Name: in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros des NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.
1. Préparations expérimentales
REMARQUE : Les détails concernant la préparation des tranches, y compris la solution de tranchage, la température de tranchage, la température d’incubation des tranches et l’appareil (etc.), sont spécifiques à...

La procédure de tranchage décrite ici appelée tranche compensée est puissante pour maintenir des circuits neuronaux présynaptiques intacts, mais avec l’accessibilité de l’expérimentation de tranche de cerveau pour l’analyse de la fonction neuronale. Un grand soin doit être pris en plusieurs étapes initiales afin de maximiser l’utilité de la préparation à l’analyse du circuit. Les dimensions du coin doivent être confirmées à l’aide de l’examen histologique, qui fait partie intégrante de la co...

L’observation de l’activité des circuits neuronaux est idéalement effectuée avec les entrées sensorielles indigènes et la rétroaction, et la connectivité intacte entre les régions du cerveau, in vivo. Cependant, l’exécution d’expériences qui donnent une résolution à cellule unique de la fonction du circuit neuronal est encore limitée par des défis techniques dans le cerveau intact. Bien que des méthodes d’électrophysiologie extracellulaire in vivo ou d’imagerie multiphoton puissent être utilisées pour étudier l’activité dans les systèmes nerveux intacts, il reste difficile d’interpréter comment différents intrants intègrent ou mesurent les intrants synaptiques sous-marins. Les enregistrements in vivo à cellules entières surmontent ces limitations, mais sont difficiles à réaliser, même dans les régions du cerveau qui sont facilement accessibles. Les défis techniques des expériences de résolution à cellules uniques sont encore amplifiés dans certaines populations de neurones qui sont situées profondément dans le cerveau, ou dans des populations spatialement diffuses qui nécessitent soit des outils génétiques pour localiser les cellules in vivo (p. ex., expression génétique de la canalrhodopsine associée à l’enregistrement optrode) soit une identification histochimique post-hoc après l’étiquetage du site d’enregistrement (p. ex. avec des marqueurs spécifiques à la neurotransmission). Étant situés de façon diffuse près de la surface ventrale du tronc cérébral, les neurones olivocochléaires médiaux (MOC) souffrent des limitationsci-dessus 1,ce qui les rend extrêmement difficiles d’accès pour l’expérimentation in vivo.
Les tranches de cerveau (~100-500 μm d’épaisseur) ont longtemps été utilisées pour étudier les circuits cérébraux, y compris les circuits auditifs de tronc cérébral, en raison de la ségrégation physique des neurones connectés qui sont contenus dans la mêmetranche 2,3,4,5,6,7,8,9. Des expériences utilisant des tranches beaucoup plus épaisses (>1 mm) ont été utilisées dans d’autres laboratoires pour comprendre comment les intrants bilatéraux s’intègrent dans les zones du complexe olivary supérieur (SOC) y compris l’olive supérieuremédiale 10,11. Ces tranches ont été préparées de telle sorte que les axones du nerf auditif (AN) sont restés intacts dans la tranche et ont été stimulés électriquement pour lancer la libération synaptique de neurotransmetteur dans le CN, imitant l’activité des neurones auditifs de premier ordre pendant qu’ils répondaient au bruit. Un inconvénient majeur de ces tranches épaisses est la visibilité des neurones pour les enregistrements électrophysiologiques patch-clamp (« patching »). Patching devient de plus en plus difficile que les nombreux axones dans ce domaine deviennent myélinated avecl’âge de 12,13,14,15, ce qui rend le tissu optiquement dense et obscurcissant neurones, même dans une typique, mince tranche de cerveau. Notre objectif est de créer des préparations in vitro qui ressemblent plus étroitement à la connectivité du circuit des enregistrements in vivo, mais avec les capacités d’enregistrement à haut débit et haute résolution de l’électrophysiologie visuellement guidée patch-clamp en tranches de cerveau.
Notre laboratoire étudie la physiologie des neurones du système auditif efferent, y compris les neurones MOC. Ces neurones cholinergiques fournissent une rétroaction efferent à la cochlée en modulant l’activité des cellules ciliées externes (OHCs)16,17,18,19,20. Des études antérieures ont montré que cette modulation joue un rôle dans le contrôle de la cochlée21,22,23,24,25,26 etla protection contre les traumatismesacoustiques 27,28,29,30,31,32,33. Chez la souris, les neurones MOC sont diffusement situés dans le noyau ventral du corps trapézoïde (VNTB) dans le tronc cérébral auditif1. Notre groupe a utilisé la ligne de souris ChAT-IRES-Cre croisée avec la ligne de souris tdTomato reporter pour cibler les neurones MOC dans les tranches de tronc cérébral sous l’illumination épifluorescente. Nous avons montré que les neurones MOC reçoivent l’entrée inhibitrice afferent du noyau médial ipsilateral du corps trapézoïde (MNTB), qui est excité, à son tour, par les axones des cellules touffue globulaires (GBC) dans le noyau cochléaire contralatéral (CN)34,35,36,37,38. En outre, les neurones MOC reçoivent probablement leur apport excitateur des cellules T-stellate dans le CN contralatéral39,40,41. Pris ensemble, ces études montrent que les neurones MOC reçoivent à la fois des intrants excitatifs et inhibiteurs dérivés de la même oreille (contralatérale). Cependant, les neurones présynaptiques, et leurs axones convergeant vers les neurones MOC, ne sont pas assez proches les uns des autres pour être entièrement intacts dans une préparation typique de tranche coronale. Pour étudier comment l’intégration des intrants synaptiques aux neurones MOC affecte leurs modèles de tir potentiels d’action, en nous concentrant sur l’inhibition nouvellement décrite, nous avons développé une préparation dans laquelle nous pourrions stimuler les divers afferents aux neurones MOC d’une oreille de la manière la plus physiologiquement réaliste possible, mais avec les avantages techniques des expériences in vitro de tranches cérébrales.
La tranche compensée est une tranche épaisse modifiée conçue pour l’étude de l’intégration des circuits dans les neurones MOC (schématisé dans la figure 1A). Sur le côté épais de la tranche, le coin contient les axones sectionnés du nerf auditif (appelé « racine de nerf auditif » ci-après) lorsqu’ils pénètrent dans le tronc cérébral à partir de la périphérie et de la synapse du CN. La racine auditive de nerf peut être électriquement stimulée pour évoquer la libération de neurotransmetteur et l’activation synaptique des cellules du CN entièrement intact42,43,44,45,46. Ce format de stimulation a plusieurs avantages pour l’analyse de circuit. Tout d’abord, au lieu de stimuler directement les axones T-stellate et GBC qui fournissent une entrée afferent aux neurones MOC, nous stimulons l’AN pour permettre l’activation des circuits intrinsèques abondants dans le CN. Ces circuits modulent la production de neurones CN à leurs cibles dans tout le cerveau, y compris les neurones MOC46,47,48,49,50,51. Deuxièmement, l’activation polysynaptique des circuits afferents de l’AN à travers le CN en amont des neurones MOC permet un timing d’activation plus naturel et pour la plasticité de se produire à ces synapses comme ils le feraient in vivo pendant la stimulation auditive. Troisièmement, nous pouvons varier nos modèles de stimulation pour imiter une activité. Enfin, les projections monaurales excitatrices et inhibitrices des neurones MOC sont intactes dans la tranche compensée, et leur intégration peut être mesurée à un neurone MOC avec la précision de l’électrophysiologie patch-clamp. Dans l’ensemble, ce système d’activation fournit un circuit plus intact aux neurones MOC par rapport à une préparation typique des tranches de cerveau. Cette tranche de coin de tronc cérébral peut également être employée pour étudier d’autres secteurs auditifs qui reçoivent l’entrée inhibitrice du MNTB ipsilateral comprenant l’olive supérieure latérale, le noyau olivary supérieur et l’olive supérieure médiale10,11,52,53,54,55,56. Au-delà de notre préparation spécifique, cette méthode de tranchage peut être utilisée ou modifiée pour évaluer d’autres systèmes avec les avantages de maintenir la connectivité des entrées à longue portée et d’améliorer la visualisation des neurones pour une variété d’électrophysiologie à résolution unicellique ou de techniques d’imagerie.
Ce protocole nécessite l’utilisation d’un stade ou d’une plate-forme vibratoire qui peut être incliné d’environ 15°. Ici, nous utilisons une scène magnétique de 2 pièces disponible dans le commerce où la « scène » est un disque métallique avec un fond incurvé placé dans une concave magnétique « base de scène. » La scène peut ensuite être déplacée pour ajuster l’angle de la tranche. Des cercles concentriques sur la base de scène sont utilisés pour estimer l’angle reproductiblement. La scène et la base de la scène sont placées dans la chambre de tranchage, où la base de scène magnétique peut également être tournée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimental Preparations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423500</td>
			<td>4% agar block used to stabilize brain tissue during vibratome sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor Hydrazide 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td>Fluorophore used in internal solution to confirm successful MOC neuron patch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Geneses Scientific (Intramalls)</td>
			<td>AV114</td>
			<td>Weighing chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edged razor blade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-6</td>
			<td>Vibratome cutting blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid (5g)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>K3375-5G</td>
			<td>Slicing ACSF additive used to reduce neuron activity during dissection and slicing in order to improve tissue health for patch clamping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>13-620-451</td>
			<td>Solution pH tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic petri dishes 100mm dia X 20mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556-002</td>
			<td>4% Agar Prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>11-500-150</td>
			<td>Heating for 4% Agar preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and Slicing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B4261-250MG</td>
			<td>Chemical used for axonal tracing (conjugated to Streptavidin 488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SM-1BN</td>
			<td>For precision dissection during brain removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Fine forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy tweezers #3</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501976</td>
			<td>Forceps dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri Dish 150mm dia x 15mm H</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-747E</td>
			<td>Dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface paper (203 X 254mm PCTE Membrane 10um)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1220823</td>
			<td>Slice incubation/biocytin application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1200S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td>Vibratome for wedge slice sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6872</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged carbon steel blades</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Razor blade for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc, orienting</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142068</td>
			<td>Specialized vibratome stage for reproducible tilting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoonula</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-375-10</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Newegg</td>
			<td>15187</td>
			<td>Used for glueing tissue to vibratome stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Dissection tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Upright Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Electrophysiology and imaging microscope, can be any microscope compatible with electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Borosilicate glass w/ Filament OD 1.5mm, ID 1.1mm, 10 cm long</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Patch clamping pipette glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Filler MicroFil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>CMF20G</td>
			<td>Patch electrode pipette filler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line solution heater</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td>Slice perfusion system heater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Micromanipulator Systems</td>
			<td>Sutter Intruments</td>
			<td>MPC-200 with MP285</td>
			<td>Micromanipulators for patch clamp and stimulation electrode placement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 horizontal pipette puller for glass micropipettes</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>FG-P1000</td>
			<td>Patch clamp pipetter puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier and Software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10 / Patchmaster Next</td>
			<td>Can be any amplifier/software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC26G</td>
			<td>Slice &#34;bath&#34; during recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Chamber Harp</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>640253</td>
			<td>Stablizes slice during electrophysiology recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Incubation Chamber</td>
			<td>Custom Build</td>
			<td></td>
			<td>Heated, oxygenated holding chamber for slices during recovery after slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I.</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolation unit for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 60CC</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-820-11</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Slice perfusion system temperature controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing 1/8 OD 1/16 ID</td>
			<td>Fischer Scientific (Intramalls)</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Electrophysiology perfusion fluid handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tugsten concentric bipolar microelectrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TM33CCINS</td>
			<td>Stimulating electrode for electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-556006</td>
			<td>Histology slice collection and immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immuno labs</td>
			<td>016-540-084</td>
			<td>Secondary antibody for biocytin visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Orbital Shaker</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS6780FP</td>
			<td>Shaker for immunohistochemistry agitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>Cellular stain for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Microtome Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-210-052</td>
			<td>Sliding microtome blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter-syringe Nalgene 4mm Cellulose Acetate 0.2um</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>09-740-34A</td>
			<td>Syringe filter for filling recording pipettes with internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td>Immunohistochemistry fluorescence mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide staining dish with rack</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>08-812</td>
			<td>Cresyl Violet staining chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microm HM450 Sliding Microtome</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>910020</td>
			<td>Freezing microtome for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses: Rectangles 50mm X 24mm</td>
			<td>Fisher Scientific (Intramalls)</td>
			<td>12-543D</td>
			<td>Histochemistry slide cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td>Cresyl violet section mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034980</td>
			<td>Histology slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro wedge slice preparation for mimicking in vivo neuronal circuit connectivity

Les techniques d’électrophysiologie des tranches in vitro mesurent l’activité unicellique avec une résolution électrique et temporelle précise. Les tranches de cerveau doivent être relativement minces pour visualiser et accéder correctement aux neurones pour le patch-clamping ou l’imagerie, et l’examen in vitro des circuits cérébraux est limité à seulement ce qui est physiquement présent dans la tranche aiguë. Pour maintenir les avantages de l’expérimentation des tranches in vitro tout en préservant une plus grande partie des noyaux présynaptiques, nous avons développé une nouvelle préparation de tranches. Cette « tranche compensée » a été conçue pour les enregistrements d’électrophysiologie patch-clamp pour caractériser les diverses entrées monales et sonores aux neurones olivocochléaires médiaux (MOC) dans le tronc cérébral. Ces neurones reçoivent leurs entrées excitatrices et inhibitrices primaires afferent des neurones activés par des stimuli dans l’oreille contralatérale et le noyau cochléaire correspondant (CN). Une tranche de cerveau asymétrique a été conçue qui est la plus épaisse dans le domaine rostro-caudal au bord latéral d’un hémisphère, puis s’amince vers le bord latéral de l’hémisphère opposé. Cette tranche contient, sur le côté épais, la racine du nerf auditif transmettant des informations sur les stimuli auditifs au cerveau, les circuits intrinsèques du CN, et à la fois les voies afferentes excitatrices et trisynaptiques disynaptiques qui convergent vers les neurones moc contralatéraux. L’enregistrement est effectué à partir de neurones MOC sur le côté mince de la tranche, où ils sont visualisés à l’aide de l’optique DIC pour les expériences typiques patch-clamp. La stimulation directe du nerf auditif est effectuée à mesure qu’il pénètre dans le tronc cérébral auditif, ce qui permet à l’activité intrinsèque du circuit CN et à la plasticité synaptique de se produire aux synapses en amont des neurones MOC. Avec cette technique, on peut imiter l’activation du circuit in vivo aussi étroitement que possible dans la tranche. Cette préparation en tranches compensées s’applique à d’autres circuits cérébraux où les analyses de circuits bénéficieraient de la préservation de la connectivité en amont et des intrants à longue portée, en combinaison avec les avantages techniques de la physiologie des tranches in vitro.

Examen histologique de la tranche de coin Pour notre étude de la fonction auditive des neurones du tronc cérébral, la préparation de la tranche compensée a été conçue pour contenir la racine nerveuse auditive et le CN contralatéral aux neurones MOC ciblés pour les enregistrements (tranche d’exemple indiquée à la figure 1B). L’examen histologique initial de la préparation est important pour confirmer que la tranche contient les noyaux nécessaires à l’a...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity at JoVE.com

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

L’intégration de diverses entrées synaptiques aux neurones est mieux mesurée dans une préparation qui préserve tous les noyaux pré-synaptiques pour le timing naturel et la plasticité du circuit, mais les tranches de cerveau coupent généralement de nombreuses connexions. Nous avons développé une tranche de cerveau modifiée pour imiter l’activité du circuit in vivo tout en maintenant la capacité d’expérimentation in vitro.

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Les expériences de tranche de cerveau permettent l’interrogation de la fonction neuronale avec la résolution électrique et temporelle élevée, mais ces tranches coupent typiquement beaucoup de connexions presynaptic. Une tranche en forme de coin maintient un circuit présynaptique plus intact. Cette tranche de cerveau modifiée maintient un circuit neuronal in vivo-like plus complet tout en fournissant les avantages de l’expérimentation in vitro, telle que les enregistrements visuellement guidés de pince de correction, la pharmacologie, et l’imagerie d’activité.La géométrie précise des tranches compensées peut être estimée en fonction de l’emplacement de l’atlas des neurones dans le circuit, mais l’intégrité des schemata et des axones présynaptiques doit être déterminée à l’aide de l’histologie. Commencez par utiliser une lame de rasoir pour couper la peau à la ligne médiane du crâne du nez à l’arrière du cou. Peler la peau pour exposer le crâne et à partir de la base du crâne et en continuant vers le nez, utiliser de petits ciseaux pour faire une incision dans le crâne à travers la ligne médiane.À la suture lambda, faire des coupures dans le crâne de la ligne médiane latéralement vers l’oreille des deux côtés pour peler le crâne pour exposer le cerveau. À partir de l’extrémité rostrale, utilisez une petite spatule de laboratoire pour soulever doucement le cerveau du crâne pour permettre aux nerfs optiques d’être sectionnés. Continuez à travailler doucement le cerveau vers l’arrière, exposant la surface ventrale et utilisez des forceps fins pour pincer soigneusement les nerfs trigeminaux près de la surface ventrale du tronc cérébral pour les couper.Placer la préparation dans une boîte de Pétri en verre remplie d’une solution de tranchage froid et placer le plat sous un microscope à disséquer. Coupez les nerfs faciaux près du tronc cérébral pour exposer les nerfs vestibulocochlear. Utilisez des forceps fins pour pousser les pointes dans le foramina où le nerf vestibulocochlear sort du crâne autant que possible.Pincer pour couper les nerfs des deux côtés, en laissant la racine nerveuse attachée au tronc cérébral. Retirez les méninges et la vascularisation de la surface ventrale du tronc cérébral près du corps trapézoïde. Pincez ensuite les nerfs crâniens restants et le tissu conjonctif pour libérer complètement le cerveau du crâne, en prenant soin de préserver le reste de la moelle épinière, si possible.Pour préparer la surface du cerveau pour l’appareil à la scène placer le côté ventral du cerveau vers le haut et utiliser un outil contondant pour immobiliser doucement la moelle épinière pour stabiliser le tissu cérébral. Insérez des forceps ouverts à un angle d’environ 20 degrés à travers le cerveau jusqu’au fond du plat afin que les extrémités sortent de la surface dorsale du caudal cérébral jusqu’au chiasm optique et utilisent une lame de rasoir pour couper le long des forceps. Ensuite, préparez un bloc d’un centimètre cube de 4% d’agar et étalez une petite goutte de colle dans un rectangle sur la scène.Utilisez des forceps pour soulever soigneusement le cerveau et tamponner doucement l’excès de liquide avec le bord d’une serviette en papier. Placez ensuite la surface bloquée sur la colle de sorte que la surface ventrale sera orientée vers la direction de la lame pendant le tranchage et poussez doucement le bloc d’agar contre la surface dorsale comme support. Pour acquérir des tranches compensées avec la racine nerveuse cochléaire sur le côté épais et les neurones olivocochléaires médiaux et le noyau médial du corps trapézoïde sur le côté mince, placez le disque magnétique avec le cerveau attaché sur le support de scène et placez le support dans la chambre de tranchage d’un vibratome avec la surface ventrale du cerveau orientée vers la lame.Remplissez la chambre d’une solution de tranchage glacé et abaissez la lame dans la solution à bulles carbogen. Couper les tranches caudales à la région d’intérêt pour s’assurer que les tranches sont symétriques. Déplacez ensuite la scène d’environ 15 degrés d’un côté.Continuer à trancher soigneusement jusqu’à ce que la racine nerveuse auditive soit près de la surface d’un côté et que le nerf facial puisse être vu à la surface de l’autre côté de la tranche. Déplacez la scène de 15 degrés vers la position d’origine et éloignez la lame du tissu. Faites tourner la base de la scène à 90 degrés de sorte que le bord latéral du côté mince soit face à la lame et abaissez la lame de plusieurs centaines de microns avant d’amener lentement la lame près du bord du tissu.Avec la lame rétractée légèrement abaisser la lame à l’épaisseur désirée du bord mince de la tranche. Déplacez la lame du tissu et faites tourner la base de la scène vers l’arrière de sorte que la surface ventrale fait face à la base de la scène. Faire une coupe pour désigner la surface rostrale de la tranche compensée et transférer la tranche à un morceau carré centimètre de papier d’interface caudle surface vers le bas.Le nerf facial doit être visible sur les deux hémisphères de la tranche sur la surface rostrale. Déplacez ensuite la tranche dans une chambre d’incubation de 35 degrés Celsius pour la récupérer pendant 30 minutes. Pour mettre en place la tranche compensée pour l’analyse électrophysiologique placer l’échantillon dans une chambre d’enregistrement qui est continuellement perfusé avec 35 degrés Celsius ACSF et stabiliser la tranche.À l’aide de l’optique DIC, concentrez-vous sur la racine nerveuse auditive sur le côté épais de la tranche et utilisez un micromanipulateur pour déplacer l’électrode bipolaire stimulant le tungstène vers la racine nerveuse auditive et doucement dans la surface du tissu. Déplacez le champ de vision vers le noyau ventral du corps trapézoïde sur le côté mince et sélectionnez un neurone olivocochléaire médial comme cible pour l’électrophysiologie de pince de correction sous épifluorescence utilisant un filtre d’émission de nanomètre de 561. Remplissez une pipette d’enregistrement avec la solution interne appropriée pour l’expérience proposée et sous patch optique DIC et enregistrez à partir du neurone olivocochléaire médial dans la configuration de l’ensemble des cellules.Ajustez l’amplitude de stimulation électrique de la racine auditive de nerf pour obtenir des événements postsynaptiques cohérents dans le neurone olivocochléaire médial. Ensuite, exécutez des protocoles de stimulation appropriés pour observer les courants synaptiques évoqués dans les neurones olivocochléaires médiaux. Cette préparation de tranche compensée est conçue pour contenir la racine nerveuse auditive et le noyau cochléaire contralatéral aux neurones olivocochléaires médiaux ciblés pour les enregistrements.Dans cette tranche de coin resectionnée tachée de violette crésyle, le noyau cochléaire est présent dans presque toute son étendue rostrale-caudale. Et la racine nerveuse auditive est observée entrant dans le noyau cochléaire. En outre, la tranche compensée contient des neurones du noyau médial du corps trapézoïde ipsilateral aux neurones olivocochléaires médiaux à partir de laquelle les enregistrements sont effectués.Pour confirmer la connectivité neuronale dans une tranche compensée, les entrées présynaptiques sont stimulées de deux façons. Tout d’abord, la strie acoustique ventrale à la ligne médiane est stimulée électriquement, activant directement les axones t-stellate et le noyau médial des neurones du corps trapézoïde par stimulation globulaire de l’axone des cellules touffue et entraînant des courants postsynaptiques qui sont mesurés au neurone olivocochléaire médial. La racine auditive de nerf est alors stimulée pour activer les circuits ascendants entiers de tronc cérébral monaural et pour évoquer des réponses postsynaptiques.La comparaison des mesures de latence de début du premier courant postsynaptique évoqué avec la stimulation directe de la stria acoustique ventrale avec ceux évoqués avec la stimulation auditive de nerf indique une latence sensiblement plus longue dans l’événement auditif de stimulation de nerf, indicatif du retard synapse synapse cochléaire additionnel de noyau activé pendant la stimulation auditive de nerf. L’utilisation de repères anatomiques et la manœuvre minutieuse de l’étape du disque magnétique sont essentielles pour créer des tranches compensées avec des circuits neuronaux intacts et des réponses post synaptiques fiables évoquées. Cette technique de tranchage fournit une plate-forme pour l’utilisation d’outils supplémentaires d’électrophysiologie in vitro, y compris l’imagerie par calcium ou tension, optogénétique, neurotransmetteur décaging, et à la fois intracellulaire et extracellulaire pharmacologie.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Le modèle organotypiques d&#39;hippocampe Culture Slice d&#39;examen des lésions neuronales

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Tranche de cerveau Biotinylation: Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche de Mesure région spécifique membrane de protéines plasmatiques traite des adultes neurones

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...