Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

وقد دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الثقافات من المعاهد القومية للصحة، NIDCD، Z01 DC000091 (CJCW).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية / المعهد الوطني للصم وغيرها من اضطرابات الاتصال رعاية الحيوان واستخدام لجنة.
1- الاستعدادات التجريبية
ملاحظة: التفاصيل المتعلقة بإعداد شريحة بما في ذلك تقطيع ?...

الإجراء تشريح وصفها هنا يطلق شريحة إسفين قوية للحفاظ على الدوائر العصبية presynaptic سليمة، ولكن مع إمكانية الوصول إلى تجربة شريحة الدماغ لتحليل وظيفة الخلايا العصبية. يجب توخي الحذر الشديد في عدة خطوات أولية من أجل تعظيم فائدة التحضير لتحليل الدوائر. يجب تأكيد أبعاد الإسفين باستخدام الفحص ال...

يتم تنفيذ مراقبة نشاط الدوائر العصبية بشكل مثالي مع المدخلات الحسية الأصلية والتغذية المرتدة ، والاتصال السليم بين مناطق الدماغ ، في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن إجراء التجارب التي تعطي دقة الخلية الواحدة لوظيفة الدائرة العصبية لا يزال محدودًا بسبب التحديات التقنية في الدماغ السليم. بينما في الجسم الحي خارج الخلية electrophysiology أو طرق التصوير متعددة الصور يمكن استخدامها للتحقيق في النشاط في النظم العصبية سليمة، وتفسير كيفية دمج المدخلات المختلفة أو قياس المدخلات subthreshold متشابك يبقى من الصعب. في تسجيلات الخلية الكاملة في الجسم الحي تتغلب على هذه القيود ولكن تشكل تحديا لأداء، حتى في مناطق الدماغ التي يتم الوصول إليها بسهولة. تتضخم التحديات التقنية لتجارب دقة الخلايا المفردة في بعض مجموعات الخلايا العصبية التي تقع في عمق الدماغ، أو في مجموعات سكانية منتشرة مكانياً تتطلب إما أدوات جينية لتحديد مكان الخلايا في الجسم الحي (على سبيل المثال، التعبير الجيني للقناه البروتوpsين المقترن بتسجيل optrode) أو تحديد الهوية الهستوكيميائية بعد تسجيل العلامات (على سبيل المثال مع علامات خاصة بـ neurotransmission). يجري تقع على نحو منتشر بالقرب من السطح البطني للأدمغة, الخلايا العصبية olivocochlear الوسيط (MOC) تعاني من القيود المذكورة أعلاه1,مما يجعلها من الصعب للغاية للوصول لفي التجارب الحية.
شرائح الدماغ (~ 100-500 μm سمك) منذ فترة طويلة تستخدم لدراسة دوائر الدماغ، بما في ذلك الدوائر الدماغ السمعية، وذلك بسبب الفصل المادي للخلايا العصبية المتصلة التي ترد داخل نفس شريحة2،3،4،5،6،7،8،9. وقد استخدمت التجارب باستخدام شرائح أكثر سمكا بكثير (> 1 ملم) في مختبرات أخرى لفهم كيفية دمج المدخلات الثنائية في مناطق مجمع أوليفاري متفوقة (SOC) بما في ذلك الزيتون متفوقة الوسيط10،11. تم إعداد هذه الشرائح بحيث أن محاور عصبية من العصب السمعي (AN) ظلت سليمة داخل شريحة وحفزت كهربائيا لبدء إطلاق الناقل العصبي متشابك في CN, محاكاة نشاط الخلايا العصبية السمعية من الدرجة الأولى لأنها سوف تستجيب للصوت. عيب رئيسي واحد من هذه الشرائح سميكة هو رؤية الخلايا العصبية للتسجيلات الكهربائية التضيق المشبك ("الترقيع"). يصبح التصحيح صعبة بشكل متزايد كما تصبح محاور عصبية عديدة في هذا المجال النخاعي مع سن12,13,14,15, مما يجعل الأنسجة الخلايا العصبية الكثيفة بصريا وحجب حتى في نموذجي, شريحة الدماغ رقيقة. هدفنا هو خلق في تجهيزات في المختبر التي تشبه بشكل أوثق اتصال الدائرة في تسجيلات الجسم الحي، ولكن مع قدرات عالية الإنتاجية وتسجيل عالية الدقة من البصرية توجيه التصحيح المشبك الكهربائية الفيزيولوجيا في شرائح الدماغ.
مختبرنا يحقق في فسيولوجيا الخلايا العصبية في النظام السمعي الـإفرازي، بما في ذلك الخلايا العصبية MOC. هذه الخلايا العصبية الكولينية تقديم ردود الفعل efferent إلى قوقعة الأذن عن طريق تحوير نشاط خلايا الشعر الخارجي (OHCs)16,17,18,19,20. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا التشكيل يلعب دوراً في السيطرة على القوقعة21،22،23،24،25،26 والحماية من الصدمة الصوتية27،28،29،30،31،32،33. في الفئران، تقع الخلايا العصبية MOC منتشر في النواة البطنية من الجسم شبه المنحرف (VNTB) في الدماغ السمعي1. وقد استخدمت مجموعتنا خط الماوس ChAT-IRES-Cre عبر مع خط الماوس مراسل tdTomato لاستهداف الخلايا العصبية MOC في شرائح جذع الدماغ تحت الإضاءة الظهارة. أظهرنا أن الخلايا العصبية MOC تلقي مدخلات مثبطة afferent من نواة الوسيطة ipsilateral من الجسم شبه المنحرف (MNTB)، وهو متحمس، بدوره، من قبل محاور عصبية من الخلايا شجيرة كروية (GBC) في نواة القوقعة contralateral (CN)34،35،36،38. بالإضافة إلى ذلك, الخلايا العصبية MOC من المرجح تلقي مدخلاتها استثارة من الخلايا التي تى-ممتاز في الـ CN contralateralral39,40,41. معا، وتظهر هذه الدراسات الخلايا العصبية MOC تلقي كل من المدخلات الإثارة والمثبطة المستمدة من نفس الأذن (contralateralral). ومع ذلك، فإن الخلايا العصبية presynaptic، ومحور عصبيتها تتلاقى على الخلايا العصبية MOC، ليست قريبة جدا بما فيه الكفاية لبعضها البعض لتكون سليمة تماما في إعداد شريحة الإكلالية نموذجية. للتحقيق في كيفية دمج المدخلات متشابك لالخلايا العصبية MOC يؤثر على أنماط إطلاق النار المحتملة عملهم، مع التركيز على تثبيط وصفها حديثا، وضعنا إعداد التي يمكن أن تحفز afferents متنوعة إلى الخلايا العصبية MOC من أذن واحدة في الطريقة الأكثر واقعية من الناحية الفسيولوجية ممكن، ولكن مع الفوائد التقنية لتجارب شريحة الدماغ في المختبر.
شريحة إسفين هو إعداد شريحة سميكة معدلة مصممة للتحقيق في التكامل الدائرة في الخلايا العصبية MOC (المخطط في الشكل 1A). على الجانب السميك من الشريحة، يحتوي الإسفين على المحاور الحادة للأعصاب السمعية (التي يطلق عليها "جذر العصب السمعي" فيما بعد) عند دخولها جذع الدماغ من المحيط والمشابك في النفثالين. يمكن تحفيز جذر العصب السمعي كهربائيا لاستحضار الافراج عن الناقل العصبي وتفعيل متشابك من الخلايا من CN سليمة تماما42،43،44،45،46. هذا الشكل التحفيز له العديد من الفوائد لتحليل الدائرة. أولا، بدلا من تحفيز مباشرة من المحاور T-ممتاز و GBC التي توفر مدخلات من الداخل إلى الخلايا العصبية MOC، ونحن نحفز AN للسماح لتنشيط الدوائر الجوهرية وفيرة في CN. هذه الدوائر تعدل انتاج الخلايا العصبية CN لأهدافها في جميع أنحاء الدماغ، بما في ذلك الخلايا العصبية MOC46،47،48،49،50،51. ثانيا، التنشيط polysynaptic من الدوائر afferent من AN من خلال المنبع CN من الخلايا العصبية MOC يسمح لتوقيت التنشيط أكثر طبيعية ولدونة أن يحدث في هذه نقاط الاشتباك العصبي كما يفعلون في الجسم الحي خلال التحفيز السمعي. ثالثاً، يمكننا أن نختلف أنماط التحفيز لدينا لمحاكاة نشاط AN. وأخيرا، كل من الإسقاطات الإثارة والمثبطة إلى الخلايا العصبية MOC سليمة في شريحة إسفين، ويمكن قياس تكاملها في الخلايا العصبية MOC مع دقة الفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك. ككل، يوفر هذا المخطط التنشيط دائرة أكثر سلامة إلى الخلايا العصبية MOC مقارنة بإعداد شريحة الدماغ نموذجية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الشريحة إسفين جذع الدماغ للتحقيق في المناطق السمعية الأخرى التي تتلقى مدخلات المثبطة من IPSilateral MNTB بما في ذلك الزيتون الجانبي متفوقة، نواة أوليفاري متفوقة والزيتون متفوقة وسيطة10،11،52،53،54،55،56. أبعد من إعدادنا محددة، يمكن استخدام هذه الطريقة تشريح أو تعديل لتقييم أنظمة أخرى مع فوائد الحفاظ على الاتصال من المدخلات طويلة المدى وتحسين التصور من الخلايا العصبية لمجموعة متنوعة من الخلايا وحيدة الدقة الكهربائية أو تقنيات التصوير.
يتطلب هذا البروتوكول استخدام مرحلة هزاز أو منصة يمكن إمالة حوالي 15 درجة. هنا نستخدم مرحلة مغناطيسية متاحة تجاريا 2 قطعة حيث "المرحلة" هو قرص معدني مع أسفل منحني وضعت في "قاعدة مرحلة المرحلة" مقعرة المغناطيسي. يمكن بعد ذلك أن يتم نقل المرحلة لضبط زاوية الشريحة. وتستخدم الدوائر متحدة المركز على قاعدة المرحلة لتقدير زاوية reproducibly. يتم وضع مرحلة وقاعدة المرحلة في غرفة تشريح، حيث يمكن أيضا قاعدة المرحلة المغناطيسية يمكن أن تكون استدارة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

في في المختبر شريحة تقنيات الفيزيولوجيا الكهربائية قياس نشاط خلية واحدة مع دقة دقيقة الكهربائية والزمانية. يجب أن تكون شرائح الدماغ رقيقة نسبيًا لتصور الخلايا العصبية والوصول إليها بشكل صحيح لقط اللصق أو التصوير ، ويقتصر الفحص المختبري للدوائر الدماغية على ما هو موجود فعليًا في الشريحة الحادة فقط. للحفاظ على فوائد التجريب شريحة في المختبر مع الحفاظ على جزء أكبر من النوى presynaptic، وضعنا إعداد شريحة جديدة. تم تصميم هذه "شريحة إسفين" لتسجيلات الفيزيولوجيا الكهربائية المشبك لتميز المدخلات المتنوعة التي تعتمد على الصوت إلى الخلايا العصبية أحادية الأمعاء (MOC) في جذع الدماغ. هذه الخلايا العصبية تلقي المدخلات الأولية afferent استثارة ومثبطة من الخلايا العصبية تنشيطها من قبل المحفزات في الأذن contralateralral ونواة القوقعة المقابلة (CN). تم تصميم شريحة الدماغ غير المتماثلة التي هي الأكثر سمكا في المجال الدوكوال روسترو على الحافة الجانبيه لنصف الكرة واحد ثم رقيقة نحو الحافة الجانبيه من نصف الكرة الأرضية المقابل. هذه الشريحة تحتوي, على الجانب السميك, جذر العصب السمعي نقل المعلومات حول المحفزات السمعية إلى الدماغ, الدوائر CN الجوهرية, وعلى حد سواء مثير disynaptic وtrisynaptic مسارات المثبطة التي تتلاقى على الخلايا العصبية موك contralateral. يتم إجراء التسجيل من الخلايا العصبية MOC على الجانب رقيقة من شريحة, حيث يتم تصورها باستخدام البصريات DIC للتجارب التصحيح المشبك نموذجي. يتم تنفيذ التحفيز المباشر للأعصاب السمعية عند دخولها إلى جذع الدماغ السمعي ، مما يسمح لنشاط الدائرة CN الجوهرية واللدونية متشابك أن يحدث في نقاط الاشتباك العصبي من الخلايا العصبية MOC. مع هذه التقنية، يمكن للمرء أن يحاكي في تنشيط الدائرة الكهربائية في الجسم الحي بأكبر قدر ممكن من القرب داخل شريحة. هذا إعداد شريحة إسفين ينطبق على دوائر الدماغ الأخرى حيث تحاليل الدوائر سوف تستفيد من الحفاظ على الاتصال المنبع والمدخلات طويلة المدى، في تركيبة مع المزايا التقنية من فيزيولوجيا شريحة في المختبر.

فحص النسيج لشريحة إسفين لتحقيقنا في وظيفة الخلايا العصبية الدماغ السمعية، تم تصميم إعداد شريحة إسفين لاحتواء جذر العصب السمعي والنيني contralateral إلى الخلايا العصبية MOC المستهدفة للتسجيلات (شريحة المثال هو مبين في الشكل 1B). الفحص النسيجي الأولي للتحضير مهم للتأكد م...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

يتم قياس تكامل المدخلات المتشابكة المتنوعة إلى الخلايا العصبية على أفضل نحو في إعداد يحافظ على جميع النوى قبل متشابك التوقيت الطبيعي ولدونة الدائرة، ولكن شرائح الدماغ عادة قطع العديد من الاتصالات. قمنا بتطوير شريحة الدماغ المعدلة لمحاكاة في نشاط الدائرة الجسمية مع الحفاظ على القدرة على التجريب في المختبر.

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

تجارب شريحة الدماغ تسمح بالاستجواب من وظيفة الخلايا العصبية مع ارتفاع القرار الكهربائية والزمانية، ولكن هذه الشرائح عادة قطع العديد من الاتصالات presynaptic. تحافظ شريحة على شكل إسفين على دوائر بريسينابتيك أكثر سليمة. هذه شريحة الدماغ المعدلة يحافظ على أكثر اكتمالا في دائرة الخلايا العصبية مثل الجسم الحي مع توفير فوائد التجريب في المختبر, مثل تسجيلات المشبك التصحيح الموجهة بصريا, علم الصيدلة, وتصوير النشاط.يمكن تقدير دقة هندسة إسفين شرائح على أساس مواقع أطلس الخلايا العصبية داخل الدائرة ، ولكن يجب تحديد سلامة المخططات و المحاور الأولية باستخدام الأنسجة. ابدأ باستخدام شفرة حلاقة لقطع الجلد عند خط منتصف الجمجمة من الأنف إلى الجزء الخلفي من الرقبة. قشر مرة أخرى الجلد لفضح الجمجمة والبدء من قاعدة الجمجمة والاستمرار في اتجاه الأنف، واستخدام مقص صغير لجعل شق في الجمجمة من خلال خط الوسط.في خياطة لامدا، جعل التخفيضات في الجمجمة من خط الوسط في الجانب نحو الأذن على كلا الجانبين لقشر الجمجمة مرة أخرى لفضح الدماغ. بدءا من نهاية الرسترال، واستخدام ملعقة مختبر صغير لرفع بلطف الدماغ من الجمجمة للسماح للأعصاب البصرية أن تكون مقطوعة. الاستمرار في العمل بلطف الدماغ إلى الوراء، وفضح السطح البطني واستخدام ملقط غرامة لقرصة بعناية الأعصاب ثلاثية التوائم بالقرب من السطح البطني من جذع الدماغ لقطعها.وضع إعداد في طبق بيتري الزجاج مليئة حل تقطيع الباردة ووضع الطبق تحت مجهر تشريح. تقليم أعصاب الوجه على مقربة من جذع الدماغ لفضح الأعصاب التشنجية. استخدام ملقط غرامة لدفع النصائح في foramina حيث يخرج العصب الستريموزيج الجمجمة قدر الإمكان.قرصة لقطع الأعصاب على كلا الجانبين، وترك جذر العصب تعلق على جذع الدماغ. إزالة السحايات والأوعية الدموية من السطح البطني للدم المدبر بالقرب من الجسم شبه المنحرف. ثم قرصة الأعصاب القحفية المتبقية والأنسجة الضامة لتحرير الدماغ تماما من الجمجمة، مع الحرص على الحفاظ على الحبل الشوكي المتبقي، إذا كان ذلك ممكنا.لإعداد سطح الدماغ لاعبا اساسيا للمرحلة مكان الجانب الدماغ البطني حتى واستخدام أداة حادة لشل بلطف الحبل الشوكي لتحقيق الاستقرار في أنسجة الدماغ. إدراج ملقط مفتوحة في زاوية 20 درجة تقريبا من خلال الدماغ إلى الجزء السفلي من الطبق بحيث نصائح الخروج من سطح الظهر من الcaudal الدماغ إلى شيازم البصرية واستخدام شفرة حلاقة لقطع على طول ملقط. المقبل، وإعداد كتلة سنتيمتر مكعب واحد من 4٪ أجار ونشر قطرة صغيرة من الغراء في مستطيل على خشبة المسرح.استخدام ملقط لرفع بعناية الدماغ وداب بلطف السائل الزائد مع حافة منشفة ورقية. ثم ضع السطح المحجوب على الغراء بحيث يكون السطح البطني يواجه اتجاه النصل أثناء التقطيع ودفع كتلة agar بلطف ضد سطح الظهر كدعم. للحصول على شرائح إسفين مع جذر العصب القوقعة على الجانب السميك والخلايا العصبية olivocochlear الوسيطة ونواة الوسط من الجسم شبه المنحرف على الجانب رقيقة، ووضع القرص المغناطيسي مع الدماغ المرفقة على حامل المرحلة ووضع حامل في غرفة تشريح من هزاز مع السطح البطني للدماغ الموجهة نحو النصل.ملء الغرفة مع الجليد الباردة تقطيع الحل وخفض شفرة في حل فقاعة كاربوجين. قطع شرائح caudal إلى المنطقة ذات الأهمية للتأكد من أن الشرائح متناظرة. ثم تحول المرحلة ما يقرب من 15 درجة إلى جانب واحد.استمر في التقطيع بعناية حتى يكون جذر العصب السمعي قريبًا من السطح على جانب واحد ويمكن رؤية عصب الوجه على سطح الجانب الآخر من الشريحة. تحويل المرحلة 15 درجة إلى الوضع الأصلي ونقل النصل بعيدا عن الأنسجة. تدور قاعدة المرحلة 90 درجة بحيث الحافة الجانبية للجانب رقيقة تواجه شفرة وخفض شفرة عدة مئات من ميكرون قبل جلب ببطء شفرة قريبة من حافة الأنسجة.مع شفرة تراجع قليلا انخفاض شفرة إلى سمك المطلوب من حافة رقيقة من شريحة. نقل شفرة مرة أخرى من الأنسجة وتدور قاعدة المرحلة مرة أخرى بحيث يواجه السطح البطني قاعدة المرحلة. جعل قطع لتعيين السطح الرسترالي لشريحة إسفين ونقل شريحة إلى قطعة سنتيمتر مربع واحد من سطح caudle ورقة واجهة أسفل.يجب أن يكون العصب الوجهي مرئيًا على كلا نصفي الكرة الأرضية من الشريحة على السطح التاجي. ثم حرك الشريحة إلى غرفة حضانة 35 درجة مئوية للتعافي لمدة 30 دقيقة. لإعداد شريحة إسفين لتحليل الفيزيولوجيا الكهربائية ضع العينة في غرفة تسجيل يتم غرسها باستمرار مع ACSF 35 درجة مئوية وتثبيت الشريحة.باستخدام البصريات DIC، والتركيز على جذر العصب السمعي على الجانب السميك من شريحة واستخدام micromanipulator لتحريك القطب القطبين التنغستن تحفيز إلى جذر العصب السمعي وبلطف في سطح الأنسجة. نقل مجال الرؤية إلى نواة البطن من الجسم شبه المنحرف على الجانب رقيقة واختيار الخلايا العصبية olivocochlear المتوسطة كهدف للتجميل المشبك electrophysiology تحت epifluorescence باستخدام مرشح انبعاث نانومتر 561. ملء ماصة تسجيل مع الحل الداخلي المناسب للتجربة المقترحة وتحت التصحيح البصريات DIC وسجل من الخلايا العصبية olivocochlear المتوسطة في تكوين الخلية بأكملها.ضبط سعة التحفيز الكهربائي من جذر العصب السمعي للحصول على أحداث ما بعد الطمث متسقة في الخلايا العصبية olivocochlear الوسط. ثم تشغيل بروتوكولات التحفيز المناسبة لمراقبة التيارات متشابك أثار في الخلايا العصبية olivocochlear الوسط. تم تصميم هذا إعداد شريحة إسفين لاحتواء جذر العصب السمعي ونواة قوقعة contralateralral إلى الخلايا العصبية olivocochlear الوسط المستهدف للتسجيلات.في هذا الكرسيل البنفسجي الملون شريحة إسفين ية 1100 نواة القوقعة موجودة في ما يقرب من كامل نطاق السدية. ويلاحظ جذر العصب السمعي دخول نواة القوقعة. بالإضافة إلى ذلك، شريحة إسفين يحتوي على الخلايا العصبية من نواة وسيطة من ipsilateral الجسم شبه المنحرف إلى الخلايا العصبية olivocochlear الوسيط الذي يتم تنفيذ التسجيلات.لتأكيد الاتصال العصبي داخل شريحة إسفين المدخلات presynaptic يتم تحفيز بطريقتين. أولاً، يتم تحفيز stria الصوتية البطنية في خط الوسط كهربائيًا، مما ينشط المحاور T-ممتاز مباشرة والنواة المتوسطة للخلايا العصبية في الجسم شبه المنحرف عبر تحفيز محور عصبي الخلايا البطيخية الناتجة عن التيارات التي يتم قياسها في الخلايا العصبية الوسيطة olivocochlear. ثم يتم تحفيز جذر العصب السمعي لتنشيط الدوائر كامل جذع الدماغ الصاعد مونوريوم واستحضار الاستجابات بعد البينات.المقارنة بين مقاييس الكمون بداية من تيار ما بعد التشنج الأول التي أثارت مع التحفيز المباشر للstria الصوتية البطنية مع تلك التي أثارت مع تحفيز العصب السمعي يكشف عن زمن أطول بكثير في الحدث تحفيز العصب السمعي، مما يدل على التأخير متشابك الناتجة عن نقاط الاشتباك العصبي نواة قوقعة إضافية تنشيط أثناء تحفيز العصب السمعي. استخدام المعالم التشريحية والمناورة الدقيقة من مرحلة القرص المغناطيسي حاسمة لخلق شرائح إسفين مع الدوائر العصبية سليمة وموثوق بها أثار ردود الاشتباك العصبي. هذه تقنية تشريح يوفر منصة لاستخدام إضافية في علم الفيزيولوجيا الكهربائية في المختبر بما في ذلك الكالسيوم أو الجهد التصوير، optogenetics، غير اللافتة العصبية، وكلاهما الصيدلية داخل الخلايا وخارج الخلية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

وعضوي النمط الثقافة شريحة الحصين النموذجي لفحص الإصابات متعلق بالخلايا العصبية

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...