junius et al.19,45 para la fabricación de un chip microfluídico compatible tanto para la cristalización de proteínas en chip a través de microdiálisis como para experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. El protocolo para la fabricación de dispositivos se inspira directamente en el trabajo pionero realizado por Studer y compañeros de trabajo12,46 para pegatinas micro-patterned de resina fotocurable a base de tiolene NOA 81 que incrusta membranas disponibles comercialmente, utilizando litografía de impresión suave. Una modificación innovadora del método dio lugar a microchips que permitieron el uso de microdiálisis para monitorear y controlar con precisión los parámetros experimentales para el crecimiento en chip de los cristales proteicos y explotar simultáneamente las ventajas de la microfluidics, como la reducción del consumo de muestras de proteínas por experimento (<1 μL). En un trabajo anterior, se demostraron47los principios de diálisis aplicados a un sistema de macroescala (volumen típico >20 μL) para la detección y optimización de las condiciones de cristalización mediante la cartografía de diagramas de fase de concentración precipitantes a temperatura. En este trabajo, se describe un protocolo para producir microchips de diálisis que incorporan membranas de diálisis de celulosa regenerada (RC) de diferentes MWCO con el fin de realizar ensayos de cristalización en chip y recolección de datos de difracción de rayos X in situ. Los materiales que comprenden los microchips han sido evaluados por su transparencia a los rayos X19 y los dispositivos se pueden colocar directamente delante del haz de rayos X para experimentos de difracción in situ a temperatura ambiente, excluyendo el manejo manual y minimizando la degradación de frágiles cristales proteicos. En un estudio de caso, los cristales de lysozyme de clara de huevo de gallina se cultivaron en chip a través de la microdiálisis que genera una población de tamaño uniforme. El microchip se montó entonces frente al haz de rayos X con un soporte impreso en 3D19 y se recogieron conjuntos de datos de difracción in situ completos a temperatura ambiente a partir de múltiples cristales isórfnos, demostrando el alto potencial y la relevancia de los chips para estudios de cristalografía serie sincrotrón de objetivos macromoleculares desafiantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Este protocolo describe la fabricación de dispositivos microfluídicos reproducibles y baratos que cubren toda la tubería para cristalizar proteínas en el chip con el método de diálisis y permitir experimentos in situ de cristal único o cristalografía serial a temperatura ambiente. El protocolo detalla el proceso de fabricación de los microchips, la manipulación de los experimentos de cristalización en chip y el tratamiento de los datos de difracción de rayos X recogidos in situ para la aclaración estructural de la muestra proteica. La característica principal de este procedimiento de microfabricación reside en la integración de una membrana de diálisis de celulosa regenerada semipermeable y disponible comercialmente entre dos capas del chip. El corte de peso molecular de la membrana incrustada varía dependiendo del peso molecular de la macromolécula y los precipitantes. El dispositivo explota las ventajas de la tecnología microfluídica, como el uso de volúmenes minuciosos de muestras (<1 μL) y el ajuste fino sobre los fenómenos de transporte. El chip los combinó con el método de diálisis, proporcionando un control preciso y reversible sobre el proceso de cristalización y se puede utilizar para investigar diagramas de fase de proteínas a escala de microlitro. El dispositivo está estampado utilizando una resina fotocurable a base de tiolene con litografía de impresión suave en un sustrato polimérico ópticamente transparente. Además, se evaluó la dispersión de fondo de los materiales que componen los microchips y generan ruido de fondo, lo que hace que el chip sea compatible con experimentos de difracción de rayos X in situ. Una vez que los cristales proteicos se cultivan en chip hasta un tamaño adecuado y uniformidad poblacional, los microchips se pueden montar directamente delante del haz de rayos X con la ayuda de un soporte impreso en 3D. Este enfoque aborda los desafíos que se derivan del uso de crioprotectores y la recolección manual en experimentos convencionales de cristalografía proteica a través de una manera fácil y barata. Se recogieron conjuntos completos de datos de difracción de rayos X a partir de múltiples cristales isórfidos de liozima cultivados en chip a temperatura ambiente para determinar la estructura.

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Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Este trabajo detalla el protocolo de fabricación de chips microfluídicos desarrollado para la cristalización de proteínas en chip con el método de diálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ. El proceso de microfabricación permite integrar una membrana de diálisis de celulosa regenerada semipermeable con cualquier corte de peso molecular, entre dos capas del chip.

Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Este trabajo describe el protocolo de fabricación de chips microfluídicos desarrollado para la cristalización de proteínas en chip con el método de diálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Una de las principales ventajas de estos microchips es la elección de materiales de fabricación, haciendo que los chips sean compatibles para la recopilación in situ de datos de difracción de rayos X a temperatura ambiente. Los experimentos de cristalización en chip requieren pequeños volúmenes de la muestra de proteínas, reduciendo el costo total de trabajar con estas macromoléculas de alto valor.La cristalización en chip también elimina la recolección manual de los frágiles cristales proteicos, aplicados con frecuencia en combinación con el enfriamiento criollo durante los experimentos convencionales de cristalografía. Además, nuestros microchips utilizan microdiálisis para la cristalización de proteínas, que es un método basado en la difusión con el objetivo de equilibrar la concentración precipitante a través de una membrana semipermeable, con el fin de acercarse a la concentración cromulent para la cristalización de proteínas, y permite un control preciso y reversible sobre las condiciones de cristalización. La microdiálisis combinada con el control de temperatura se puede utilizar para desvincular la nucleación del crecimiento del cristal para investigar diagramas de fase, cambiando la concentración precipitante mientras se utiliza la misma muestra de proteínas.Primero prepare 50 gramos de base de silicona PDMS y su agente de curado en una relación de masa de 10 a uno. Mezcle los dos ingredientes en un vaso de precipitados con una espátula. Después de mezclar, coloque la mezcla en una cámara de vacío para eliminar todas las burbujas de aire.Poner 25 gramos del PDMS premezclado en el primer SU8 para dominar que contiene los patrones del canal microfluídico y los pilares, hasta una altura de aproximadamente cinco milímetros. A continuación, vierta los 25 gramos restantes del PDMS en el segundo maestro SU8, que contiene sólo los patrones de los pilares. Cura las dos capas PDMS en un horno a 338 kelvin durante una hora.Corta las capas PDMS curadas alrededor de los patrones de los maestros SU8 con un bisturí, y despega suavemente los moldes PDMS de los maestros de silicona. Coloque el molde PDMS, con los canales y los pilares en una diapositiva rígida de vidrio microscopio con los patrones orientados hacia arriba. Cortar un pequeño trozo de membrana de diálisis de celulosa regenerada con el fin de cubrir el pilar central del molde PDMS, que está diseñado para ser la cámara de proteínas.El corte de peso molecular de la membrana de diálisis se elige en consecuencia para el peso molecular de la muestra de proteínas, y los precipitantes de la solución de cristalización. A continuación, separe cuidadosamente la pieza seca de la membrana de diálisis de celulosa regenerada. Corta un pequeño trozo de la membrana de diálisis separada.El tamaño de esta pieza de membrana depende del diseño del chip. Y específicamente, depende de las dimensiones del pilar central. Deposite la pieza de la membrana de diálisis en el pilar central del molde PDMS, que se apoya en el tobogán de vidrio, con su pilar y canales orientados hacia arriba.A continuación, coloque el segundo molde PDMS con sólo los pilares orientados hacia abajo, en la parte superior del molde PDMS que ya está soportado en la diapositiva de vidrio. Alinee todos los pilares de los dos moldes PDMS. La pieza de la membrana de diálisis de celulosa regenerada está intercalada entre los dos pilares centrales de los moldes PDMS.Este paso del procedimiento de fabricación se puede llevar a cabo bajo un microscopio óptico o simplemente inspeccionando visualmente cuidadosamente la alineación de todos los pilares. Coloque el conjunto en una cámara de vacío y desece durante 30 minutos con el fin de eliminar las burbujas de aire atrapadas dentro de los moldes PDMS, y para mejorar la inserción de la resina NOA fotocurable, que se describirá en el siguiente paso de este protocolo. Retire el conjunto de la cámara de vacío y llene el espacio vacío entre los dos moldes PDMS con la resina fotocurable a base de tiolina, NOA 81, por imbibición capilar.Aplique la resina en tres de los cuatro lados del ensamblaje. Coloque el conjunto en un enlazador cruzado y cure la resina NOA exponiendo a la luz UV durante ocho segundos, usando una lámpara UV colimada de 35 milivatios por centímetro cuadrado. Corta una pieza de PMMA de 175 micrómetros de espesor en las dimensiones estándar de un tobogán de vidrio microscopio y despega la protección plástica de cada lado de la pieza PMMA.Una vez completada la primera exposición a los rayos UV, retire el molde SUPERIOR PDMS con una resina NOA parcialmente cruzada pegada en él del molde PDMS inferior y del tobogán de vidrio. Presione suavemente el conjunto del molde SUPERIOR PDMS y la resina NOA parcialmente curada en la pieza PMMA. Coloque el nuevo conjunto en el enlazador cruzado y cure de nuevo la resina NOA mediante la exposición a la luz UV durante 60 segundos.Retire cuidadosamente el molde SUPERIOR PDMS. El chip de diálisis hecho de la resina NOA totalmente transversal que incrusta una membrana de diálisis de celulosa regenerada y está apoyado en una pieza DEM está listo. Enlace conectores disponibles comercialmente en los puntos de entrada y salida del canal microfluídico con pegamento epoxi rápido.Para la manipulación de fluidos, elija el diámetro de los tubos PTFE en función del tamaño de los conectores. Los tubos se utilizan para la introducción de la solución de cristalización dentro del canal fluido del chip de diálisis. Pipeta manualmente una gota de la muestra de proteína dentro del depósito de proteínas situado justo en la membrana de diálisis.El volumen de la gota de proteína depende del diseño del microchip que se está utilizando. Y en concreto, depende del volumen del pilar central, y puede ser de 0,1 o 0,3 microlitros. Aplique cuidadosamente una fina capa de grasa de silicona de alto vacío alrededor del depósito de proteínas.Corta un pequeño trozo de PMMA y colóquelo suavemente por encima de la fina capa de la grasa de silicona. Corta un trozo de cinta Kapton, lo suficientemente grande como para cubrir la pieza de PMMA colocada sobre el depósito de proteínas y pegarse en el chip NOA alrededor de todos los bordes. La muestra de proteínas está encapsulada dentro del depósito y el chip se puede utilizar para experimentos de cristalización.Primero prepare aproximadamente 500 microlitros de la solución de cristalización mezclando volúmenes apropiados del búfer y las soluciones precipitantes. Inyecte la solución de cristalización en el punto del chip de diálisis a través de los conectores fluidos, ya sea manualmente con la jeringa o con un sistema automatizado impulsado por presión. Una vez que el canal fluido esté lleno de la solución de cristalización y no haya aire atrapado en su interior, selle los puertos de entrada y salida del chip con cinta Parafilm.Pipetear el volumen adecuado de la solución proteica dentro del depósito de proteínas y encapsular la muestra de proteínas como ya se ha descrito. El crecimiento del cristal proteico se puede visualizar y grabar con una cámara digital. Para la fabricación de los microchips de diálisis, hemos elegido materiales ópticamente transparentes y biológicamente inertes, demostrando una alta compatibilidad para experimentos de difracción de rayos X in situ.Se ha evaluado el ruido de fondo generado por los materiales que comprenden el compartimento proteico del chip, que se encuentra en el camino directo del haz de rayos X. El compartimento proteico consiste en la membrana de diálisis de celulosa regenerada, la cinta Kapton y dos capas de PMMA, una utilizada como sustrato de los microchips, y otra utilizada para la encapsulación de la muestra proteica. En esta imagen, se ilustra el ruido de fondo generado por la cinta Kapton, la membrana de diálisis de celulosa regenerada, la capa PMMA y su ensamblaje.A pesar de que la resina fotocurable NOA comprende el cuerpo principal de los microchips, no está incluida en estas mediciones ya que no forma parte de la cámara proteica. Los anillos difusos atribuidos a las interacciones de los rayos X con los materiales se pueden ver para la cinta Kapton a la resolución inferior a cuatro angstroms, el PMMA entre cuatro y ocho angstroms, y la membrana de diálisis entre cuatro y cinco angstroms. El ruido de fondo total generado por el chip se observa principalmente a la resolución inferior a seis angstrom, lo que indica que el tratamiento de los datos de difracción de alta resolución de lysozyme no se ve afectado.Los microchips se montaron frente al haz de rayos X con un soporte impreso en 3D que diseñamos para experimentos de difracción de rayos X in situ, y puede contener hasta tres chips simultáneamente. Se llevaron a cabo experimentos con el fin de evaluar la eficiencia de los microchips para la cristalización en chip de proteínas solubles en modelos con el método de microdiálisis. Los cristales de lysozyme se cultivaron a 293 kelvin en dos condiciones diferentes.La primera condición de cristalización contenía 1,5 cloruro de sodio molar y 0,1 acetato de sodio molar. La segunda condición de cristalización contenía un cloruro de sodio molar, acetato de sodio molar de 0,1 y 30% polietileno glicol 400, y fue elegido para mostrar la compatibilidad de los microchips y el método de microdiálisis, con precipitantes de alto peso molecular y soluciones viscosas. Los experimentos de cristalización se llevaron a cabo en condiciones estáticas.Una vez que los cristales de lysozyme fueron cultivados en el microchip, se utilizaron para experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Los microchips se montaron en la línea de haz con la ayuda del soporte impreso en 3D y se recogieron conjuntos completos de datos de difracción de rayos X a partir de dos cristales de lisozyme. Después del tratamiento de los datos de difracción de rayos X, el mapa de densidad de electrones de un solo cristal de lysozyme se obtuvo a resolución de 1,95 angstrom, como se muestra en la figura A.Figure B muestra el mapa de densidad de electrones obtenido con resolución de 1,85 angstroms.Después de fusionar dos conjuntos de datos obtenidos de dos cristales de liozima diferentes, ambos mapas de densidad electro muestran información estructural detallada que se puede obtener mediante experimentos de difracción de rayos X in situ realizados directamente en los microchips de diálisis a temperatura ambiente, a partir de cristales de proteínas simples o múltiples. Demostramos el procedimiento de fabricación de dispositivos microfluídicos diseñados para la cristalización de proteínas en chip con el método de microdiálisis, y experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Utilizamos materiales de fabricación con alta transparencia de rayos X, compatibles con cristalografía de proteína in situ.La recopilación de datos de difracción se automatiza con el uso de un soporte impreso en 3D para los chips, que se puede montar directamente en líneas de haz de cristalografía macromolecular. La versatilidad de este microchip se debe al uso de microdiálisis para controlar de forma reversible las condiciones de cristalización y mapear diagramas de fase utilizando un pequeño volumen proteico. El prototipo del dispositivo es sencillo, lo que permite la fabricación de hasta 30 microchips en un solo día en una habitación limpia, con materiales relativamente baratos.Esperamos que estas características de los chips se pueden utilizar para estudios de cristalografía de rayos X en serie de objetivos proteicos más desafiantes.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Investigación

Química

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Dinámica electroquímico Medición de cloruro de iones

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Difracción de polvo de rayos X en Ciencias de la Conservación: Hacia rutina de determinación de estructura cristalina de los productos de corrosión de objetos de arte del patrimonio

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Cuantificar datos de fluorescencia de rayos x usando mapas

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Medidas de largo alcance correlaciones electrónicas durante los experimentos de difracción de femtosegundo realizadas en nanocristales de buckminsterfullereno

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Absorción de Metal esencial en bacterias Gram-negativas: rayos x de fluorescencia, radioisótopos y fraccionamiento de la célula

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Detección sensible al elemental de la química en las baterías a través de espectroscopia de absorción de rayos x blandos y dispersión inelástica resonante de la radiografía

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...