Name: single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons at JoVE.com

Ces travaux ont été appuyés par les National Institutes of Health Grants (R01NS085215 à K.F., T32 GM107000 et F30MH122146 à A.C.). Les auteurs remercient Mme Naoe Watanabe pour son assistance technique habile.

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université du Massachusetts. La préparation de la culture de tranches, la préparation du plasmide et l’électroporation sont également détaillées dans nos méthodes précédemment publiées et peuvent être mentionnées pour plus d’informations10.
1. Préparation de la culture ...

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue.">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).</li><li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture.">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

Nous décrivons ici une méthode d’électroporation qui transfecte les neurones excitateurs et inhibiteurs avec l’efficacité et la précision élevées. Notre protocole d’électroporation optimisé comporte trois percées innovantes pour atteindre une transfection génétique hautement efficace. Notre première modification a été d’augmenter la taille de la pipette par rapport aux protocoles précédemment publiés3,5,6.</s...

En biologie moléculaire, l’une des considérations les plus importantes pour un chercheur est de savoir comment délivrer un gène d’intérêt dans une cellule ou une population de cellules pour élucider sa fonction. Les différentes méthodes d’administration peuvent être classées comme biologiques (p. ex., un vecteur viral), chimiques (p. ex., phosphate de calcium ou lipides) ou physiques (p. ex., électroporation, microinjection ou biolistique)1,2. Les méthodes biologiques sont très efficaces et peuvent être spécifiques au type de cellule, mais sont limitées par le développement d’outils génétiques spécifiques. Les approches chimiques sont très puissantes in vitro, mais les transfections sont généralement aléatoires; de plus, ces approches sont principalement réservées aux cellules primaires seulement. Parmi les approches physiques, la biolistique est la plus simple et la plus facile d’un point de vue technique, mais produit à nouveau des résultats de transfection aléatoires à une efficacité relativement faible. Pour les applications qui nécessitent un transfert dans des cellules spécifiques sans avoir besoin de développer des outils génétiques, nous nous tournons vers l’électroporation unicellulaire3,4.
Alors que l’électroporation ne se référait qu’à l’électroporation sur le terrain, au cours des vingt dernières années, de multiples protocoles d’électroporation unicellulaire in vitro et in vivo ont été développés pour améliorer la spécificité et l’efficacité5,6,7,démontrant que l’électroporation peut être utilisée pour transférer des gènes à des cellules individuelles et peut, par conséquent, être extrêmement précise. Cependant, les procédures sont techniquement exigeantes, longues et relativement inefficaces. En effet, des articles plus récents ont étudié la faisabilité des plates-formes d’électroporation mécanisées8,9, qui peuvent aider à éliminer plusieurs de ces obstacles pour les chercheurs intéressés par l’installation d’une telle robotique. Mais pour ceux qui recherchent des moyens plus simples, les problèmes d’électroporation, à savoir la mort cellulaire, l’échec de la transfection et le colmatage de la pipette, restent préoccupants.
Nous avons récemment développé une méthode d’électroporation qui utilise des pipettes en verre à plus grande pointe, des paramètres d’impulsion électrique plus doux et une étape de cycle de pression unique, qui a généré une efficacité de transfection beaucoup plus élevée dans les neurones excitateurs que les méthodes précédentes, et nous a permis pour la première fois de transfecter des gènes dans des interneurones inhibiteurs inhibiteurs, y compris des interneurones inhibiteurs exprimant la somatostatine dans la région CA1 hippocampique de la culture de tranches organotypiques de souris10. Cependant, la fiabilité de cette méthode d’électroporation dans différents types inhibiteurs d’interneurones et stades de développement neuronaux n’a pas été abordée. Ici, nous avons démontré que cette technique d’électroporation est capable de transfecter des gènes à la fois dans des neurones excitateurs et dans différentes classes d’interneurones. Il est important de savoir que l’efficacité de la transfection était élevée, quels que soient les jours in vitro (DIV) d’âge de culture de tranche testés. Cette technique établie et conviviale est fortement recommandée à tout chercheur intéressé par l’utilisation de l’électroporation unicellulaire pour différents types de cellules dans le contexte du tissu cérébral in vitro de souris.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

L’électroporation s’est établie comme une méthode critique pour transférer des gènes spécifiques dans les cellules afin de comprendre leur fonction. Ici, nous décrivons une technique d’électroporation unicellulaire qui maximise l’efficacité (~ 80%) de la transfection in vitro de gène dans les neurones inhibiteurs excitateurs et classe-spécifiques dans la culture organotypique de tranche hippocampique de souris. Utilisant de grandes électrodes de verre, le fluide céphalo-rachidien artificiel tetrodotoxin-contenant et les impulsions électriques douces, nous avons livré un gène d’intérêt dans les neurones pyramidaux CA1 hippocampiques cultivés et les interneurones inhibiteurs. De plus, l’électroporation pourrait être effectuée dans des tranches hippocampiques cultivées jusqu’à 21 jours in vitro sans réduction de l’efficacité de la transfection, ce qui a permis d’étudier les différents stades de développement de la culture de tranches. Avec un intérêt croissant pour l’examen des fonctions moléculaires des gènes dans une gamme variée de types de cellules, notre méthode démontre une approche fiable et simple de la transfection in vitro des gènes dans le tissu cérébral de la souris qui peut être effectuée avec l’équipement et les techniques d’électrophysiologie existants.

Notre électroporation unicellulaire est capable de délivrer avec précision des gènes dans des neurones excitateurs et inhibiteurs visuellement identifiés. Nous avons électroporé trois types de cellules neuronales différents à trois points de temps différents. La parvalbumine (Pv) ou les neurones exprimant le glutamate vésiculaire de type 3 (VGT3) ont été visualisés en croisant des lignes Pvcre (JAX #008069) ou VGT3cre (JAX #018147) avec tdTomato (une variante de la protéine fluorescen...

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Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Présenté ici est un protocole pour l’électroporation unicellulaire qui peut livrer des gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme d’âges in vitro de culture de tranche hippocampique. Notre approche fournit une expression précise et efficace des gènes dans des cellules individuelles, qui peuvent être utilisées pour examiner les fonctions cellulaires autonomes et intercellulaires.

Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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