Name: single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons
Uploaded: 2020-10-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 e F30MH122146 a A.C.). Os autores agradecem à Sra. Naoe Watanabe por assistência técnica hábil.

Todos os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts. A preparação da cultura de fatias, a preparação plasmida e a eletroporação também estão detalhadas em nossos métodos publicados anteriormente e podem ser encaminhadas para informações adicionais10.
1. Preparação para cultura de fatias
<ol><li>Prepare culturas de fatias hipocampai...

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+manipulation+in+brain+tissue.">High-throughput single-cell manipulation in brain tissue.</a> PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).</li><li>Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+method+for+single-cell+electroporation+in+mouse+organotypic+hippocampal+slice+culture.">A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue.">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).</li><li>De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices:+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity.">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).</li></ol>

Descrevemos aqui um método de eletroporação que transfecta neurônios excitatórios e inibitórios com alta eficiência e precisão. Nosso protocolo de eletroporação otimizado tem três avanços inovadores para alcançar transfecção genética altamente eficiente. Nossa primeira modificação foi aumentar o tamanho da pipeta em comparação com os protocolos publicados anteriormente3,5,6. Essa mudança nos permitiu eletrop...

Na biologia molecular, uma das considerações mais importantes para um pesquisador é como entregar um gene de interesse em uma célula ou população de células para elucidar sua função. Os diferentes métodos de parto podem ser categorizados como biológicos (por exemplo, um vetor viral), químicos (por exemplo, fosfato de cálcio ou lipídico) ou físicos (por exemplo, eletroporação, microinjeção ou biolística)1,2. Os métodos biológicos são altamente eficientes e podem ser específicos do tipo celular, mas são limitados pelo desenvolvimento de ferramentas genéticas específicas. Abordagens químicas são muito poderosas in vitro, mas transfecções são geralmente aleatórias; além disso, essas abordagens são principalmente reservadas apenas para células primárias. Das abordagens físicas, a biolística é a mais simples e fácil do ponto de vista técnico, mas novamente produz resultados aleatórios de transfecção com uma eficiência relativamente baixa. Para aplicações que requerem transferência para células específicas sem a necessidade de desenvolver ferramentas genéticas, buscamos eletroporação unicelular3,4.
Considerando que a eletroporação usada para se referir apenas à eletroporação de campo, nos últimos vinte anos, vários protocolos de eletroporação unicelular in vitro e in vivo foram desenvolvidos para melhorar a especificidade e eficiência5,6,7, demonstrando que a eletroporação pode ser usada para transferir genes para células individuais e pode, portanto, ser extremamente precisa. No entanto, os procedimentos são tecnicamente exigentes, demorados e relativamente ineficientes. De fato, trabalhos mais recentes têm investigado a viabilidade das plataformas de eletroporação mecanizadas8,9, que podem ajudar a eliminar várias dessas barreiras para pesquisadores interessados em instalar tal robótica. Mas para aqueles que procuram meios mais simples, os problemas com eletroporação, ou seja, morte celular, falha de transfecção e entupimento de pipetas, permanecem uma preocupação.
Recentemente desenvolvemos um método de eletroporação que usa pipetas de vidro de ponta maior, parâmetros de pulso elétrico mais suaves e uma etapa de ciclismo de pressão única, que gerou uma eficiência de transfeção muito maior em neurônios excitatórios do que os métodos anteriores, e nos permitiu pela primeira vez transfectar genes em interneurônios inibitórios, incluindo interneurônios inibidores expressivos na região hipocampal ca1 da cultura organotipica do rato10. No entanto, a confiabilidade deste método de eletroporação em diferentes tipos inibitórios e estágios de desenvolvimento neuronal não foi abordada. Aqui, demonstramos que essa técnica de eletroporação é capaz de transfetar genes tanto em neurônios excitatórios quanto em diferentes classes de interneurônios. É importante ressaltar que a eficiência da transfecção foi alta independentemente dos dias in vitro (DIV) da idade da cultura da fatia testada. Esta técnica estabelecida e fácil de usar é altamente recomendada para qualquer investigador interessado em usar eletroporação unicelular para diferentes tipos de células no contexto do tecido cerebral in vitro do rato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organotypic slice culture preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Plates</td>
			<td>GREINER BIO-ONE</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCHVU02RE</td>
			<td>Filtration and storage of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>10180</td>
			<td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP03050</td>
			<td>Organotypic slice culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Precision Systems</td>
			<td>OSMETTE II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated spatulas</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-06369-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14958-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td>Filtration and storage of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glasses</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipetter Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td>BD (E2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller Filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FB330B</td>
			<td>Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airtable</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-7512E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Q Imaging</td>
			<td>Retiga-2000DC</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoporator 800A</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Illumination System</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Lumen 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-385</td>
			<td>Manipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Dynamax, RP-2</td>
			<td>Perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shifting Table</td>
			<td>Luigs &#38; Neuman</td>
			<td>240 XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speaker</td>
			<td>Unknown</td>
			<td></td>
			<td>Speakers connected to the electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX61WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence imaging #2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

A eletroporação estabeleceu-se como um método crítico para transferir genes específicos para as células para entender sua função. Aqui, descrevemos uma técnica de eletroporação unicelular que maximiza a eficiência (~80%) da transfesão genética in vitro em neurônios inibitórios excitatórios e específicos de classe na cultura de fatia hipocampal organotipada do camundongo. Usando grandes eletrodos de vidro, fluido cerebrospinal artificial contendo tetrodotoxina e pulsos elétricos leves, entregamos um gene de interesse em neurônios piramimatais de CA1 hipocampal e interneurônios inibitórios. Além disso, a eletroporação poderia ser realizada em fatias hipocampais cultivadas até 21 dias in vitro sem redução na eficiência da transfecção, permitindo o estudo de diferentes estágios de desenvolvimento da cultura de fatias. Com o interesse crescente em examinar as funções moleculares dos genes em uma variedade diversificada de tipos celulares, nosso método demonstra uma abordagem confiável e direta para a transfecção genética in vitro no tecido cerebral do camundongo que pode ser realizada com equipamentos e técnicas de eletrofisiologia existentes.

Nossa eletroporação unicelular é capaz de fornecer genes precisamente em neurônios excitatórios e inibitórios visualmente identificados. Eletroporamos três tipos diferentes de células neuronais em três pontos de tempo diferentes. Linhas de glutamato parvalbumin (Pv) ou glutamato vesicular tipo 3 (VGT3) expressando neurônios foram visualizados cruzando linhas decre Pv (JAX #008069) ou VGT3cre (JAX #018147) com linhas repórter TdTomato (uma variante de proteína fluorescente vermelha) (Jax ...

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Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neurociência

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...