Name: crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies
Uploaded: 2021-04-11T13:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

MBS, 2014-2015 sınırlarında Enstrümantasyon sözleşmesi kapsamında MI / CNRS'nin desteğini kabul eder. NJ, Doktora Bursu için CEA'nın Uluslararası Doktora Araştırma Programını (Irtelis) kabul eder. MBS ve SJ, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması olan 722687 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı'ndan fon sağladığını kabul ediyor. MBS, SJ ve NJ, mikrofabrikasyon deneyleri için temiz oda kuruluşu için LIPhy'ye (UGA) teşekkür eder. IBS, Grenoble Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü'ne (IRIG, CEA) entegre olduğunu kabul eder.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikrodiyaliz yöntemi ve oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için bir mikroakışkan cihaz geliştirilmiştir. Çip üzerinde protein kristalizasyonu için mikrodiyaliz kullanmak için herhangi bir MWCO'nun RC diyaliz membranlarını entegre eden NOA 81 çipleri imal edilebilir. Nispeten yüksek X-ışını şeffaflığına sahip imalat malzemeleri kullanıldı ve çipler yerinde protein kristalografisi için uyumlu hale getirildi. Cihazın protein kristalleşmesi için bölmeyi oluşturan imalat malzemeleri (PMMA, Kapton, RC diyaliz zarı) düşük arka plan gürültüsü oluşturacak şekilde değerlendirildi. Özellikle, diyaliz çipi tarafından üretilen arka plan gürültüsü esas olarak düşük çözünürlükte (> 6 Å) gözlenir ve protein yapısının belirlenmesi için gerekli olan büyük lysozyme kristallerinin yüksek çözünürlüklü kırınım verilerinin tedavisini etkilemez. Veri toplama otomasyonu, doğrudan makromoleküler kristalografi kiriş hatlarına monte edilebilen ve aynı anda üç mikroçip taşıyabilen 3D baskılı bir destek kullanılarak yükseltilir. Bu şekilde, kırılgan protein kristallerinin manuel olarak toplanması ve manipülasyonu önlenir. Ayrıca, veri toplama oda sıcaklığında gerçekleşir, yerel protein yapısından konformasyon değişiklikleri ile ilgili olabilecek kriyoproteksiyon ihtiyacını önler2,3.
Mikrodiyalizin çip üzerinde kristal yetiştirmek için bir yöntem olarak kullanılması, kristalleşme sürecinin doğru bir şekilde izlenmesini ve kontrol edilmesine olanak tanır. Girişte tartışıldığı gibi, geleneksel protein kristalizasyon yöntemlerinin çoğu mikroakışkan cihazlar kullanılarak uygulanmıştır11,14. Bununla birlikte, diyalizin protein kristalizasyonu için avantajları henüz mikro ölçeklerde tam olarak kullanılmamıştı. Çip üzerinde mikrodiyaliz, faz diyagramlarını inceleme ve aynı protein örneği ile kristalizasyon koşullarının taranmasını ve optimizasyonunu gerçekleştirme imkanı sağlar19. Bu çalışmada sunulan prototipler için çip başına protein tüketimi 0,1 veya 0,3 μL ile sınırlıdır. İmalat protokolü birçok adım içerir, ancak basittir ve nispeten ucuz malzemelerle temiz odada tek bir günde çok sayıda cihazın (20 ila 30 çip) üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, proteinlerin çip üzerinde kristalleşmesi, özellikle mikro ölçeklerde nükleasyonun ve kristal büyümesinin içsel stokastik doğası nedeniyle hassas bir prosedür olabilir. Yerinde X-ışını kırınım veri toplama için uygun sağlam, iyi tanımlanmış kristaller sağlayan lysozyme kristalizasyonu için iyi belirlenmiş koşulların kullanıldığı bir vaka çalışması tanımlanmıştır. Bununla birlikte, kristalizasyon ortamının çok daha karmaşık olduğu, faz diyagramlarının bilinmediği ve iyi çalışan kristalleşme koşullarının henüz iyi belirlenmediği membran proteinleri gibi daha zorlu protein hedeflerinin kullanılmasıyla zorluklar ortaya çıkabilir. Diyaliz çipi, değerli ve sık maliyetli protein örneğini elden çıkarmadan, sadece mikroakışkan kanal içindeki kristalizasyon çözeltisini değiştirerek bu zorlukları aşma ve çip üzerindeki faz diyagramlarını inceleme imkanı sunar.
Mikroakışkan cihazların çok yönlülüğü, kristalizasyon koşullarını geri dönüşümlü olarak kontrol etmek ve düşük protein hacmini kullanarak konsantrasyon ve sıcaklık çeşitli faz diyagramlarını haritalamak için çip üzerinde protein kristalizasyonu için mikrodiyalizden yararlanmaktan kaynaklanmaktadır. Ayrıca, cihaz yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile uyumludur ve cihazların prototipleme ucuz ve hızlıdır. Çözünür ve membran proteinlerinden oluşan çok sayıda izomorf kristal (hazırlık aşamasında) çip üzerinde yetiştirilebilir ve tüm bu özelliklerin senkrotron ve XFEL tesislerinde zorlu protein hedeflerinin seri X-ışını kristalografi çalışmaları için kullanılabilmesi beklenir. Son olarak, çip üzerinde ve yerinde zamanında çözülmüş çalışmalar yapmak, kristalografik topluluğun önemli ilgisini çekebilecek gelecekteki bir olasılıktır. Bu nedenle, diyaliz çipinde kristaller yetiştirerek ve reaktifleri mikroakışkan kanala manuel olarak (şırınga kullanarak) veya otomatik olarak (basınç kontrol sıvı sistemi veya şırınga pompası ile) sokarak, gelecekteki çabalar mikroakışkan çiplerin senkrotron kiriş çizgileri üzerinde zaman çözümlü deneyleri tetiklemek için başarıyla kullanılabileceğini kanıtlamaya odaklanacaktır.

Biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu (3D) yapısının aydınlatıcı olması, X-ışını kristalografisinin temel araştırma tekniği olarak kaldığı yapısal biyolojide durdurulamaz bir takiptir. Proteinler gibi karmaşık makromoleküllerin yapısal ayrıntılarını çözmek için uygulanan, eylem mekanizmalarının anlaşılmasını ve çeşitli biyolojik işlevlere dahil olmalarını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Senkrotronlardaki güçlü X-ışını kaynakları ve X-ışını serbest elektron lazerleri (XFEL'ler), proteinlerin yapısı hakkında atomik çözünürlüğe yakın daha derin bir içgörü için gereken tüm araçları sağlar. Yapısal çalışmalar için X ışınlarının kullanımı ile birlikte gelen avantajlara rağmen, X-ışını radyasyonu ve kristalleşme sürecinin kendisi için içsel sınırlamalar vardır. Yüksek X-ışını akısının neden olduğu radyasyon hasarı ve X-ışını ışınının önündeki protein kristalinin uzun maruz kalma süreleri, kristalografların kriyojenik soğutma kullanarak aşmaları gereken kısıtlayıcı parametrelerdir1. Bununla birlikte, en uygun kriyokooling koşullarını bulmak zahmetli olabilir, çünkü yerel protein yapısından veya eserlerden gelen konformasyon değişikliklerigizlenebilir 2,3. Ayrıca, son çalışmalar oda sıcaklığında kırınım deneyleri yapmanın daha düşük spesifik radyasyon hasarına yol açtığını göstermektedir4. Yapısal biyolojideki bir başka darboğaz, yeterli boyutta5ile iyi dağınık kristallerin eldeılmasıdır. Küçük kristallerin üretilmesi daha kolaydır, özellikle membran proteinleri durumunda, ancak kriyosooling koşullarında bile radyasyon hasarına daha duyarlıdır, çünkü yüksek radyasyon dozu daha büyük protein kristalleri durumuna kıyasla daha küçük bir hacimde yönlendirilmelidir6. Seri kristalografi7,8'in senkrotronlarda ve XFEL'lerde yeni yaklaşımı, radyasyon hasarının kısıtlamalarını atlatabilir ve aynı zamanda veri kümelerini birden fazladan birleştirerek daha küçük kristallerden (200 nm ila 2 μm)7 yararlanabilir, izomorf ve rastgele yönlendirilmiş protein kristalleri ve femtosaniye darbeler, daha kısa maruz kalma süreleri ve mikro odaklı X-ışını ışınları5,7, 9,10gibi ilişkili teknolojik gelişmelerden kazanç.
Mikroakışkan teknoloji, biyolojik makromoleküllerin kristalleşmesi ve yapısal incelemeleri için manifold avantajları sergileyen X-ışını kristalografisi için değerlidir. Mikroakışkan cihazlarda kristalizasyon deneyleri yapmak, küçük miktarlarda protein örneği gerektirir, bu nedenle bu yüksek değerli biyo makromoleküllerin üretim maliyetini kısıtlar ve çok sayıda kristalizasyon koşulunun yüksek verimli taramasını ve optimizasyonunu kolaylaştırır. Ayrıca, mikroakışkan ölçekte ve difüzyon sınırlı taşıma olaylarındaki doğal geniş yüzey alanı-hacim oranı, akışlar ve sıcaklık veya konsantrasyon gradyanları11, 12,13,14üzerinde ince kontrolsağlar,eşit büyüklükte kristaller yetiştirmek ve faz diyagramlarını keşfetmek için uygun mikroakışkan cihazlarınişlenmesini sağlar 15,16,17,18,19. Ayrıca, mikroakışkan araçlar, numune teslimi olan protein kristalografisinde başka bir engeli ele almak için ayırt edici bir potansiyel ve X-ışını kırınım deneyleri için kullanılmadan önce protein kristallerini kullanma ve hasat etme gerekliliğini gösterir. Çip üzerinde ve yerinde X-ışını kristalografisi yöntemi, veri toplamadan önce kristal manipülasyonu ve kristal kalitesinin potansiyel bozulmasını ortadan kaldırır. Yerinde X-ışını protein kristalografisi için uyumlu çok çeşitli mikroakışkan çipler, mikrofabrikasyon malzemelerinin doğasından kaynaklanan ilgili kısıtlamalarla ve X-ışınları14 , 19, 20 ,21 , 22,23ile etkileşimlerinden kaynaklanan birçok araştırma grubu tarafından tasarlanmış, geliştirilmiş ve test edilmiştir. İmalat malzemeleri optik olarak şeffaf, biyolojik olarak hareketsiz olmalı ve X-ışını radyasyonunda yüksek şeffaflık ve veri toplama sırasında optimum sinyal-gürültü oranı göstermelidir.
Geleneksel protein kristalografisinde uygulanan kristalizasyon yöntemlerinin çoğu24,25 de çip kristalizasyonu ve yerinde X-ışını kırınım analizi için mikroakışkan ölçek11,14'te uygulanmıştır. Buhar difüzyonu26,buharlaşma 27, serbest arayüz difüzyonu (FID)28,mikrobatch26ve hatta tohumlama29içeren basit, hibrit veya çok katmanlı mikroakışkan aparatlar çözünür ve membran proteinlerini kristalleştirmek için kullanılmıştır. Kristalizasyon koşullarının yüksek verim taraması ve optimizasyonu, iyi tabanlı32, damlacık bazlı33 veya valfle hareket ettirilen34cihazda30,31 elde edilebilir. Yerinde Pdms (polidimetilsiloxane), COC (siklik olefin kokolimer), PMMA (poli(metil methakrilat))21gibi çeşitli malzemelerden üretilen mikroçiplerde oda sıcaklığında zorlu protein hedeflerinin X-ışını kırınım deneyleriyapılmıştır.22,26,28,29, grafen filmler23, Kapton35, epoksi tutkal6veya NOA (Norland Optik Yapıştırıcı)19 ve malzemelerin X-ışını radyasyona şeffaflığı ve arka plan gürültüsüne katkıları değerlendirilmiştir. Ayrıca, mikroçipler in situ ve seri veri toplama stratejilerini senkrotron kaynakları23, 35,36 ve XFELs7'deX-ışınıproteini kristalografi deneyleri için tek bir araçta bire bir çift olarak tasarlanmıştır.
Oda sıcaklığı yerinde veri toplama çeşitli teslimat yöntemleri ve cihazlarında da uygulanmıştır. Örneğin, Nogly ve ark.54, bir XFEL kaynağı kullanarak seri femtosaniye kristalografi (SFX) ile ışık tahrikli foton pompa bakterihodopsinin (bR) yapısını incelemek için bir lipidik kübik faz (LCP) enjektörü kullandı. bR'nin kristal yapısı 2.3 şçözünürlüğe kadar çözüldü ve bir LCP enjektörünün zaman çözülen seri femtosaniye kristalografi (TR-SFX) ile uyumluluğunu gösterdi. Baxter ve ark.55, çeşitli boyutlarda lazer kesim delikli 100 veya 200 μm kalınlığında polikarbonat plastik ile üretilen yüksek yoğunluklu çok kristalli bir ızgara tasarladı. Cihazı oturma veya asılı bırakma kristalizasyon deneyleri için kullanırken ızgaranın bir tarafına 5 μm kalınlığında ek bir polikarbonat film sabitlenebilir. Kristaller doğrudan cihazın bağlantı noktalarına yüklenebildiğinden veya kristaller vapor difüzyonu veya LCP yöntemiyle cihazda yetiştirilebildiğinden, bu yüksek yoğunluklu ızgara birden fazla şekilde kullanılabilir. Ayrıca, ızgara standart bir manyetik tabanda ayarlanabilir ve kriyojenik veya oda sıcaklığı koşullarında yerinde X-ışını veri toplama için kullanılabilir. Daha yakın zamanda, Feiler ve ark.56, minimum arka plan gürültüsü katkısıyla kriyojenik ve ortam sıcaklığında makromoleküler in situ X-ışını kristalografisi için bir örnek tutucu geliştirdi. Özellikle, tutucu plastik bir destek, şeffaf bir COC folyo ve mikro gözenekli yapılandırılmış poliimid folyodan oluşur. Kristalleşme damlalarını ayarlamak için yaygın olarak kullanılan kapak slaytlarını değiştirmek için tasarlanmıştır, aynı şekilde kristalleşme damlasını açmadan veya kristalleri manuel olarak kullanmadan ligand ıslatma, karmaşık oluşum ve kriyojenik koruma gibi yerinde manipülasyona izin verir. Ayrıca, numune tutucu kristalizasyon plakasından çıkarılabilir ve standart goniometre tabanlı kiriş hatlarında yerinde veri toplanması için manyetik bir tabana yerlenebilir. Ortam sıcaklığı veri toplama için, COC folyo deneyden önce çıkarılır ve sadece 21 μm kalınlığındaki poliimid folyo, bu durumda minimum olan arka plan saçılımlarına katkıda bulunur. Bu örnekler, devam eden araştırmaların ve X-ışını protein kristalografisi için geliştirilen çok yönlü mikroçiplerin çokluğunun sadece küçük bir kısmını oluşturmaktadır.
Bununla birlikte, diyaliz proteini kristalizasyon yöntemi mikroakışkanlar içinde yaygın olarak dahil edilmiştir. Diyaliz, protein kristalizasyonu için nominal konsantrasyona yaklaşmak için çökelti konsantrasyonunun yarı geçirgen bir membran yoluyla dengelenmesine yönelik difüzyon bazlı bir yöntemdir ve kristalizasyon koşulları üzerinde hassas ve geri dönüşümlü kontrol sağlar24. Yarı geçirgen diyaliz zarının Moleküler Ağırlık Kesmesi (MWCO), makromolekülün moleküler ağırlığına ve çökelticilerin, ilgi makromoleküllerini korurken küçük çökelti moleküllerinin difüzyonunu sağlamak için seçilebilir. Diyaliz işleminin tersine çevrilebilirliği nedeniyle, aynı protein örneğini kullanırken çökelti konsantrasyonunu değiştirerek faz diyagramlarını araştırmak için çekirdeklenmeyi ve kristal büyümesini bağımsız olarak37'ye ayırıp optimize etmek için sıcaklık kontrolü ile birlikte kullanılabilir. Membranların mikroakışkanlara entegrasyonu de Jong ve ark.38 tarafından gözden geçirilir ve biyoloji implante diyalizinde örneklem hazırlama, konsantrasyon veya filtrasyon uygulamalarında esas olarak39, 40,41,42 veya hücre ile ilgili çalışmalar43,44olarak sıralanabilir. PDMS yoluyla pervaporasyon, Shim ve ark.37 tarafından çeşitli koşullarda ksilanazın çekirdeklenmesini ve büyümesini incelemek için kullanılmıştır. Su, 15 μm kalınlığındaki PDMS membrandan mikroakışkan cihazın protein rezervuarına nüfuz etti ve daha sonra protein ve çökelti konsantrasyonunu değiştirdi.
Junius ve ark.19,45 tarafından hem mikrodiyaliz yoluyla çip üzerinde protein kristalizasyonu hem de oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri için uyumlu bir mikroakışkan çipin imalatı için geliştirilen protokol sunulmaktadır. Cihaz imalatı protokolü, studer ve iş arkadaşları12,46 tarafından, yumuşak baskı litografisi kullanılarak ticari olarak mevcut membranları gömen foto kürlenebilir tiyol bazlı reçine NOA 81'in mikro desenli çıkartmaları için gerçekleştirilen öncü çalışmalardan doğrudan esinlenilmiştir. Yöntemin yenilikçi bir modifikasyonu, protein kristallerinin çip üzerinde büyümesi için deneysel parametreleri doğru bir şekilde izlemek ve kontrol etmek ve aynı zamanda deney başına protein örneklerinin tüketiminin azalması (<1 μL) gibi mikroakışkanların avantajlarından yararlanmak için mikrodiyaliz kullanımını sağlayan mikroçiplerle sonuçlandı. Daha önceki bir çalışmada, sıcaklık çökeltisi konsantrasyon fazı diyagramlarını haritalayarak kristalizasyon koşullarının taranmesi ve optimize edilmesi için makro ölçekli bir sisteme (tipik hacim >20 μL) uygulanan diyaliz ilkeleri gösterilmiştir47. Bu çalışmada, çip üzerinde kristalizasyon tahlilleri ve yerinde X-ışını kırınımı veri toplamayı gerçekleştirmek için farklı MWCO'nun rejenere selüloz (RC) diyaliz membranlarını içeren diyaliz mikroçipleri üretmek için bir protokol açıklanmıştır. Mikroçipleri oluşturan malzemeler X-ışınları19'a saydamlıkları açısından değerlendirilmiştir ve cihazlar, manuel kullanım ve kırılgan protein kristallerinin bozulmasını en aza indirme hariç, yerinde oda sıcaklığı kırınım deneyleri için doğrudan X-ışını ışınının önüne ayarlanabilir. Bir vaka çalışmasında, tavuk yumurtası-beyaz lysozyme kristalleri, eşit büyüklükte bir popülasyon oluşturan mikrodiyaliz yoluyla çip üzerinde yetiştirildi. Mikroçip daha sonra 3D baskılı destek19 ile X-ışını ışınının önüne monte edildi ve oda sıcaklığında birden fazla izomorf kristalden tam yerinde kırınım veri setleri toplanarak, zorlu makromoleküler hedeflerin senkrotron seri kristalografi çalışmaları için çiplerin yüksek potansiyelini ve alaka düzeyini gösterdi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 in wafer</td>
			<td>Silicon Materials Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Minispin</td>
			<td>Bench-top centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleWin 3.0</td>
			<td>WieWeb software</td>
			<td></td>
			<td>Designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Devcon</td>
			<td></td>
			<td>5 minutes epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidic connectors</td>
			<td>Cluzeau Info Lab</td>
			<td>N-333</td>
			<td>NanoPort kit for 1/16&#34; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg-white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 837 059 001</td>
			<td>Lyophilized protein powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Dow Corning&#160;high-vacuum silicone grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HMDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>Silane, chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Sawatec</td>
			<td>HP-200-Z-HMDS BM</td>
			<td>Hot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton tape</td>
			<td>DuPont</td>
			<td></td>
			<td>Polyimide tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner, UV source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GSWP04700</td>
			<td>0.22 &#956;m pore size filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12164682</td>
			<td>3 x 1 in glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA81</td>
			<td>Norland Products Inc.&#160;</td>
			<td>NOA81</td>
			<td>Photocurable resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td>Oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td>Parafilm M roll size 20&#160;in. &#215; 50&#160;ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 400</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma equipment</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO</td>
			<td>Plasma treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA</td>
			<td>Goodfellow</td>
			<td>137-745-63</td>
			<td>PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure driven system</td>
			<td>Elveflow</td>
			<td>OB1 MK3+</td>
			<td>Pressure/vacuum controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tubing</td>
			<td>Elveflow/Darwin microfluidics</td>
			<td>LVF-KTU-15</td>
			<td>PTFE tubing roll 1/16&#34; OD X 1/32&#34; ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC dialysis membrane</td>
			<td>Spectra/Por</td>
			<td></td>
			<td>Various MWCOs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Carbon steel surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>3D-CAD designing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>SPS</td>
			<td>Spin150</td>
			<td>Wafer spinner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1 mL Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinker</td>
			<td>Uvitec</td>
			<td>CL-508</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ x-ray diffraction studies

Bu protokol, diyaliz yöntemiyle çip üzerindeki proteinleri kristalleştirmek ve oda sıcaklığında yerinde tek kristal veya seri kristalografi deneylerine izin vermek için tüm boru hattını kapsayan tekrarlanabilir ve ucuz mikroakışkan cihazların üretimini açıklar. Protokol, mikroçiplerin imalat sürecini, çip üzerindeki kristalizasyon deneylerinin manipülasyonunu ve protein örneğinin yapısal elucidasyonu için toplanan X-ışını kırınım verilerinin tedavisini detaylandırıyor. Bu mikrofabrikasyon prosedürünün temel özelliği, çipin iki katmanı arasında ticari olarak mevcut, yarı geçirilebilir rejenere selüloz diyaliz membranın entegrasyonunda yatır. Gömülü zarın moleküler ağırlığı makromolekül ve çökeltilerin moleküler ağırlığına bağlı olarak değişir. Cihaz, dakika hacimlerinde numune (<1 μL) kullanımı ve taşıma olaylarına göre ince ayar gibi mikroakışkan teknolojinin avantajlarından yararlanır. Çip onları diyaliz yöntemiyle birleşerek kristalizasyon süreci üzerinde hassas ve geri dönüşümlü kontrol sağladı ve mikroliter ölçeğinde proteinlerin faz diyagramlarını araştırmak için kullanılabilir. Cihaz, optik olarak şeffaf bir polimerik substrat üzerinde yumuşak baskı litografisi ile fotokür edilebilir tiyol bazlı bir reçine kullanılarak desenlenmiştir. Ayrıca, mikroçipleri oluşturan malzemelerin arka plan saçılması ve arka plan gürültüsünün üretilmesi, çipin yerinde X-ışını kırınım deneyleri için uyumlu hale getirilmesi değerlendirildi. Protein kristalleri yeterli boyuta ve popülasyon homojenliğine kadar çip üzerinde yetiştirildikten sonra, mikroçipler doğrudan 3D baskılı bir tutucu yardımıyla X-ışını ışınının önüne monte edilebilir. Bu yaklaşım, geleneksel protein kristalografisi deneylerinde kriyoprotektiflerin kullanımından ve manuel hasattan kaynaklanan zorlukları kolay ve ucuz bir şekilde ele alıyor. Yapı tespiti için oda sıcaklığında çip üzerinde yetiştirilen çoklu, izomorf lysozyme kristallerinden komple X-ışını kırınım veri setleri toplanarak elde edildi.

Watch this Scientific Journal Video about Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies at JoVE.com

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Bu makalede, diyaliz yöntemi ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ayrıntılı olarak açıklenmektedir. Mikrofabrikasyon işlemi, yarı geçirilebilir yenilenmiş selüloz diyaliz membranın, çipin iki katmanı arasında herhangi bir moleküler ağırlık kesme ile entegre olmasını mümkün kılar.

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

Bu makalede, diyaliz yöntemi ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ve oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri açıklanmaktadır. Bu mikroçiplerin ana avantajlarından biri, imalat malzemelerinin seçimidir ve talaşları oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım veri toplama için uyumlu hale getirir. Çip üzerinde kristalizasyon deneyleri, protein örneğinin küçük hacimlerini gerektirir ve bu yüksek değerli makromoleküllerle çalışmanın genel maliyetini azaltır.Çip üzerinde kristalizasyon, geleneksel kristalografi deneyleri sırasında kriyo soğutma ile birlikte sıklıkla uygulanan kırılgan protein kristallerinin manuel olarak toplanmasını da ortadan kaldırır. Ayrıca, mikroçiplerimiz protein kristalizasyonu için cromulent konsantrasyonuna yaklaşmak için yarı geçirgen bir membran yoluyla çökelti konsantrasyonunu dengelemeyi amaçlayan difüzyon bazlı bir yöntem olan protein kristalizasyonu için mikrodiyaliz kullanır ve kristalizasyon koşulları üzerinde hassas ve geri dönüşümlü kontrol sağlar. Sıcaklık kontrolü ile birlikte mikrodiyaliz, aynı protein örneğini kullanırken çökelti konsantrasyonunu değiştirerek faz diyagramlarını araştırmak için çekirdeklenmeyi kristal büyümesinden ayırmak için kullanılabilir.İlk önce 50 gram PDMS silikon tabanı hazırlayın ve 10 ila bir kütle oranında kürleme maddesidir. İki malzemeyi bir beherde bir spatula ile karıştırın. Karıştırdıktan sonra, tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için karışımı bir vakum odasına yerleştirin.Mikroakışkan kanalın ve sütunların desenlerini içeren ilk SU8'e yaklaşık beş milimetre yüksekliğe kadar 25 gram önceden karıştırılmış PDMS koyun. Daha sonra PDMS'nin kalan 25 gramını, sadece sütunların desenlerini içeren ikinci SU8 master'ına dökün. İki PDMS katmanını 338 kelvin'deki bir fırında bir saat boyunca iyileştirin.Su8 ustalarının desenlerinin etrafındaki kürlenmiş PDMS katmanlarını neşterle kesin ve PDMS kalıplarını silikon kalıplarından hafifçe soyun. PDMS kalıbını, hem kanalları hem de sütunları yukarı bakacak şekilde sert bir mikroskop cam kaydırağa yerleştirin. Protein odası olarak tasarlanan PDMS kalıbının merkezi direğini örtmek için küçük bir parça rejenere selüloz diyaliz zarı kesin.Diyaliz zarının moleküler ağırlık kesmesi, protein örneğinin moleküler ağırlığına ve kristalizasyon çözeltisinin çökeltilerine göre seçilir. Daha sonra yenilenmiş selüloz diyaliz zarının kuru parçasını dikkatlice ayırın. Ayrılmış diyaliz zarının küçük bir parçasını kesin.Bu membranın boyutu çipin tasarımına bağlıdır. Ve özellikle, merkezi sütunun boyutlarına bağlıdır. Diyaliz zarının parçasını cam kaydırağın üzerinde desteklenen PDMS kalıbının merkez direğine, direği ve kanalları yukarı bakacak şekilde yatırın.Ardından, yalnızca aşağı bakan sütunları içeren ikinci PDMS kalıbını, cam slaytta zaten desteklenen PDMS kalıbının üzerine yerleştirin. İki PDMS kalıbının tüm sütunlarını hizalayın. Rejenere selüloz diyaliz zarının parçası PDMS kalıplarının iki merkezi sütunu arasına sıkışmıştır.İmalat prosedürünün bu adımı optik bir mikroskop altında veya tüm sütunların hizalamasını dikkatlice inceleyerek gerçekleştirilebilir. Montajı bir vakum odasına yerleştirin ve PDMS kalıplarındaki sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarmak ve bu protokolün bir sonraki adımında açıklanacak fotokür edilebilir NOA reçinesinin yerleştirilmesini geliştirmek için 30 dakika boyunca kurulayın. Montajı vakum odasından çıkarın ve iki PDMS kalıbı arasındaki boş boşluğu kılcal imbibition ile fotosüre edilebilir tiyolin bazlı reçine NOA 81 ile doldurun.Reçineyi montajın dört tarafının üçüne uygulayın. Montajı çapraz bağlayıcıya yerleştirin ve santimetrekare başına 35 miliwatt'lık kolimli bir UV lambası kullanarak sekiz saniye boyunca UV ışığına maruz kalarak NOA reçinesini iyileştirin. Mikroskop cam kaydırağın standart boyutlarında 175 mikrometre kalınlığında bir PMMA parçası kesin ve PMMA parçasının her iki tarafındaki plastik korumayı soyun.İlk UV maruziyeti tamamlandıktan sonra, üst PDMS kalıbını, üzerine kısmen çapraz bağlanmış bir NOA reçinesi takılı olarak alt PDMS kalıbından ve cam kaydıraktan çıkarın. Üst PDMS kalıbının montajını ve PMMA parçasındaki kısmen kürlenmiş NOA reçinesini hafifçe bastırın. Yeni montajı çapraz bağlayıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca UV ışığına maruz kalarak NOA reçinesini tekrar kürlayın.Üst PDMS kalıbını dikkatlice çıkarın. Rejenere edilmiş bir selüloz diyaliz membranı gömen ve bir PMMA parçası üzerinde desteklenen tamamen çapraz bağlantı NOA reçineden yapılmış diyaliz çipi hazırdır. Mikroakışkan kanalın giriş ve çıkış noktalarında piyasada bulunan konektörleri hızlı epoksi tutkalla bağlayın.Sıvı kullanımı için, konektörlerin boyutuna göre PTFE tüplerinin çapını seçin. Tüpler, diyaliz çipinin akışkan kanalı içinde kristalizasyon çözeltisinin tanıtımı için kullanılır. Pipet, diyaliz zarının hemen üzerinde bulunan protein rezervuarının içindeki protein örneğinin bir damlacığı.Protein damlacıklarının hacmi, kullanılan mikroçip tasarımına bağlıdır. Ve özellikle, merkezi sütunun hacmine bağlıdır ve 0.1 veya 0.3 mikrolitre olabilir. Protein rezervuarının etrafına ince bir yüksek vakumlu silikon gres tabakası dikkatlice uygulayın.Küçük bir PMMA parçasını kesin ve silikon yağın ince tabakasının üzerine hafifçe yerleştirin. Protein rezervuarının üzerine yerleştirilen PMMA parçasını kapton bandından bir parça kesin ve tüm kenarlarda NOA çipine yapışın. Protein örneği rezervuar içinde kapsüllenmiştir ve çip kristalizasyon deneyleri için kullanılabilir.öncelikle tamponun uygun hacimlerini ve çökelti çözeltilerini karıştırarak kristalizasyon çözeltisinin yaklaşık 500 mikrolitresini hazırlayın. Diyaliz çipi noktasındaki kristalizasyon solüsyonunu, şırınna ile manuel olarak veya otomatik basınç tahrikli bir sistemle akışkan konektörler aracılığıyla enjekte edin. Akışkan kanal kristalizasyon çözeltisi ile doldurulduktan ve içinde hava sıkışmadığında, çipin giriş ve çıkış bağlantı noktalarını Parafilm bandı ile kapatın.Pipet protein rezervuarı içindeki protein çözeltisinin uygun hacmini ve daha önce açıklandığı gibi protein örneğini kapsüller. Protein kristal büyümesi dijital kamera ile görselleştirilebilir ve kaydedilebilir. Diyaliz mikroçiplerinin imalatı için optik olarak şeffaf ve biyolojik olarak inert malzemeler seçtik ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri için yüksek uyumluluk gösterdik.X-ışını ışınının doğrudan yolunda bulunan çipin protein bölmesini oluşturan malzemelerin oluşturduğu arka plan gürültüsü değerlendirilmiştir. Protein bölmesi, yenilenmiş selüloz diyaliz zarı, Kapton bandı ve biri mikroçiplerin alt tabakası olarak kullanılan ve biri protein örneğinin kapsüllenmesi için kullanılan iki PMMA katmanından oluşur. Bu resimde Kapton bandı, rejenere selüloz diyaliz zarı, PMMA tabakası ve montajları tarafından oluşturulan arka plan gürültüsü gösterilmiştir.Fotokürlenebilir reçine NOA mikroçiplerin ana gövdesini oluştursa da, protein odasının bir parçası olmadığı için bu ölçümlere dahil değildir. X ışınlarının malzemelerle etkileşimlerine atfedilen dağınık halkalar, Kapton bandı için dört angstromdan daha düşük çözünürlükte, PMMA dört ila sekiz angstrom arasında ve diyaliz zarı dört ila beş angstrom arasında görülebilir. Çip tarafından üretilen toplam arka plan gürültüsü esas olarak altı angstromdan daha düşük çözünürlükte gözlenir, bu da lysozyme yüksek çözünürlüklü kırınım verilerinin tedavisinin etkilenmediğini gösterir.Mikroçipler, yerinde X-ışını kırınım deneyleri için tasarladığımız 3D baskılı bir destekle x-ray ışınının önüne monte edildi ve aynı anda üç çipe kadar dayanabiliyor. Model çözünür proteinlerin çip üzerinde kristalizasyonu için mikroçiplerin verimliliğini mikrodiyaliz yöntemi ile değerlendirmek amacıyla deneyler yapıldı. lysozyme kristalleri 293 kelvin'de iki farklı koşulda yetiştirildi.İlk kristalizasyon durumu 1.5 molar sodyum klorür ve 0.1 molar sodyum asetat içeriyordu. İkinci kristalizasyon durumu bir azı dişi sodyum klorür, 0.1 molar sodyum asetat ve% 30 polietilen glikol 400 içeriyordu ve mikroçiplerin ve mikrodiyaliz yönteminin yüksek moleküler ağırlık ve viskoz çözelti çökeltileri ile uyumluluğunu göstermek için seçildi. Kristalizasyon deneyleri statik koşullar altında gerçekleştirildi.Mikroçipte lysozyme kristalleri yetiştirildikten sonra, oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri için kullanıldı. Mikroçipler 3D baskılı destek yardımıyla ışın hattına monte edildi ve iki lysozyme kristalinden eksiksiz X-ışını kırınım veri setleri toplandı. X-ışını kırınım verilerinin tedavisinden sonra, tek bir lysozyme kristalinin elektron yoğunluk haritası 1.95 angstrom çözünürlükte elde edildi, şekil A.Şekil B'de gösterildiği gibi 1.85 angstrom çözünürlüğünde elde edilen elektron yoğunluk haritası.İki farklı lysozyme kristalinden elde edilen iki veri setini birleştirdikten sonra, her iki elektro yoğunluk haritası, oda sıcaklığında doğrudan diyaliz mikroçipleri üzerinde, tek veya çoklu protein kristallerinden yapılan yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile elde edilebilen ayrıntılı yapısal bilgileri göstermektedir. Mikrodiyaliz yöntemi ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için tasarlanmış mikroakışkan cihazlar için imalat prosedürünü ve oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneylerini gösterdik. Yerinde protein kristalografisi için uyumlu, yüksek X-ışını şeffaflığına sahip imalat malzemeleri kullandık.Kırınım veri toplama, yongalar için doğrudan makromoleküler kristalografi kiriş hatlarına monte edilebilen 3D baskılı bir destek kullanılarak otomatikleştirilmiştir. Bu mikroçiplerin çok yönlülüğü, kristalizasyon koşullarını geri dönüşümlü olarak kontrol etmek ve küçük protein hacmini kullanarak faz diyagramlarını haritalamak için mikrodiyaliz kullanmaktan kaynaklanmaktadır. Cihazın prototiplenmesi basittir, bu da nispeten ucuz malzemelerle temiz bir odada tek bir günde 30 mikroçip üretilmesini sağlar.Çiplerin bu özelliklerinin daha zorlu protein hedeflerinin seri X-ışını kristalografi çalışmaları için kullanılabileceğini bekliyoruz.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

Klorür iyonlarının Dinamik Elektrokimyasal Ölçüm

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

SALVI ve TOF-SIMS tarafından Su Sönmüş Proteinlerin In Situ Karakterizasyonu içinde

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Koruma Bilimi X-ışını Toz Kırınım: Miras Sanat Objects Korozyon Ürünleri Rutin Kristal Yapı Tayini Doğru

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

HARİTALAR kullanarak x-ışını Floresans veri miktarının

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

Bukminsterfuleren Nanocrystals üzerinde gerçekleştirilen Femtosecond kırınım deneyler sırasında uzun menzilli elektronik korelasyon ölçümleri

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Ayagin Gram-negatif bakterilerde temel Metal alımı: x-ışını Floresans, Radioisotopes ve hücre ayırma

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Pil ile yumuşak x-ışını soğurma spektroskopisi ve rezonans esnek olmayan x-ışını saçılması kimyada Elemental duyarlı tespiti

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Yüksek Çözünürlüklü X-Işını Absorpsiyon Spektroskopisi Kullanılarak Kriyojenik Sıcaklıkta Türleşme için Biyolojik Numunelerin Hazırlanması

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...