Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af National Institute of Neurological Disorders and Stroke /National Institute on Døvhed og andre kommunikationsforstyrrelser Animal Care and Use Committee.
1. Forsøgspræparater
BEMÆRK: Nærmere oplysninger om skiveforberedelse, herunder udskæringsopløsning, udskæringstemperatur, skiveinkubationstemperatur og apparater (osv.), er specifikke for det præparat for hjernestammer, der udføres i dette eksperiment. Slice...

Udskæringsproceduren beskrevet her kaldes en kile skive er kraftfuld til at opretholde intakt præsynaptiske neuronal kredsløb, men med tilgængeligheden af hjernen skive eksperimenter til analyse af neuronal funktion. Der skal være stor omhu i flere indledende skridt for at maksimere nytten af forberedelsen til kredsløbsanalyse. Kilens dimensioner skal bekræftes ved hjælp af histologisk undersøgelse, som er integreret for bekræftelse af, at både præsynaptiske kerner og deres aksonale projektioner er indeholdt ...

Observation af aktiviteten af neurale kredsløb er ideelt udført med indfødte sensoriske indgange og feedback, og intakt forbindelse mellem hjernen regioner, in vivo. Men, udfører eksperimenter, der giver encellet opløsning af neurale kredsløb funktion er stadig begrænset af tekniske udfordringer i den intakte hjerne. Mens in vivo ekstracellulære elektrofysiologi eller multiphoton billeddannelse metoder kan bruges til at undersøge aktivitet i intakte nervesystemer, fortolke, hvordan forskellige indgange integrere eller måle subthreshold synaptiske indgange er fortsat vanskeligt. In vivo helcelleoptagelser overvinder disse begrænsninger, men er udfordrende at udføre, selv i hjerneregioner, der er let tilgængelige. Tekniske udfordringer i forbindelse med enkeltcelleopløsningsforsøg forstærkes yderligere i visse neuronpopulationer, der er placeret dybt inde i hjernen, eller i rumligt diffuse populationer, der kræver enten genetiske værktøjer til at lokalisere celler in vivo (f.eks. genetisk ekspression af channelrhodopsin parret med optrodeoptagelse) eller post-hoc histoktisk identifikation efter registrering af mærkning af celler (f.eks. med neurotransmissionsspecifikke markører). At være placeret diffust nær den ventrale overflade af hjernestammen, mediale olivocochlear (MOC) neuroner lider af ovenståendebegrænsninger 1,hvilket gør dem yderst vanskelige at få adgang til in vivo eksperimenter.
Hjerne skiver (~ 100-500 μm tykkelse) har længe været brugt til at studere hjernen kredsløb, herunder auditive hjernestamme kredsløb, på grund af den fysiske adskillelse af tilsluttede neuroner, der er indeholdt i samme skive2,3,4,5,6,7,8,9. Der er i andre laboratorier anvendt forsøg med meget tykkere skiver (>1 mm) for atforstå,hvordan bilaterale input integreres i områder af det overlegne olivary-kompleks (SOC), herunder den mediale overlegneoliven 10,11. Disse skiver blev udarbejdet således, at axoner af hørenerven (AN) forblev intakt i skiven og blev elektrisk stimuleret til at indlede synaptisk neurotransmitter frigivelse i CN, efterligne aktivitet første orden auditive neuroner, som de ville reagere på lyd. En væsentlig ulempe ved disse tykke skiver er synligheden af neuroner til patch-clamp elektrofysiologiske optagelser ("patching"). Patching bliver stadig vanskeligere som de mange axoner i dette område bliver myelinated medalderen 12,13,14,15, hvilket gør vævet optisk tæt og tilsløre neuroner selv i en typisk, tynd hjerne skive. Vores mål er at skabe in vitro præparater, der mere ligner kredsløbet tilslutning smuligheder in vivo optagelser, men med den høje kapacitet og høj opløsning optagelse evner visuelt guidet patch-clamp elektrofysiologi i hjernen skiver.
Vores laboratorium undersøger fysiologien af neuroner i det auditive efferent-system, herunder MOC-neuroner. Disse kolinerge neuroner giver efferent feedback til cochlea ved at modulere aktiviteten af ydre hårceller (OHCs)16,17,18,19,20. Tidligere undersøgelser harvist,at denne graduering spiller en rolle i at opnå kontrol i cochlea21,22,23,24,25,26 ogbeskyttelse mod akustisktraume27,28,29,30,31,32,33. I mus, MOC neuroner er diffust placeret i ventrale kernen i trapez kroppen (VNTB) i auditivehjernestammen 1. Vores gruppe har udnyttet ChAT-IRES-Cre muselinjen krydset med tdTomato reporter muselinjen til at målrette MOC neuroner i hjernestamme skiver under epifluorescerende belysning. Vi viste, at MOC neuroner modtager afferent hæmmende input fra ipsilateral mediale kerne af trapez kroppen (MNTB), som er ophidset, igen, af axoner fra kugleformede buskede celler (GBC) i den kontralaterale cochlear kerne (CN)34,35,36,37,38. Derudover, MOC neuroner sandsynligvis modtage deres excitatoriske input fra T-stellate celler i den kontralaterale CN39,40,41. Tilsammen viser disse undersøgelser, at MOC-neuroner får både excitatoriske og hæmmende input fra det samme (kontralaterale) øre. Men, de præsynaptiske neuroner, og deres axoner konvergerende på MOC neuroner, er ikke helt tæt nok til hinanden til at være helt intakt i en typisk koronal skive forberedelse. For at undersøge, hvordan integration af synaptiske input til MOC neuroner påvirker deres indsats potentielle fyring mønstre, med fokus på nyligt beskrevne hæmning, vi udviklet et præparat, hvor vi kunne stimulere de forskellige afferenter til MOC neuroner fra det ene øre i den mest fysiologisk realistiske måde muligt, men med de tekniske fordele ved in vitro hjerne skive eksperimenter.
Kilen skive er en modificeret tyk skive forberedelse designet til undersøgelse af kredsløb integration i MOC neuroner (schematized i figur 1A). På den tykke side af skiven indeholder kilen de afhuggede axoner af hørenerven (benævnt "auditiv nerverod" herefter), da de kommer ind i hjernestammen fra periferien og synapser i CN. Den auditive nerverod kan stimuleres elektrisk til at fremkalde neurotransmitter frigivelse og synaptisk aktivering af celler i den fuldt intakte KN42,43,44,45,46. Dette stimuleringsformat har flere fordele for kredsløbsanalyse. For det første, i stedet for direkte at stimulere T-stellate og GBC axoner, der giver afferent input til MOC neuroner, vi stimulerer AN at tillade aktivering af iboende kredsløb rigelige i CN. Disse kredsløb modulere produktionen af CN neuroner til deres mål i hele hjernen, herunder MOC neuroner46,47,48,49,50,51. For det andet giver den polysynaptiske aktivering af afferentkredsløb fra AN gennem CN opstrøms for MOC-neuroner mulighed for mere naturlig aktiveringstidspunktet og for plasticitet ved disse synapser, som de ville in vivo under auditiv stimulation. For det tredje kan vi variere vores stimulationsmønstre for at efterligne EN aktivitet. Endelig er både excitatoriske og hæmmende monaural projektioner til MOC neuroner intakt i kilen skive, og deres integration kan måles ved en MOC neuron med præcisionen af patch-clamp elektrofysiologi. Som helhed, denne aktivering ordning giver en mere intakt kredsløb til MOC neuroner i forhold til en typisk hjerne skive forberedelse. Denne hjernestamme kile skive kan også bruges til at undersøge andre auditiveområder,der modtager hæmmende input fra ipsilateral MNTB herunder lateral overlegen oliven, overlegen olivary kerne og mediale overlegne oliven10,11,52,53,54,55,56. Ud over vores specifikke præparat kan denne udskæringsmetode bruges eller ændres til at evaluere andre systemer med fordelene ved at opretholde tilslutning af langtrækkende indgange og forbedre visualiseringen af neuroner til en række elektrofysiologi eller billeddannelsesteknikker med en enkelt celleopløsning.
Denne protokol kræver brug af en vibratome fase eller platform, som kan vippes ca 15°. Her bruger vi en kommercielt tilgængelig 2-delt magnetisk fase, hvor "scenen" er en metalskive med en buet bund placeret i en konkav magnetisk "scenebase." Scenen kan derefter flyttes for at justere udsnitsvinklen. Koncentriske cirkler på scenebasen bruges til at estimere vinklen reproducerbart. Scene- og scenebasen er placeret i udskæringskammeret, hvor den magnetiske scenebase også kan drejes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

In vitro skive elektrofysiologi teknikker måle encellet aktivitet med præcis elektrisk og tidsmæssig opløsning. Hjerne skiver skal være relativt tynde til korrekt visualisere og få adgang til neuroner til patch-fastspænding eller billeddannelse, og in vitro undersøgelse af hjernen kredsløb er begrænset til kun, hvad der er fysisk til stede i den akutte skive. For at opretholde fordelene ved in vitro skive eksperimenter og samtidig bevare en større del af præsynaptiske kerner, udviklede vi en ny skive forberedelse. Denne "kile skive" var designet til patch-clamp elektrofysiologi optagelser til at karakterisere de forskellige monaural, lyd-drevne input til mediale olivocochlear (MOC) neuroner i hjernestammen. Disse neuroner får deres primære afferente excitatoriske og hæmmende input fra neuroner aktiveret af stimuli i det kontralaterale øre og tilsvarende cochlear kerne (CN). En asymmetrisk hjerne skive blev designet, som er tykkest i rostro-caudal domæne på sidekanten af en halvkugle og derefter tynder mod den laterale kant af den modsatte halvkugle. Denne skive indeholder, på den tykke side, den auditive nerve rod formidle oplysninger om auditive stimuli til hjernen, den iboende CN kredsløb, og både den disynaptiske excitatoriske og trisynaptiske hæmmende afferent veje, der konvergerer på kontralaterale MOC neuroner. Optagelse udføres fra MOC neuroner på den tynde side af skiven, hvor de visualiseres ved hjælp af DIC optik til typiske patch-clamp eksperimenter. Direkte stimulering af hørenerven udføres, da den kommer ind i den auditive hjernestamme, hvilket giver mulighed for iboende CN kredsløb aktivitet og synaptisk plasticitet at forekomme på synapser opstrøms for MOC neuroner. Med denne teknik, kan man efterligne in vivo kredsløb aktivering så tæt som muligt i skiven. Denne kile skive forberedelse gælder for andre hjerne kredsløb, hvor kredsløb analyser ville drage fordel af bevarelse af upstream tilslutningsmuligheder og langtrækkende input, i kombination med de tekniske fordele ved in vitro skive fysiologi.

Histologisk undersøgelse af kile skive Til vores undersøgelse af auditive hjernestammen neuron funktion, kilen skive forberedelse var designet til at indeholde auditive nerve rod og CN kontralaterale til MOC neuroner målrettet til optagelser (eksempel skive vist i figur 1B). Indledende histologisk undersøgelse af præparatet er vigtigt for at bekræfte, at skiven indeholder de kerner, der er nødvendige for kredsløbsaktivering, og at axonale projektioner er intakte. ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Integration af forskellige synaptiske input til neuroner måles bedst i et præparat, der bevarer alle præ-synaptiske kerner for naturlig timing og kredsløb plasticitet, men hjernen skiver typisk afskære mange forbindelser. Vi udviklede en modificeret hjerneskive til at efterligne in vivo kredsløbsaktivitet, samtidig med at vitro-eksperimenterne opretholdes.

In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Brain skive eksperimenter tillader forhør af neuronal funktion med høj elektrisk og tidsmæssig opløsning, men disse skiver typisk afskære mange præsynaptiske forbindelser. En kileformet skive opretholder et mere intakt præsynaptisk kredsløb. Denne modificerede hjerne skive fastholder en mere komplet in vivo-lignende neuronal kredsløb samtidig give fordelene ved in vitro eksperimenter, såsom visuelt guidede patch klemme optagelser, farmakologi, og aktivitet billeddannelse.Nøjagtig kile skiveskåret geometri kan estimeres baseret på atlasplaceringerne af neuronerne i kredsløbet, men integriteten af den præsynaptiske schemata og axoner bør bestemmes ved hjælp af histologi. Begynd med at bruge et barberblad til at skære huden på midterlinjen af kraniet fra næsen til bagsiden af halsen. Skræl huden tilbage for at afsløre kraniet og starte i bunden af kraniet og fortsætte mod næsen, bruge små saks til at foretage et snit i kraniet gennem midterlinjen.På lambda sutur, foretage nedskæringer i kraniet fra midterlinjen sidelæns mod øret på begge sider til at skrælle tilbage kraniet for at afsløre hjernen. Start ved rostral ende, bruge en lille lab spatel til forsigtigt at løfte hjernen fra kraniet for at tillade synsnerver, der skal afskåret. Fortsæt med forsigtigt at arbejde hjernen baglæns, udsætter den ventrale overflade og bruge fine kraftang til omhyggeligt at klemme trigeminusnerver nær den ventrale overflade af hjernestammen til at skære dem.Præparatet i et glas petriskål fyldt med kold udskæringsopløsning og læg skålen under et dissekerende mikroskop. Trim ansigtsnervene tæt på hjernestammen for at afsløre vestibulocochlear nerver. Brug fine kraftafrene til at skubbe spidserne ind i foramina, hvor vestibulocochlear nerven forlader kraniet så vidt muligt.Knibe for at afskære nerverne på begge sider, forlader nerveroden knyttet til hjernestammen. Fjern meninges og vaskulatur fra den ventrale overflade af hjernestammen nær trapez kroppen. Derefter klemme de resterende kranienerver og bindevæv til at befri hjernen helt fra kraniet, idet du skal passe på at bevare de resterende rygmarv, hvis det er muligt.For at forberede overfladen af hjernen til armaturet til scenen placere hjernen ventrale side op og bruge en stump værktøj til forsigtigt immobilisere rygmarven til at stabilisere hjernevævet. Indsæt åbne kraftbefængsel i en ca. 20 graders vinkel gennem hjernen til bunden af skålen, så spidserne forlader hjernefladen til den optiske chiasm og brug et barberblad til at skære langs hændebene. Dernæst forberede en kubikcentimeter blok på 4% agar og sprede en lille dråbe lim i et rektangel på scenen.Brug snævle til forsigtigt at løfte hjernen og forsigtigt dupper den overskydende væske med kanten af en køkkenrulle. Placer derefter den blokerede overflade på limen, så den ventrale overflade vender mod klingens retning under udskæringen, og skub agarblokken forsigtigt mod dorsaloverfladen som støtte. For at erhverve kile skiver med cochlear nerverod på den tykke side og den mediale olivocochlear neuroner og den mediale kerne af trapez kroppen på den tynde side, placere den magnetiske disk med den fastgjorte hjerne på scenen indehaveren og placere indehaveren i udskæring kammer af en vibratome med ventrale overflade af hjernen orienteret mod bladet.Fyld kammeret med iskold udskæringsopløsning, og sænk klingen ned i carbogens boblede opløsning. Skær skiver caudal til regionen af interesse for at sikre skiver er symmetriske. Skift derefter scenen ca. 15 grader til den ene side.Fortsæt med at skære forsigtigt, indtil den auditive nerverod er tæt på overfladen på den ene side, og ansigtsnerven kan ses på overfladen af den anden side af skiven. Skift scenen 15 grader tilbage til den oprindelige position og flyt bladet væk fra vævet. Drej scenebasen 90 grader, så den laterale kant af den tynde side vender mod klingen og sænker klingen flere hundrede mikron, før klingen langsomt bringes tæt på kanten af vævet.Når klingen trækkes lidt tilbage, sænkes klingen til den ønskede tykkelse af skivens tynde kant. Flyt klingen tilbage fra vævet, og drej scenebasen tilbage, så den ventrale overflade vender mod scenebasen. Lav et snit til at betegne rostraloverfladen af kilen skiven og overføre skiven til en kvadratcent centimeter stykke interface papir caudle overflade ned.Ansigtsnerven skal være synlig på begge halvkugler af skiven på rostraloverfladen. Flyt derefter skiven til et 35 grader Celsius inkubationskammer for at komme sig i 30 minutter. For at opsætte kile skive til elektrofysiologi analyse placere prøven i et optagekammer, der bliver kontinuerligt perfunderet med 35 grader Celsius ACSF og stabilisere skiven.Brug DIC optik, fokusere på den auditive nerverod på den tykke side af skiven og bruge en mikromanipulator til at flytte den bipolare wolfram stimulere elektrode til auditive nerverod og forsigtigt ind i overfladen af vævet. Flyt synsfeltet til den ventrale kerne af trapezkroppen på den tynde side, og vælg en mediale olivocochlear neuron som mål for patch clamp elektrofysiologi under epifluorescens ved hjælp af et 561 nanometeremissionsfilter. Fyld en optagelsepipette med den relevante interne løsning til det foreslåede eksperiment og under DIC optik patch og optage fra den mediale olivocochlear neuron i hele celle konfigurationen.Juster den elektriske stimulation amplitude af hørenerven for at opnå konsekvente postsynaptiske hændelser i den mediale olivocochlear neuron. Derefter køre passende stimulation protokoller til at observere fremkaldte synaptiske strømme i mediale olivocochlear neuroner. Denne kile skive forberedelse er designet til at indeholde auditive nerve rod og cochlear kernen kontralaterale til den mediale olivocochlear neuroner målrettet til optagelser.I denne cresyl violet farves resectioned kile skive cochlear kernen er til stede i næsten sin fulde rostral-caudal omfang. Og den auditive nerverod observeres ind i cochlear kernen. Desuden indeholder kile skiven neuroner af den mediale kerne af trapez kroppen ipsilateral til den mediale olivocochlear neuroner, hvorfra optagelser udføres.For at bekræfte neuronal tilslutningsmuligheder inden for en kile skive præsynaptiske indgange stimuleres på to måder. For det første stimuleres den ventrale akustiske stria ved midterlinjen elektrisk, hvilket aktiverer T-stellateaksoner direkte og den mediale kerne af trapezkropneuroner via kugleformede buskede celleaksonstimulation og resulterer i postsynaptiske strømme, der måles ved den mediale olivocochlear neuron. Den auditive nerverod stimuleres derefter til at aktivere hele monaural stigende hjernestammekredsløb og til at fremkalde postsynaptiske reaktioner.Sammenligning af de opståede latenspunkter for den første postsynaptiske strøm fremkaldt med direkte stimulering af den ventrale akustiske stria med dem, der fremkaldes med auditiv nervestimulation, afslører en betydeligt længere ventetid i den auditive nervestimuleringshændelse, hvilket indikerer den synaptiske forsinkelse som følge af den yderligere cochlear nucleus synapse, der aktiveres under auditiv nervestimulering. Brugen af anatomiske vartegn og omhyggelig manøvrering af den magnetiske disk fase er afgørende for at skabe kile skiver med intakt neuronal kredsløb og pålidelige fremkaldte post synaptiske reaktioner. Denne udskæring teknik giver en platform for brug af yderligere in vitro elektrofysiologi værktøjer, herunder calcium eller spænding billeddannelse, optogenetik, neurotransmitter uncaging, og både intracellulære og ekstracellulære farmakologi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionel Neuroimaging Med Ultrasonic blod-hjerne barrieren forstyrrelser og mangan-forstærket MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulation af Cerebellær granuleneuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em&gt; At studere Neuronal morfologi og Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

I Utero Elektroporation Approaches to Undersøgelse ophidselse af neuronale subpopulationer og Single-celle Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...