Name: single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00
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この研究は、国立衛生補助金研究所(K.F.、T32 GM107000、F30MH122146からA.C.)によって支援されました。著者らは、渡辺直e氏に対し、技術面の技術支援に対し、感謝の気持ちを伝える。

すべての動物の議定書は、マサチューセッツ大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって見直され、承認されました。スライス培養製剤、プラスミド調製、およびエレクトロポレーションも以前に公開された方法で詳述されており、追加情報10について参照することができる。
1. スライス文化の準備
<ol><li>前に説明したようにマウスのorg...

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation.">Single-cell electroporation.</a> Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).</li><li>Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons.">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li><li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques.">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li><li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures.">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li><li>Wiegert, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue.">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).</li><li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture.">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing.">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+on+microchips:+the+harmful+effects+of+pH+changes+and+scaling+down.">Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down.</a> Science Reports. 5, 17817 (2015).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

ここでは、励起性ニューロンと阻害性ニューロンの両方を高効率かつ高精度にトランスフェクトするエレクトロポレーション法について説明する。当社の最適化エレクトロポレーションプロトコルは、高効率遺伝子トランスフェクションを実現するための3つの革新的なブレークスルーを有しています。私たちの最初の変更は、以前に公開されたプロトコル3、5、6<sup...

分子生物学では、研究者にとって最も重要な考慮事項の1つは、その機能を解明するために細胞または細胞の集団に関心のある遺伝子を送達する方法です。異なる送達方法は、生物学的(例えば、ウイルスベクター)、化学的(例えば、リン酸カルシウムまたは脂質)、または物理的(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはバイオリストクス)1、2のいずれかに分類することができる。生物学的方法は高効率で、細胞種に特異的であるが、特定の遺伝的ツールの開発によって制限される。化学アプローチは、インビトロでは非常に強力ですが、トランスフェクションは一般的にランダムです。さらに、これらのアプローチは主にプライマリセル専用です。物理的アプローチの中で、バイオリスティクスは技術的な観点から最も簡単で最も簡単ですが、再び比較的低い効率でランダムトランスフェクション結果を生成します。遺伝的ツールを開発する必要なく特定の細胞への転送を必要とするアプリケーションについては、単一細胞エレクトロポレーション3、4に目を向けます。
エレクトロポレーションはフィールドエレクトロポレーションのみを指していたのに対し、過去20年間に、特異性と効率を向上させるために複数のin vitroおよびin vivo単一細胞エレクトロポレーションプロトコルが開発され、エレクトロポレーションが遺伝子を個々の細胞に移すことができることを実証し、したがって、非常に正確であることが実証されています。しかし、この手順は技術的に要求が厳しく、時間がかかり、比較的非効率的です。実際、最近の論文では、機械化されたエレクトロポレーションリグ8,9の実現可能性を調査しており、このようなロボット工学の設置に興味を持つ研究者にとってこれらの障壁のいくつかを排除するのに役立ちます。しかし、より単純な手段を探している人にとって、エレクトロポレーション、すなわち細胞死、トランスフェクション障害、ピペット詰まりの問題は依然として懸念される。
我々は最近、より大きな先端ガラスピペット、穏やかな電気パルスパラメータ、および以前の方法よりもはるかに高い経道ニューロンのトランスフェクション効率を生成するユニークな圧力サイクリングステップを使用するエレクトロポレーション法を開発し、ソマトスタチン発現阻害性インターニューロンを含む阻害ニューロンインターニューロンの遺伝子を初めてトランスフェクトすることを可能にした。しかしながら、異なる阻害性インターニューロン型および神経細胞発生段階におけるこのエレクトロポレーション法の信頼性は取り上げられていない。ここでは、このエレクトロポレーション技術が、興奮性ニューロンおよび異なるクラスのインターニューロンの両方に遺伝子をトランスフェクトできることを実証した。重要なことに、試験したインビトロ(DIV)スライス培養年齢に関係なく、トランスフェクション効率が高かった。この確立されたユーザーフレンドリーな技術は、インビトロマウス脳組織の文脈で異なる細胞タイプの単細胞エレクトロポレーションを使用することに興味のある研究者に強くお勧めします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

エレクトロポレーションは、特定の遺伝子を細胞に移してその機能を理解するための重要な方法としての確立を確立しました。ここでは、マウスの組織性海馬スライス培養における興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンにおけるインビトロ遺伝子トランスフェクションの効率(約80%)を最大化する単細胞エレクトロポレーション技術について述べている。大きなガラス電極、テトロドトキシン含有人工脳脊髄液および軽度の電気パルスを用いて、培養海馬CA1錐体ニューロンおよび阻害性インターニューロンに関心のある遺伝子を送達した。さらに、エレクトロポレーションは、トランスフェクション効率の低下を伴う21日間までの培養海馬スライスで行うことができ、様々なスライス培養の発達段階の研究を可能にする。多様な細胞型にわたって遺伝子の分子機能を調べることに関心が高まる中、既存の電気生理学装置や技術で行うことができるマウス脳組織におけるインビトロ遺伝子トランスフェクションに対する信頼できる簡単なアプローチを実証しています。

当社の単細胞エレクトロポレーションは、視覚に同定された興奮性および抑制性ニューロンに遺伝子を正確に送達することができる。3つの異なる時間ポイントで3つの異なるニューロン細胞タイプを電気ポポレートしました。パーブアルブミン(Pv)またはベシキュラーグルタミン酸3型(VGT3)発現ニューロンを、それぞれPv/TdTomatoとVGT3/TdTomatoラインと呼ばれるTdTomato(赤蛍光タンパク質の変種)レポ?...

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Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...