Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke / National Institute on Doofness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.
1. Experimentele preparaten
OPMERKING: Details met betrekking tot de bereiding van de slice, waaronder snijoplossing, snijtemperatuur, segment incubatietemperatuur en apparatuur (enz.) zijn specifiek voor de voorbereiding van de hersenstam die in dit experimen...

De snijden procedure hier beschreven genoemd een wig slice is krachtig voor het behoud van intacte presynaptische neuronale circuits, maar met de toegankelijkheid van de hersenen slice experimenten voor analyse van neuronale functie. Grote zorg moet worden genomen in een aantal eerste stappen om het nut van de voorbereiding voor circuit analyse te maximaliseren. De afmetingen van de wig moeten worden bevestigd aan de hand van histologisch onderzoek, dat integraal is voor de bevestiging dat zowel presynaptische kernen als...

Observatie van de activiteit van neurale circuits wordt idealiter uitgevoerd met native zintuiglijke ingangen en feedback, en intacte connectiviteit tussen hersengebieden, in vivo. Echter, het uitvoeren van experimenten die eencellige resolutie van neurale circuit functie te geven is nog steeds beperkt door technische uitdagingen in de intacte hersenen. Terwijl in vivo extracellulaire elektrofysiologie of multifoton beeldvormingsmethoden kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van activiteit in intacte zenuwstelsels, blijft het moeilijk om te interpreteren hoe verschillende ingangen integreren of subthreshold synaptische ingangen meten. In vivo hele cel opnames overwinnen deze beperkingen, maar zijn uitdagend uit te voeren, zelfs in hersengebieden die gemakkelijk toegankelijk zijn. Technische uitdagingen van eencellige resolutie experimenten worden verder versterkt in bepaalde neuron populaties die zich diep in de hersenen, of in ruimtelijk diffuse populaties die ofwel genetische instrumenten nodig om cellen te lokaliseren in vivo (bijvoorbeeld genetische expressie van channelrhodopsine in combinatie met optrode opname) of post-hoc histochemische identificatie na opname site etikettering (bijvoorbeeld met neurotransmissie-specifieke markers). Wordt diffuus gelegen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam, mediale olivocochlear (MOC) neuronen lijden aan de bovenstaande beperkingen1, waardoor ze zeer moeilijk te bereiken voor in vivo experimenten.
Hersensegmenten (~100-500 μm dikte) zijn al lang gebruikt om hersencircuits te bestuderen, inclusief auditieve hersenstamcircuits, vanwege de fysieke segregatie van verbonden neuronen die zich in hetzelfde segment2,3,4,5,6,7,8,9bevinden. Experimenten met veel dikkere plakjes (>1 mm) zijn in andere laboratoria gebruikt om te begrijpen hoe bilaterale ingangen integreren in gebieden van het superieure olivarycomplex (SOC), waaronder de mediale superieure olijf10,11. Deze plakjes werden zodanig bereid dat axonen van de gehoorzenuw (AN) intact bleven in de slice en werden elektrisch gestimuleerd om synaptische neurotransmitter release in de CN te starten, het nabootsen van activiteit van de eerste orde auditieve neuronen als ze zouden reageren op geluid. Een groot nadeel van deze dikke plakjes is de zichtbaarheid van neuronen voor patch-clamp elektrofysiologische opnames ("patching"). Patchen wordt steeds moeilijker als de vele axonen in dit gebied worden myelinated met de leeftijdvan 12,13,14,15, waardoor het weefsel optisch dicht en verduisterend neuronen, zelfs in een typische, dunne hersenen slice. Ons doel is om in vitro preparaten te creëren die meer lijken op de circuitconnectiviteit van in vivo opnames, maar met de hoge doorvoer en hoge-resolutie opnamemogelijkheden van visueel geleide patch-clamp elektrofysiologie in hersensegmenten.
Ons lab onderzoekt de fysiologie van neuronen van het auditieve efferentsysteem, waaronder MOC-neuronen. Deze cholinerge neuronen geven efferent feedback aan het slakkenplaat door de activiteit van buitenste haarcellen (OHC's)16,17,18,19,20te moduleren . Eerdere studies hebben aangetoond dat deze modulatie een rol speelt bij het verkrijgen van controle in het slakkenmiddel21,22,23,24,25,26 en bescherming tegen akoestisch trauma27,28,29,30,31,32,33. Bij muizen bevinden MOC-neuronen zich diffuus in de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) in de auditieve hersenstam1. Onze groep heeft gebruik gemaakt van de ChAT-IRES-Cre muislijn gekruist met de tdTomato reporter muislijn te richten MOC neuronen in hersenstam plakjes onder epifluorescente verlichting. We toonden aan dat MOC-neuronen afferente-remmende input ontvangen van de ipsilaterale mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB), dat op zijn beurt wordt opgewekt door axonen van bolvormige bossige cellen (GBC) in de contralaterale cochleaire kern (CN)34,35,36,37,38. Bovendien ontvangen MOC-neuronen waarschijnlijk hun excitatory input van T-stellate cellen in de contralaterale GN39,40,41. Samen tonen deze studies aan dat MOC-neuronen zowel excitatory als remmende ingangen ontvangen die zijn afgeleid van hetzelfde (contralaterale) oor. Echter, de presynaptische neuronen, en hun axonen convergerende op MOC neuronen, zijn niet helemaal dicht genoeg bij elkaar om volledig intact in een typische coronale slice voorbereiding. Om te onderzoeken hoe de integratie van synaptische ingangen naar MOC-neuronen hun actiepotentieel beïnvloedt, met een focus op nieuw beschreven remming, ontwikkelden we een preparaat waarin we de diverse afferents naar MOC-neuronen vanuit één oor konden stimuleren op de meest fysiologisch realistische manier mogelijk, maar met de technische voordelen van in vitro brain slice-experimenten.
De wig slice is een gemodificeerde dikke slice voorbereiding ontworpen voor onderzoek van circuit integratie in MOC neuronen (schematized in figuur 1A). Aan de dikke kant van de plak, de wig bevat de afgehakte axonen van de gehoorzenuw (hierna "auditieve zenuwwortel" genoemd) als ze de hersenstam van de periferie en synaps in de CN binnendijzen. De gehoorzenuwwortel kan elektrisch worden gestimuleerd om neurotransmitter-release en synaptische activering van cellen van de volledig intacte GN42,43,44,45,46op te roepen . Dit stimulatieformaat heeft verschillende voordelen voor circuitanalyse. Ten eerste, in plaats van het direct stimuleren van de T-stellate en GBC axonen die afferent input te leveren aan de MOC neuronen, stimuleren we de AN om activering van intrinsieke circuits overvloedig in de CN mogelijk te maken. Deze circuits moduleren de output van CN-neuronen naar hun doelen in de hersenen, waaronder MOC-neuronen46,47,48,49,50,51. Ten tweede, de polysynaptische activering van afferent circuits van de AN via de CN stroomopwaarts van MOC neuronen zorgt voor meer natuurlijke activering timing en voor plasticiteit optreden bij deze synapsen als ze in vivo zou tijdens auditieve stimulatie. Ten derde kunnen we onze stimulatiepatronen variëren om EEN activiteit na te bootsen. Ten slotte zijn zowel excitatory als remmende monaurale projecties voor MOC-neuronen intact in de wigschijf, en hun integratie kan worden gemeten in een MOC-neuron met de precisie van patch-clamp elektrofysiologie. Als geheel, dit activeringsschema biedt een meer intact circuit aan de MOC neuronen in vergelijking met een typische hersenen slice voorbereiding. Deze hersenstam wig slice kan ook worden gebruikt om andere auditieve gebieden die remmende input ontvangen van ipsilaterale MNTB met inbegrip van de laterale superieure olijf, superieure olivary kern en mediale superieure olijf10,11,52,53,54,55,56te onderzoeken . Naast onze specifieke voorbereiding kan deze snijmethode worden gebruikt of aangepast om andere systemen te evalueren met de voordelen van het behoud van connectiviteit van lange-afstandsingangen en het verbeteren van de visualisatie van neuronen voor een verscheidenheid aan eencellige resolutie elektrofysiologie of beeldvormingstechnieken.
Dit protocol vereist het gebruik van een vibratome stage of platform dat ongeveer 15° kan worden gekanteld. Hier gebruiken we een commercieel beschikbare 2-delige magnetische fase waar de "fase" is een metalen schijf met een gebogen bodem geplaatst in een holle magnetische "stage base." Het stadium kan vervolgens worden verschoven om de segmenthoek aan te passen. Concentrische cirkels op de podiumbasis worden gebruikt om de hoek reproduceerbaar te schatten. Het podium en de trapbasis worden in de snijkamer geplaatst, waar ook de magnetische trapbasis kan worden gedraaid.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

In vitro slice elektrofysiologie technieken meten eencellige activiteit met nauwkeurige elektrische en temporele resolutie. Hersenen plakjes moeten relatief dun zijn om goed te visualiseren en toegang neuronen voor patch-clamping of imaging, en in vitro onderzoek van de hersenen circuits is beperkt tot alleen wat fysiek aanwezig is in de acute slice. Om de voordelen van in vitro slice experimenten te behouden met behoud van een groter deel van de presynaptische kernen, ontwikkelden we een nieuwe slice voorbereiding. Deze "wedge slice" is ontworpen voor patch-clamp elektrofysiologie opnames om de diverse monaurale, geluid-gedreven ingangen te middenn olivocochleaire (MOC) neuronen in de hersenstam te karakteriseren. Deze neuronen ontvangen hun primaire afferent excitatory en remmende ingangen van neuronen geactiveerd door stimuli in het contralaterale oor en overeenkomstige cochleaire kern (CN). Een asymmetrische hersenen slice werd ontworpen die het dikst is in de rostro-caudal domein aan de zijdelingse rand van een halfrond en vervolgens dunt naar de laterale rand van het andere halfrond. Dit segment bevat, aan de dikke kant, de auditieve zenuwwortel die informatie over auditieve stimuli naar de hersenen brengt, de intrinsieke CN-circuits, en zowel de disynaptische excitatory als trisynaptische remmende afferentepaden die samenkomen op contralaterale MOC-neuronen. Opname wordt uitgevoerd van MOC neuronen aan de dunne kant van het segment, waar ze worden gevisualiseerd met behulp van DIC optica voor typische patch-clamp experimenten. Directe stimulatie van de gehoorzenuw wordt uitgevoerd als het in de auditieve hersenstam, waardoor voor intrinsieke CN circuit activiteit en synaptische plasticiteit optreden bij synapsen stroomopwaarts van MOC neuronen. Met deze techniek kan men in vivo circuitactivering zo dicht mogelijk binnen het segment nabootsen. Deze wig slice voorbereiding is van toepassing op andere hersencircuits waar circuit analyses zouden profiteren van het behoud van upstream connectiviteit en lange afstand ingangen, in combinatie met de technische voordelen van in vitro slice fysiologie.

Histologisch onderzoek van wigschijf Voor ons onderzoek van auditieve hersenstam neuron functie, de wig slice voorbereiding is ontworpen om de auditieve zenuwwortel en CN contralaterale bevatten met de MOC neuronen gericht op opnames (voorbeeld slice weergegeven in figuur 1B). Eerste histologische onderzoek van het preparaat is belangrijk om te bevestigen dat de slice bevat de kernen die nodig zijn voor circuit activering en dat axonale projecties intact zijn. Twee celtyp...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Integratie van diverse synaptische ingangen naar neuronen wordt het best gemeten in een preparaat dat alle pre-synaptische kernen voor natuurlijke timing en circuit plasticiteit behoudt, maar hersenen plakjes meestal verbreken veel verbindingen. We ontwikkelden een gemodificeerde hersenen slice na te bootsen in vivo circuit activiteit met behoud van in vitro experimentatie vermogen.

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Brain slice experimenten maken ondervraging van neuronale functie met een hoge elektrische en temporele resolutie, maar deze plakjes meestal verbreken veel presynaptische verbindingen. Een wigvormige plak behoudt een meer intacte presynaptische circuits. Deze gemodificeerde hersenen slice onderhoudt een meer complete in vivo-achtige neuronale circuit, terwijl het verstrekken van de voordelen van in vitro experimenten, zoals visueel geleide patch klem opnames, farmacologie, en activiteit imaging.Nauwkeurige in plakjes gesneden geometrie kan worden geschat op basis van de atlaslocaties van de neuronen in het circuit, maar de integriteit van de presynaptische schemata en axonen moet worden bepaald met behulp van histologie. Begin met het gebruik van een scheermesje om de huid te snijden op de middellijn van de schedel van de neus naar de achterkant van de nek. Pel de huid terug om de schedel bloot te stellen en te beginnen aan de basis van de schedel en verder naar de neus te gaan, gebruik kleine schaar om een incisie in de schedel door de middellijn te maken.Bij de lambda hechting, maak snijwonden in de schedel van de middellijn lateraal naar het oor aan beide zijden om de schedel terug te pellen om de hersenen bloot te stellen. Vanaf het rostrale uiteinde, gebruik een kleine lab spatel om de hersenen voorzichtig uit de schedel te tillen om de optische zenuwen te laten worden doorgesneden. Blijven voorzichtig werken de hersenen achteruit, het blootstellen van de ventrale oppervlak en gebruik fijne tangen om zorgvuldig knijpen de trigeminuszenuwen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam om ze te snijden.Plaats de bereiding in een glazen petrischaal gevuld met koude snijoplossing en leg de schotel onder een ontledenmicroscoop. Trim de gezichtszenuwen dicht bij de hersenstam om de vestibulocochlear zenuwen bloot te leggen. Gebruik fijne tangen om de uiteinden in de foramina te duwen waar de vestibulocochlear zenuw de schedel zo ver mogelijk verlaat.Knijp om de zenuwen aan beide zijden te verbreken, waardoor de zenuwwortel aan de hersenstam wordt bevestigd. Verwijder de hersenvliezen en vasculatuur van het ventrale oppervlak van de hersenstam in de buurt van het trapeziumlichaam. Knijp dan de resterende craniale zenuwen en bindweefsel om de hersenen volledig te bevrijden van de schedel, het verzorgen van de resterende ruggenmerg te behouden, indien mogelijk.Ter voorbereiding van het oppervlak van de hersenen voor armatuur naar het podium plaats de hersenen ventrale kant omhoog en gebruik een stomp instrument om zachtjes immobiliseren van het ruggenmerg om het hersenweefsel te stabiliseren. Steek open tangen in een hoek van ongeveer 20 graden door de hersenen naar de bodem van de schotel, zodat de tips verlaten de dorsale oppervlak van de hersenen caudal aan de optische chiasm en gebruik een scheermesje te snijden langs de tangen. Bereid vervolgens een blok van één kubieke centimeter van 4% agar voor en spreid een kleine druppel lijm in een rechthoek op het podium.Gebruik tangen om de hersenen voorzichtig op te tillen en voorzichtig de overtollige vloeistof te deppen met de rand van een papieren handdoek. Plaats vervolgens het geblokkeerde oppervlak op de lijm, zodat het ventrale oppervlak tijdens het snijden naar de richting van het blad zal worden gericht en het agarblok voorzichtig tegen het rugoppervlak zal duwen als ondersteuning. Om wigplakjes met de cochleaire zenuwwortel aan de dikke kant en de mediale olivocochleaire neuronen en de mediale kern van het trapeziumlichaam aan de dunne kant te verwerven, plaatst u de magnetische schijf met de bijgevoegde hersenen op de podiumhouder en plaatst u de houder in de snijkamer van een vibratome met het ventrale oppervlak van de hersenen gericht op het blad.Vul de kamer met ijskoude snijoplossing en laat het mes in de carbogen bubbeloplossing zakken. Snijd plakjes caudal aan het gebied van belang om ervoor te zorgen dat de plakjes symmetrisch zijn. Verleg het podium dan ongeveer 15 graden aan de ene kant.Blijf zorgvuldig snijden totdat de gehoorzenuwwortel aan de ene kant dicht bij het oppervlak ligt en de gezichtszenuw aan het oppervlak van de andere kant van de plak te zien is. Verplaats het stadium 15 graden terug naar de oorspronkelijke positie en verplaats het mes uit de buurt van het weefsel. Draai de trapbasis 90 graden, zodat de zijdelingse rand van de dunne kant is gericht op het blad en laat het blad enkele honderden micron voordat langzaam brengen het blad dicht bij de rand van het weefsel.Met het blad ingetrokken iets lager het blad tot de gewenste dikte van de dunne rand van het segment. Beweeg het mes terug van het weefsel en draai de trapbasis terug zodat het ventrale oppervlak naar de trapbasis kijkt. Maak een snede om het rostrale oppervlak van de wig schijf aan te wijzen en breng het segment naar een een vierkante centimeter stuk van de interface papier caudle oppervlak naar beneden.De gezichtszenuw moet zichtbaar zijn op beide hemisferen van de slice op het rostrale oppervlak. Verplaats het segment vervolgens naar een incubatiekamer van 35 graden Celsius om 30 minuten te herstellen. Als u de wigschijf voor elektrofysiologieanalyse wilt instellen, plaatst u het monster in een opnamekamer die continu wordt geperfuseerd met 35 graden Celsius ACSF en stabiliseert u het segment.Met behulp van DIC optica, richten op de gehoorzenuwwortel op de dikke kant van de slice en gebruik een micromanipulator om de bipolaire wolfraam stimulerende elektrode te verplaatsen naar de gehoorzenuwwortel en zachtjes in het oppervlak van het weefsel. Verplaats het gezichtsveld naar de ventrale kern van het trapeziumlichaam aan de dunne kant en selecteer een mediale olivocochleair neuron als doelwit voor patchklem elektrofysiologie onder epifluorescentie met behulp van een 561 nanometer emissiefilter. Vul een opnamepipet met de juiste interne oplossing voor het voorgestelde experiment en onder DIC-optische patch en neem op van het mediale olivocochlear-neuron in de hele celconfiguratie.Pas de elektrische stimulatieamplitude van de gehoorzenuwwortel aan om consistente postsynaptische gebeurtenissen in het mediale olivocochlear-neuron te verkrijgen. Voer vervolgens de juiste stimulatieprotocollen uit om opgeroepen synaptische stromen in mediale olivocochleaire neuronen te observeren. Deze wig slice voorbereiding is ontworpen om de auditieve zenuwwortel en de cochleaire kern contralaterale bevatten aan de mediale olivocochleaire neuronen gericht voor opnames.In deze cresyl violet gekleurde resectie gesneden wigschijf is de cochleaire kern aanwezig in bijna zijn volledige rostral-caudal omvang. En de gehoorzenuwwortel wordt waargenomen bij het invoeren van de cochleaire kern. Bovendien bevat de wigschijf neuronen van de mediale kern van het trapeziumlichaam ipsilaterale aan de mediale olivocochleaire neuronen waaruit opnames worden uitgevoerd.Om de neuronale connectiviteit binnen een wig slice presynaptische ingangen te bevestigen worden gestimuleerd op twee manieren. Ten eerste wordt de ventrale akoestische stria aan de middellijn elektrisch gestimuleerd, waardoor T-stellate axonen direct worden geactiveerd en de mediale kern van de trapeziumlichaamneuronen via bolvormige bushy cell axon stimulatie en resulterend in postsynaptische stromen die worden gemeten op het mediale olivocochlear neuron. De gehoorzenuwwortel wordt vervolgens gestimuleerd om de gehele monaurale opgaande hersenstamcircuits te activeren en postsynaptische reacties op te roepen.Vergelijking van de beginlatentie maatregelen van de eerste postsynaptische stroom opgeroepen met directe stimulatie van de ventrale akoestische stria met die opgeroepen met auditieve zenuwstimulatie blijkt een aanzienlijk langere latentie in de auditieve zenuwstimulatie gebeurtenis, indicatief voor de synaptische vertraging als gevolg van de extra cochleaire kernsynapse geactiveerd tijdens auditieve zenuwstimulatie. Het gebruik van anatomische oriëntatiepunten en zorgvuldige manoeuvreerwerk van de magnetische schijffase zijn van cruciaal belang voor het maken van wigsegmenten met intacte neuronale circuits en betrouwbare opgeroepen postsynaptische reacties. Deze snijtechniek biedt een platform voor het gebruik van extra in vitro elektrofysiologie tools, waaronder calcium of spanning beeldvorming, optogenetica, neurotransmitter uncaging, en zowel intracellulaire en extracellulaire farmacologie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...