Name: single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons at JoVE.com

이 작품은 건강 보조금의 국가 학회에 의해 지원되었다 (R01NS085215 K.F.에, T32 GM107000 및 F30MH122146 A.C.). 저자들은 숙련된 기술 지원을 해주신 와타나베 나오에 씨에게 감사를 표합니다.

모든 동물 프로토콜은 매사추세츠 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 슬라이스 배양 준비, 플라스미드 제제 및 전기화도 이전에 공표된 방법에 상세하며 추가정보(10)를참조할 수 있다.
1. 슬라이스 문화 준비
<ol><li>이전에설명된바와 같이 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양을 준?...

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation.">Single-cell electroporation.</a> Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).</li><li>Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+microporation+technique+for+the+transfection+of+cultured+CNS+neurons.">A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).</li><li>Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+individual+neurons+using+modified+electrophysiology+techniques.">High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).</li><li>Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+small+interfering+RNA+by+single-cell+electroporation+in+cerebellar+cell+cultures.">Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).</li><li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporation+of+Neurons.">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robot+for+high+yield+electrophysiology+and+morphology+of+single+neurons+in+vivo.">A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 15604 (2017).</li><li>Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue.">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).</li><li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture.">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li><li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing.">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+on+microchips:+the+harmful+effects+of+pH+changes+and+scaling+down.">Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down.</a> Science Reports. 5, 17817 (2015).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

우리는 여기에서 높은 효율성과 정밀도로 흥분성 및 억제 뉴런을 모두 횡단하는 전기 포기 법을 설명합니다. 당사의 최적화된 전기기화 프로토콜에는 매우 효율적인 유전자 이식을 달성하기 위한 세 가지 혁신적인 혁신이 있습니다. 우리의 첫 번째 수정은 이전에 게시 된프로토콜에비해 파이펫 크기를 증가하는 것이었습니다3,5,6<...

분자 생물학에서, 조사자에게 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 그것의 기능을 해명하기 위하여 세포의 세포 또는 인구로 관심있는 유전자를 전달하는 방법입니다. 다른 전달 방법은 생물학적(예를 들어, 바이러스 벡터), 화학(예를 들어, 인산칼슘 또는 지질), 또는 물리적(예를 들어, 전기기화, 미세 주입 또는 생물리스트)1,2로분류될 수 있다. 생물학적 방법은 매우 효율적이며 세포 유형에 특이적일 수 있지만 특정 유전 도구의 개발에 의해 제한됩니다. 화학 적 접근은 시험관 내에서 매우 강력하지만, 형질은 일반적으로 무작위입니다; 추가, 이러한 접근은 주로 기본 셀에 대해서만 예약되어 있습니다. 물리적 접근법 중, 생물학은 기술적 관점에서 가장 간단하고 쉬운 방법이지만, 다시 상대적으로 낮은 효율로 무작위 형질 전환 결과를 생성합니다. 유전적 도구 개발 없이 특정 세포로 전이가 필요한 응용 의 경우, 우리는 단세포 전기기3,4를향해 바라본다.
전기포기는 전분 전기기분기만을 참조하는 데 사용되는 반면, 지난 20년 동안 여러 시험관 내 및 생체 내 단일 세포 전기기 프로토콜이 개발되어 특이성과 효율을 향상시키기 위해 개발되어5,6,7,전기포기는 개별 세포로 유전자를 전송하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 매우 정확할 수 있습니다. 그러나 절차는 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 걸리며 상대적으로 비효율적입니다. 실제로, 최근 논문은 기계화 전기 기공 장비의 타당성을조사했다 8,9,이는 이러한 로봇 공학을 설치에 관심이 조사관을위한 이러한 장벽의 몇 가지를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 더 간단한 수단을 찾는 사람들을 위해, 전기 화, 즉 세포 죽음, 경질 실패 및 파이펫 막힘에 대한 문제는 여전히 우려사항입니다.
최근에는 더 큰 기울어진 유리 파이펫을 사용하는 전기 포기 방법을 개발했습니다. 온화한 전기 펄스 파라미터, 그리고 종신뉴런에서 훨씬 더 높은 형질전환 효율을 생성한 독특한 압력 순환 단계는 마우스 의 해마 CA1 영역에서 소마토스타틴 발현 억제 억제인터뉴런을 포함하여 억제성 인터뉴런에서 유전자를 처음으로 횡단할 수 있게하였다. 그러나, 상이한 억제 인터뉴런 유형 및 뉴런 발달 단계에서 이 전기포기 방법의 신뢰성은 해결되지 않았다. 여기서, 우리는 이 전기기 기술이 흥분성 뉴런과 인터뉴런의 다른 종류 둘 다로 유전자를 이식할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 중요한 것은, 시험관내(DIV) 슬라이스 배양 연령에 관계없이 일체내의 전환 효율이 높았다는 것이다. 이 확립 및 사용자 친화적 인 기술은 생체 외 마우스 뇌 조직의 맥락에서 다른 세포 유형에 대한 단일 세포 전기 포레이션을 사용하는 데 관심이있는 모든 조사자에게 매우 권장됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

전기 기화는 그들의 기능을 이해하기 위하여 세포로 특정 유전자를 전송하는 중요한 방법으로 그 자체를 설치했습니다. 여기서, 우리는 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양에서 흥분 및 클래스 별 억제 뉴런에서 체외 유전자 의 효율 (~80%)을 최대화하는 단세포 전기 기법을 설명합니다. 대형 유리 전극, 테트로도톡신 함유 인공 뇌척수액 및 가벼운 전기 펄스를 사용하여 배양 된 해마 CA1 피라미드 뉴런 및 억제 인터뉴런에 관심 유전자를 전달했습니다. 더욱이, 전기기화는 다양한 슬라이스 배양 발달 단계에 대한 연구를 가능하게 하는, 형질 효율의 감소없이 시험관내에서 최대 21일까지 배양 된 해마 슬라이스에서 수행될 수 있었다. 다양한 세포 유형에 걸쳐 유전자의 분자 기능을 검사하는 데 관심이 증가함에 따라, 우리의 방법은 기존의 전기 생리 장비 및 기술로 수행 할 수있는 마우스 뇌 조직에서 체외 유전자 트랜스펙트에 대한 신뢰할 수 있고 간단한 접근 방식을 보여줍니다.

우리의 단세포 전기기는 시각적으로 확인된 흥분성 및 억제 신경으로 유전자를 정확하게 전달할 수 있습니다. 우리는 세 가지 다른 시점에서 세 가지 다른 신경 세포 유형을 전기화. 파브알부민(Pv) 또는 셀란 글루타민3 타입(VGT3)은 각각 Pv/TdTomato 및 VGT3/TdTomato 라인으로 명명된 TdTomato(적색 형광 단백질의 변형) 리포터 라인(Jax #007905)을 통해 Pvcre(JAX #008069) 또는 VGT3cre(JAX #018147) 라인?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons at JoVE.com

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

의 연결을 부상을 검사에 대한 Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 모델

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

연구

신경과학

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...