Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

MBS bekräftar stödet från MI / CNRS enligt kontraktet Instrumentation vid gränserna 2014-2015. NJ uppmärksammar CEA:s internationella forskarutbildning (Irtelis) för forskarstipendiet. MBS och SJ erkänner finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtal nummer 722687. MBS, SJ och NJ tackar LIPhy (UGA) för renrumsanläggningen för mikrotillverkningsexperiment. IBS erkänner integrationen i Grenobles tvärvetenskapliga forskningsinstitut (IRIG, CEA).

Författarna har inget att avslöja.

En mikrofluidisk enhet har utvecklats för proteinkristallisering på chip med mikrodialysmetoden och in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur. NOA 81-chips som integrerar RC-dialysmembran i någon MWCO för att använda mikrodialys för kristallisering av protein på chip kan tillverkas. Tillverkningsmaterial med relativt hög röntgentransparens användes, vilket gjorde chipsen kompatibla för in situ-proteinkristallografi. De tillverkningsmaterial som komponerar facket för proteinkristallisering av enheten (PMMA, Kapton, RC dialysmembran) utvärderades för att generera lågt bakgrundsljud. Specifikt observeras bakgrundsljudet som genereras av dialyschipet främst vid låg upplösning (> 6 Å) och påverkar inte behandlingen av högupplösta diffraktionsdata för de stora lysozymekristaller som krävs för bestämning av proteinstrukturer. Automatiseringen av datainsamlingen förstärks med hjälp av ett 3D-printat stöd som kan monteras direkt i makromolekylära kristallografistrålar och bära upp till tre mikrochips samtidigt. På så sätt undviks manuell skörd och manipulering av de bräckliga proteinkristallerna. Dessutom sker datainsamlingen vid rumstemperatur, vilket undviker behovet av kryoprotection som kan relateras till konformationsförändringar från den inhemska proteinstrukturen2,3.
Användningen av mikrodialys som metod för att odla kristaller på chip gör det möjligt att noggrant övervaka och kontrollera kristalliseringsprocessen. Som diskuterats i introduktionen har de flesta av de konventionella proteinkristalliseringsmetoderna implementerats med hjälp av mikrofluidiskaenheter 11,14. Fördelarna med dialys för proteinkristallisering hade dock ännu inte utnyttjats fullt ut i mikroskalan. Mikrodialys på chip ger möjlighet att studera fasdiagram och utföra screening och optimering av kristalliseringsförhållanden med samma proteinprov19. För de prototyper som presenteras i detta arbete är proteinförbrukningen per chip begränsad ner till 0,1 eller 0,3 μL. Baserat på det experimentella arbetet hittills härrör de mest kritiska stegen i protokollet inte från chipsens tillverkningsprocedur utan från kristalliseringsprocessen. Tillverkningsprotokollet innehåller många steg men det är enkelt och möjliggör tillverkning av många enheter (20 till 30 chips) på en enda dag i det rena rummet, med relativt billiga material. Kristalliseringen på chip av proteiner kan dock vara ett känsligt förfarande på grund av den inneboende stokastiska karaktären hos nukleation och kristalltillväxt, särskilt i mikroskalan. En fallstudie har beskrivits, där väletablerade villkor användes för kristallisering av lysozyme som gav robusta, väldefinierade kristaller lämpliga för in situ X-ray diffraktion data insamling. Ändå kan svårigheter uppstå genom användning av mer utmanande proteinmål, såsom membranproteiner, där kristalliseringsmediet är mycket mer komplicerat, fasdiagram är inte kända och väl fungerande kristalliseringsförhållanden ännu inte är väletablerade. Dialyschipet ger möjlighet att överträffa dessa svårigheter och studiefasdiagram på chip, utan att kassera det värdefulla och ofta kostsamma proteinprovet, genom att bara byta kristalliseringslösningen inom den mikrofluidiska kanalen.
Mångsidigheten hos mikrofluidiska enheter härrör från att utnyttja mikrodialys för proteinkristallisering på chip för att reversibelt kontrollera kristalliseringsförhållanden och kartlägga koncentration och temperatur varierade fasdiagram med låg proteinvolym. Dessutom är enheten kompatibel med in situ-röntgendiffraktionsexperiment och prototyperna av enheterna är billiga och snabba. Många isomorfa kristaller av lösliga och membranproteiner (som beredning) kan odlas på chip och det förväntas att alla dessa funktioner kan användas för seriella röntgenkristallografistudier av utmanande proteinmål vid synkrotron- och röntgenanläggningar. Slutligen, att utföra on-chip och in situ tidsavgjorda studier är en framtida möjlighet som kan vara av betydande intresse för det kristallografiska samhället. Genom att odla kristaller på dialyschipet och introducera reagenserna i den mikrofluidiska kanalen, antingen manuellt (med en spruta) eller automatiskt (med ett tryckkontrollvätskesystem eller en sprutpump), kommer framtida ansträngningar att fokusera på att bevisa att mikrofluidchipsen framgångsrikt kan användas för att utlösa tidsupplösta experiment på synkrotronstrålar.

Att belysa den tredimensionella (3D) strukturen hos biologiska makromolekyler är en ouppenbar strävan i strukturbiologi där röntgenkristallografi fortfarande är den huvudsakliga undersökningstekniken. Den tillämpas för att riva upp de strukturella detaljerna i komplexa makromolekyler, såsom proteiner, och syftar till att underlätta förståelsen av deras verkningsmekanismer och deras deltagande i olika biologiska funktioner. Kraftfulla röntgenkällor vid synkrotroner och röntgenfria elektronlasrar (XFELs) ger alla verktyg som krävs för en djupare inblick i proteinernas struktur vid nära atomupplösning. Trots de fördelar som följer med användningen av röntgenstrålar för strukturella studier finns det inneboende begränsningar för röntgenstrålning och själva kristalliseringsprocessen. Strålningsskador som orsakas av högt röntgenflöde och långa exponeringstider för proteinkristallen framför röntgenstrålen är restriktiva parametrar som kristallografer måste överträffa med kryogenkylning 1. Att hitta de optimala kryokylningsförhållandena kan dock vara mödosamt eftersom konformationsförändringar från den inhemska proteinstrukturen eller artefakterna kan döljas2,3. Dessutom visar nyligen genomförda studier att utföra diffraktionsexperiment vid rumstemperatur leder till lägre specifika strålningsskador4. En annan flaskhals i strukturbiologin är förvärvet av väldriffande kristaller med en tillräcklig storlek5. Små kristaller är lättare att producera, särskilt när det gäller membranproteiner, men är mer mottagliga för strålningsskador även under kryokylningsförhållanden eftersom en hög stråldos måste riktas i en mindre volym jämfört med fallet med större proteinkristaller6. Den nya metoden medseriekristallografi 7,8 vid synkrotroner och XFELs kan kringgå begränsningarna av strålningsskador och samtidigt utnyttja mindre kristaller (200 nm till 2 μm)7 genom att slå samman datauppsättningar från flera, isomorfa och slumpmässigt orienterade proteinkristaller och dra nytta av tillhörande tekniska framsteg som femtosekviska pulser, kortare exponeringstider och mikrofokuserade röntgenstrålar5,7,9,10.
Mikrofluidisk teknik är värdefull för röntgenkristallografi, som uppvisar många fördelar för kristalliseringen av biologiska makromolekyler och deras strukturella undersökning. Att genomföra kristalliseringsexperiment i mikrofluidiska enheter kräver små volymer proteinprov, vilket begränsar produktionskostnaden för dessa högt värderade biomakromolekyler och underlättar screening och optimering av många kristalliseringsförhållanden. Dessutom möjliggör det inneboende förhållandet mellan stora ytor och volym vid mikrofluidisk skala och diffusionsbegränsade transportfenomen fin kontroll över flöden och temperatur- eller koncentrationsgradienter11,12,13,14, vilket gör mikrofluidiska anordningar lämpliga för odling av kristaller av enhetlig storlek och utforskande fasdiagram15,16,17,18,19. Dessutom uppvisar mikrofluidiska verktyg en särskiljande potential att ta itu med ett annat hinder i proteinkristallografi, som är provleveransen, och behovet av att hantera och skörda proteinkristaller innan de används för röntgendiffraktionsexperiment. Metoden för röntgenkristallografi på chip och in situ eliminerar kristallmanipulationen och den potentiella försämringen av kristallkvaliteten före datainsamlingen. Ett brett utbud av mikrofluidiska chips som är kompatibla för in situ-röntgenproteinkristallografi har utformats, utvecklats och testats av många forskargrupper som konfronterar de relaterade begränsningarna som följer av mikrotillverkningsmaterialens natur och deras interaktioner med röntgenstrålar14,19,20,21,22,23. Tillverkningsmaterialen måste vara optiskt transparenta, biologiskt inerta och uppvisa hög transparens mot röntgenstrålning och ett optimalt signal-till-brusförhållande under datainsamlingen.
De flesta kristalliseringsmetoder som tillämpas i konventionell proteinkristallografi24,25 har också implementerats på den mikrofluidiskaskalan 11,14 för på spånkristallisering och in situ X-ray diffraktionsanalys. Enkel, hybrid eller flerskiktad mikrofluidisk apparat som innehåller ångdiffusion26, avdunstning27, gratis gränssnittsdiffusion (FID)28, mikrobatch26, eller till och medsådd 29 har använts för att kristallisera lösliga och membranproteiner. Screening med hög genomströmning och optimering av kristalliseringsförhållanden kanuppnås 30,31 ivälbaserad 32,droppbaserad33, eller ventil-aktiverade34 enheter. In situ Röntgendiffraktionsexperiment av utmanande proteinmål vid rumstemperatur har utförts i mikrochips tillverkade av olika material som PDMS (polydimethylsiloxane), COC (cyklisk olefin copolymer), PMMA (poly(metylmetakrylat))21,22,26,28,29, grafenfilmer23, Kapton35, epoxilim6, eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 och materialens transparens för röntgenstrålning och deras bidrag till bakgrundsljud har utvärderats. Dessutom har mikrochips utformats för att koppla in situ och seriella datainsamlingsstrategier i ett enda verktyg för röntgenproteinkristallografiexperiment vid synkrotronkällor23,35,36 och XFELs7.
Rumstemperatur på plats datainsamling har också implementerats i olika leveransmetoder och enheter. Till exempel använde Nogly et al.54 en lipidisk kubikfasinjektor (LCP) för att studera strukturen hos den ljusdrivna fotonpumpen bacteriorhodopsin (bR) genom seriell femtosekonkristallografi (SFX) med hjälp av en XFEL-källa. Kristallstrukturen i bR löstes till 2,3 Å-upplösning, vilket visar kompatibiliteten hos en LCP-injektor med tidsupplöst seriell femtosekonkristallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 konstruerade ett multikristallnät med hög densitet, tillverkat av en 100 eller 200 μm tjock polykarbonatplast med laserskurna hål av olika storlekar. Ytterligare 5 μm tjock polykarbonatfilm kan fästas på ena sidan av gallret när du använder enheten för sittande eller hängande kristalliseringsexperiment. Detta rutnät med hög densitet kan användas på flera sätt eftersom kristaller kan laddas direkt på enhetens portar eller kristaller kan odlas på enheten genom ångdiffusion eller LCP-metoden. Dessutom kan nätet justeras i en standardmagnetisk bas och användas för insamling av röntgendata på plats vid kryogena förhållanden eller rumstemperaturförhållanden. På senare tid utvecklade Feiler et al.56 en provhållare för makromolekylär in situ-röntgenkristallografi vid kryogen och omgivningstemperatur med minimalt bakgrundsljudbidrag. Specifikt består hållaren av ett plaststöd, en transparent COC-folie och en mikroporös strukturerad polyimidfolie. Det utformades för att ersätta de vanliga täckbilderna för att ställa in kristalliseringsdroppar, samtidigt som man tillåter manipulering på plats som ligand blötläggning, komplex formation och kryogent skydd utan att öppna kristalliseringsdropp eller manuellt hantera kristallerna. Dessutom kan provhållaren avlägsnas från kristalliseringsplattan och placeras på en magnetisk bas för in situ-datainsamling vid standard goniometerbaserade strållinjer. För datainsamling av omgivningstemperatur avlägsnas COC-folien före experimentet och endast den 21 μm tjocka polyimidfolien bidrar till bakgrundsspridning, vilket i detta fall är minimalt. Dessa exempel utgör bara en liten del av den pågående forskningen och den mängd mångsidiga mikrochips som utvecklats för röntgenproteinkristallografi.
Dialysproteinkristalliseringsmetoden har dock inte införlivats i stor utsträckning inom mikrofluidik. Dialys är en diffusionsbaserad metod som syftar till jämvikt av utfällningskoncentrationen genom ett halvgenomsläppligt membran för att närma sig den nominella koncentrationen för proteinkristallisering och möjliggör exakt och reversibel kontroll över kristalliseringsförhållandena24. Den molekylära viktavskärningen (MWCO) i det halvgenomsläppliga dialysmembranet kan väljas beroende på makromolekylens och utfällningsfaktorernas molekylvikt för att möjliggöra diffusion av små utfällningsmolekyler samtidigt som makromolekylen bibehålls av intresse. På grund av dialysprocessens reversibilitet kan den användas i kombination med temperaturreglering för att frikoppla och optimera nukleation och kristalltillväxtoberoende av 37 för att undersöka fasdiagram genom att ändra den utfällande koncentrationen samtidigt som samma proteinprov används. Integrationen av membran i mikrofluidik granskas av de Jong et al.38 och fallstudierna i biologi implantering av dialys i mikrochips kan huvudsakligen listas i provberednings-, koncentrations- eller filtreringsapplikationer39,40,41,42 eller cellrelaterade studier43,44. Pervaporation genom PDMS användes av Shim et al.37 för att studera kärnan och tillväxten av xylanas under olika förhållanden. Vatten genomborrades genom det 15 μm tjocka PDMS-membranet i proteinbehållaren på den mikrofluidiska enheten och ändrade därefter protein- och utfällningskoncentrationen.
Protokollet som utvecklats av Junius et al.19,45 för tillverkning av ett mikrofluidiskt chip kompatibelt för både proteinkristallisering på chip via mikrodialys och in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur presenteras. Protokollet för enhetstillverkningen är direkt inspirerat av det banbrytande arbete som utförs av Studer och medarbetare12,46 för mikromönstrade klistermärken av fotohärdande tiokonenbaserade harts NOA 81 som bäddar in kommersiellt tillgängliga membran med hjälp av mjuk avtryckslitografi. En innovativ modifiering av metoden resulterade i mikrochips som gjorde det möjligt att använda mikrodialys för att noggrant övervaka och kontrollera de experimentella parametrarna för proteinkristallers tillväxt på chip och samtidigt utnyttja fördelarna med mikrofluidik, såsom minskad konsumtion av proteinprover per experiment (<1 μL). I ett tidigare arbete visades principerna för dialys som tillämpas på ett makroskalesystem (typisk volym >20 μL) för screening och optimering av kristalliseringsförhållanden genom kartläggning av temperaturutfällande koncentrationsfasdiagram47. I detta arbete beskrivs ett protokoll för att producera dialysmikrochips som innehåller regenererade cellulosa (RC) dialysmembran av olika MWCO för att utföra kristalliseringsanalyser på chip och in situ X-ray diffraktionsdatainsamling. Materialen som består av mikrochipsen har utvärderats för deras transparens för röntgenstrålar19 och apparaterna kan ställas in direkt framför röntgenstrålen för rumstemperatur i situ diffraktionsexperiment, med undantag för manuell hantering och minimering av nedbrytningen av ömtåliga proteinkristaller. I en fallstudie odlades hen äggvita lysozyme kristaller på chip via mikrodialys som genererar en enhetlig storlek befolkning. Mikrochipet monterades sedan framför röntgenstrålen med ett 3D-printat stöd19 och kompletta in situ diffraktionsdatauppsättningar samlades in vid rumstemperatur från flera isomorfa kristaller, vilket visar chipsens höga potential och relevans för synkrotron seriell kristallografi studier av utmanande makromolekylära mål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Detta protokoll beskriver tillverkningen av reproducerbara och billiga mikrofluidiska anordningar som täcker hela rörledningen för kristallisering av proteiner på chip med dialysmetoden och möjliggör in situ enkristall- eller seriekristallografiexperiment vid rumstemperatur. Protokollet beskriver tillverkningsprocessen för mikrochips, manipulering av kristalliseringsexperimenten på chip och behandlingen av in situ insamlade röntgendiffraktionsdata för strukturell klargörande av proteinprovet. Huvuddragen i detta mikrofabriceringsförfarande ligger på integrationen av ett kommersiellt tillgängligt, halvgenomsläppligt regenererat cellulosadialysmembran mellan två lager av chipet. Molekylviktsavskärningen av det inbäddade membranet varierar beroende på makromolekylens och utfällningsmediernas molekylvikt. Enheten utnyttjar fördelarna med mikrofluidisk teknik, såsom användning av minimala volymer av prover (<1 μL) och finjustering över transportfenomen. Chippet kopplade dem till dialysmetoden, vilket gav exakt och reversibel kontroll över kristalliseringsprocessen och kan användas för att undersöka fasdiagram över proteiner på mikroliterskalan. Enheten är mönstrad med hjälp av ett fotoboterbart tiolenbaserat harts med mjuk avtryckslitografi på ett optiskt transparent polymer substrat. Dessutom utvärderades bakgrundsspridningen av materialen som komponerade mikrochipsen och genererade bakgrundsljud, vilket gjorde chipet kompatibelt för in situ-röntgendiffraktionsexperiment. När proteinkristaller har odlats på chip upp till en tillräcklig storlek och populationsuniformitet kan mikrochipsen monteras direkt framför röntgenstrålen med hjälp av en 3D-utskriven hållare. Detta tillvägagångssätt tar itu med de utmaningar som ökar från användningen av kryoprotekter och manuell skörd i konventionella proteinkristallografiexperiment på ett enkelt och billigt sätt. Kompletta röntgendiffraktionsdatauppsättningar från flera isomorfa lysozymekristaller odlade på chip samlades in vid rumstemperatur för strukturbestämning.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Detta dokument beskriver tillverkningsprotokollet för mikrofluidiska chips som utvecklats för proteinkristallisering på chip med dialysmetoden och in situ-röntgendiffraktionsexperiment. Mikrofabriceringsprocessen gör det möjligt att integrera ett semipermeabelt regenererat cellulosadialysmembran med eventuell molekylviktsavskärning, mellan två lager av chipet.

Kristallisering av proteiner på chip genom mikrodialys för in Situ-röntgendiffraktionsstudier

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Detta dokument beskriver tillverkningsprotokollet för mikrofluidiska chips som utvecklats för proteinkristallisering på chip med dialysmetoden och in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur. En av de främsta fördelarna med dessa mikrochips är valet av tillverkningsmaterial, vilket gör chipsen kompatibla för in situ-röntgendiffraktionsdatainsamling vid rumstemperatur. Kristalliseringsexperimenten på chip kräver små volymer av proteinprovet, vilket minskar den totala kostnaden för att arbeta med dessa värdefulla makromolekyler.Kristallisering på chip eliminerar också den manuella skörden av de ömtåliga proteinkristallerna, som ofta appliceras i kombination med kryokylning under konventionella kristallografiexperiment. Dessutom använder våra mikrochips mikrodialys för proteinkristallisering, vilket är en diffusionsbaserad metod som syftar till att balansera den fällbara koncentrationen genom ett halvgenomsläppligt membran, för att närma sig den cromulenta koncentrationen för proteinkristallisering och möjliggör exakt och reversibel kontroll över kristalliseringsförhållandena. Mikrodialys i kombination med temperaturkontroll kan användas för att frikoppla nukleation från kristalltillväxt för att undersöka fasdiagram, genom att ändra den utfällande koncentrationen samtidigt som samma proteinprov används.Förbered först 50 gram PDMS silikonbas och det härdningsmedel i ett 10 till ett massförhållande. Blanda de två ingredienserna i en bägare med en spatel. Efter blandning, placera blandningen i en vakuumkammare för att ta bort alla luftbubblor.Sätt 25 gram av den förblandade PDMS i den första SU8 som innehåller mönstren för den mikrofluidiska kanalen och pelarna, upp till en höjd av cirka fem millimeter. Häll sedan de återstående 25 gram av PDMS i den andra SU8-mästaren, som bara innehåller pelarnas mönster. Härda de två PDMS-lagren i en ugn vid 338 kelvin i en timme.Skär de härdade PDMS-lagren runt SU8-mästarnas mönster med en skalpell och skala försiktigt av PDMS-formarna från silikonmästarna. Placera PDMS-formen, med både kanalerna och pelarna på en styv mikroskopglasrutschbana med mönstren vända uppåt. Skär en liten bit regenererat cellulosadialysmembran för att täcka den centrala pelaren i PDMS-formen, som är utformad för att vara proteinkammaren.Dialysmembranets molekylvikt väljs därefter till proteinprovets molekylvikt och kristalliseringslösningens utfällningsmedel. Separera sedan försiktigt den torra delen av det regenererade cellulosadialysmembranet. Skär en liten bit av det separerade dialysmembranet.Storleken på detta membran beror på chipets design. Och specifikt beror det på dimensionerna på den centrala pelaren. Deponera dialysmembranets del på PDMS-formens centrala pelare, som stöds på glasrutschbanan, med pelaren och kanalerna vända uppåt.Placera sedan den andra PDMS-formen med endast pelarna vända nedåt, ovanpå PDMS-formen som redan stöds på glasrutschbanan. Justera alla pelare i de två PDMS-formarna. Biten av det regenererade cellulosadialysmembranet är inklämd mellan de två centrala pelarna i PDMS-formar.Detta steg i tillverkningsproceduren kan utföras under ett optiskt mikroskop eller helt enkelt genom att noggrant inspektera justeringen av alla pelare. Placera enheten i en vakuumkammare och desikat i 30 minuter för att ta bort de fångade luftbubblorna i PDMS-formarna och för att förbättra införandet av det fotoboterbara NOA-hartset, som kommer att beskrivas i nästa steg i detta protokoll. Ta bort enheten från vakuumkammaren och fyll det tomma utrymmet mellan de två PDMS-formarna med det fotobottnliga tiolinbaserade hartset NOA 81 med kapillär imbibition.Applicera hartset på tre av enhetens fyra sidor. Placera enheten i en korslänkare och härda NOA-hartset genom att utsätta för UV-ljus i åtta sekunder med hjälp av en kollimerad UV-lampa på 35 milliwatt per kvadratcentimeter. Kapa en 175-tums tjock PMMA-bit i standardmåtten på en mikroskopglasrutschbana och skala av plastskyddet från varje sida av PMMA-biten.När den första UV-exponeringen är klar, ta bort den övre PDMS-formen med ett delvis korslänkat NOA-harts fastnat på den från den nedre PDMS-formen och glasrutschbanan. Tryck försiktigt på monteringen av den övre PDMS-formen och det delvis härdade NOA-hartset på PMMA-biten. Placera den nya enheten i tvärlänkaren och härda NOA-hartset igen genom exponering för UV-ljus i 60 sekunder.Ta försiktigt bort den övre PDMS-formen. Dialyschipet av det helt länkade NOA-hartset som bäddar in ett regenererat cellulosadialysmembran och stöds på ett PMMA-stycke är klart. Bind kommersiellt tillgängliga kontakter på inlopps- och utloppspunkterna på den mikrofluidiska kanalen med snabbt epoxilim.För vätskehanteringen, välj diametern på PTFE-rören baserat på kontakterna. Rören används för införandet av kristalliseringslösningen inom dialyschipmets fluidiska kanal. Pipett manuellt en droppe av proteinprovet inuti proteinbehållaren som ligger precis på dialysmembranet.Volymen av proteindroppar beror på utformningen av mikrochipet som används. Och specifikt beror det på volymen på den centrala pelaren, och det kan vara 0,1 eller 0,3 mikroliter. Applicera försiktigt ett tunt lager av högvakuum silikonfett runt hela proteinbehållaren.Skär en liten bit PMMA och placera den försiktigt ovanför det tunna lagret av silikonfettet. Skär en bit Kapton tejp, tillräckligt stor för att täcka PMMA-biten placerad ovanför proteinbehållaren och för att hålla fast på NOA-chipet runt alla kanter. Proteinprovet är inkapslat i behållaren och chippet kan användas för kristalliseringsexperiment.Förbered först cirka 500 mikroliter av kristalliseringslösningen genom att blanda lämpliga volymer av bufferten och utfällningslösningarna. Injicera kristalliseringslösningen i dialyschipspunkten genom de fluidiska kontakterna, antingen manuellt med sprutan eller med ett automatiserat tryckdrivet system. När den flytande kanalen är fylld med kristalliseringslösningen och ingen luft är instängd inuti, försegla inlopps- och utloppsportarna på chipet med Parafilm-tejp.Pipett lämplig volym av proteinlösningen i proteinbehållaren och kapsla in proteinprovet som redan har beskrivits. Proteinkristalltillväxten kan visualiseras och registreras med en digitalkamera. För tillverkning av dialysmikrochips har vi valt optiskt transparenta och biologiskt inerta material, vilket visar hög kompatibilitet för in situ-röntgendiffraktionsexperiment.Bakgrundsljudet som genereras av materialen som består av chipens proteinområde, som ligger i röntgenstrålens direkta väg, har utvärderats. Proteinområdet består av det regenererade cellulosadialysmembranet, Kaptontejpen och två PMMA-skikt, ett som används som ett substrat för mikrochipsen och ett som används för inkapsling av proteinprovet. I den här bilden illustreras bakgrundsljudet som genereras av Kapton-bandet, det regenererade cellulosadialysmembranet, PMMA-skiktet och deras sammansättning.Även om det fotobottnliga hartset NOA består av mikrochipsens huvudkropp, ingår det inte i dessa mätningar eftersom det inte är en del av proteinkammaren. Diffusa ringar som tillskrivs interaktionerna mellan röntgenstrålar med materialen kan ses för Kapton-tejpen vid upplösningen lägre än fyra angstroms, PMMA mellan fyra till åtta angstroms och dialysmembranet mellan fyra till fem angstroms. Det totala bakgrundsljudet som genereras av chipet observeras främst vid upplösningen lägre än sex angstrom, vilket indikerar att behandlingen av lysozyme högupplösta diffraktionsdata inte påverkas.Mikrochipsen monterades framför röntgenstrålen med ett 3D-printat stöd som vi designade för in situ-röntgendiffraktionsexperiment, och det kan hålla upp till tre chips samtidigt. Experiment utfördes för att utvärdera mikrochipsens effektivitet för kristallisering på chip av modelllösliga proteiner med mikrodialysmetoden. lysozyme kristaller odlades vid 293 kelvin i två olika förhållanden.Det första kristalliseringstillståndet innehöll 1,5 molar natriumklorid och 0,1 molar natriumacetat. Det andra kristalliseringstillståndet innehöll en molar natriumklorid, 0,1 molar natriumacetat och 30%polyetylenglykol 400, och valdes för att visa kompatibiliteten hos mikrochips och mikrodialysmetoden, med fällningsmedel med hög molekylvikt och trögflytande lösningar. Kristalliseringsexperimenten utfördes under statiska förhållanden.När lysozymekristaller odlades på mikrochipet användes de för in situ röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur. Mikrochipsen monterades vid strållinjen med hjälp av 3D-printat stöd och fullständiga röntgendiffraktionsdatauppsättningar samlades in från två lysozymekristaller. Efter behandling av röntgendiffraktionsdata erhölls elektrontäthetskartan för en enda lysozymkristall vid 1,95 angstromupplösning, vilket visas i figur A.Figur B visar elektrontäthetskartan som erhållits vid 1,85 angstroms upplösning.Efter att ha sammanfogat två datauppsättningar som erhållits från två olika lysozymkristaller visar båda elektrotäthetskartorna detaljerad strukturell information som kan erhållas genom in situ-röntgendiffraktionsexperiment som utförs direkt på dialysmikrochips vid rumstemperatur, från enstaka eller flera proteinkristaller. Vi demonstrerade tillverkning förfarandet för mikrofluidic enheter utformade för on-chip protein kristallisering med microdialysis metoden, och in situ röntgen diffraktion experiment vid rumstemperatur. Vi använde tillverkningsmaterial med hög röntgentransparens, kompatibel för in situ protein kristallografi.Diffraktionsdatainsamlingen automatiseras med hjälp av ett 3D-utskrivet stöd för chipsen, som kan monteras direkt i makromolekylära kristallografistrålelinjer. Mångsidigheten hos detta mikrochip härrör från att använda mikrodialys för att reversibelt kontrollera kristalliseringsförhållanden och kartlägga fasdiagram med liten proteinvolym. Prototyperna av enheten är enkla, vilket möjliggör tillverkning av upp till 30 mikrochips på en enda dag i ett rent rum, med relativt billiga material.Vi förväntar oss att dessa funktioner i chipsen kan användas för seriella röntgenkristallografistudier av mer utmanande proteinmål.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Dynamisk elektrokemisk mätning av kloridjoner

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ karakterisering av Hydratiserade proteiner i vatten av Salvi och ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X pulverröntgendiffraktionsmönster i Conservation Science: Mot Rutin Crystal strukturbestämning av korrosionsprodukter på Heritage konstföremål

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantifiera X-Ray fluorescens Data med hjälp av kartor

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Mätningar av långväga elektroniska korrelationer under femtosekund diffraktion experiment utförs på nanokristaller av Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikroflödessystem marker för In Situ Crystal röntgendiffraktion och In Situ dynamiska ljusspridning för seriell Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Väsentliga metall upptag i gramnegativa bakterier: X-ray fluorescens, radioisotoper, och Cell fraktionering

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-känslig detektion av kemi i batterier genom mjuk X-ray Absorption spektroskopi och Resonant oelastisk X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Biologiska prover Förberedelse för speciering vid kryogen temperatur med hjälp av högupplöst röntgenabsorptionsspektroskopi

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...